Наиболее примитивными из существующих в настоящее время позвоночных с парными придатками являются chondrichthyans (хрящевые рыбы) , которые занимают специальное место в нашем понимании эволюции.Соответственно, анализ молекулярных путей, регулирующих развитие плавников у chondrichthyan может объяснить наше понимание того, как осуществляется генетическое формирование паттерна конечностей тетрапод. Первоначальные исследования на chondrichthyans привели к парадоксу: один из фундаментальных сигнальных путей, контролирующий развитие конечностей тетрапод, по-видимому, не играет роли в формировании паттерна плавников у chondrichthyan1. Как у тетрапод, так и teleosts (субкласс костистых рыб), Sonic hedgehog (Shh) является основным вышестоящим фактором в развитии, регулирующим выросты конечностей и формирование передне-заднего паттерна скелета^2-5. В обоих таксонах экспрессия Shh ограничивается задней частью мезодермы, а у тетрапод он специфицирует как количество формируемых скелетных элементов , так и их качественные особенности^2-5. Экзогенная ретиноевая кислота может индуцировать эктопическую экспрессию Shh в передней части, что приводит к зеркальным скелетным удвоениям у тетрапод^2,4-6. Кроме того, ортологи ДНК регуляторных элементов, контролирующих специфичную для придатков экспрессию Shh являются общими у teleost рыб и тетрапод^7-10. Chondrichthyans, , однако, лишены экспрессии в зачатках плавников Shh и специфичных для придатков регуляторных элементов^1,9, это говорит о том, что Shh-зависимое формирование передне-заднего паттерна являетс яновшеством у костистых рыб (osteichthyans). Было предположено, что Shh первобытно функционирует, чтобы высвободть парные плавники из стенки тела у общего предшественника для ray-finned рыб и lobe-finned рыб (включая тетрапод)¹. Затем Shh находит свою роль в формировании передне-заднего паттерна придатков.

Мы исследовали повторно эти находки путем скрининга генома chondrichthyan в отношении Shh appendage-specific regulatory elements (ShAREs). Удивительно, но были нацдены ортологи элементов у всех проанализированных chondrichthyan видов, включая chimaeras, акул, скатов и rays (Supplementary Fig. 1). Chondrichthyan ShAREs обнаруживают высокую степень консервации последовательностей с ортолагами ray-finned рыб и тетрапод, и вбло установлено, что они занимают аналогиченые геномные позиции в интроне 5 гена Lmbr¹⁸. Сохранение chondrichthyan ShARE последовтельностей и позиции в геноме строго указывает на функциональную консервацию в регуляции экспрессии Shh во время развития плавников; соотв., Shh ортологи от ската (Raja erinacea) и акул (Chiloscyllium punctatum) были выделены и подтверждена экспрессия в зачатках плавников (анализ филогенетических последовательностей представлен в Supplementary Data).

Как и ожидалось из анализа энхансера, Shh экспрессируется в задней части мезодермы зачатков плавников у chondrichthyan, но наблюдаются важные пространственные и временные различия с зачатками конечностей тетрапод. В согласии с описанными данными1, зачатки парных плавников скатов не экспрессируют Shh во время ранних стадий после образования зачатков (ст. 25–28, as per ref. 11; data not shown), в то время как сильная экспрессия выявляется в донной пластинке, вентролатеральной части нервной трубки, хорде и сомитах (Fig. 1k). На ст. 29/30, вслед за ранее исследованными1, выявляется рельефный задний край экспрессии Shh в обоих наборах парных прдатков (Fig. 1a, b), но экспрессия никогда не обнаруживлась в передней части мезодермы. Кроме того, Shh слабо экспрессируется в дистальной части мезодермы, располоенной ниже апикальной эктодермы, а сильная экспрессия обнаруживается в проксимо-дистально ориентированном пучке мышц вдоль всей передне-задней оси (Fig. 1a, b). Экспресисия в задней и дистальной частях Shh гаснет на поздней стадии 30 в грудных плавниках, ноsexually диморфная экспрессия Shh сохраняется у самцов вдоль задней границы брюшного плавника в тевение ещё 2–3 недель ( течение ст. 32) в развивающихся intermittent clasper органах (Fig. 1g, h). Экспрессия Shh мишени, гена Ptc2 (ref. 12), непосредственно отражает пространственный и временной домены экспрессии Shh expression в зачатках парных плавников (Fig. 1i, j); Ihh ската ко-экспрессируется с Shh в зачатках мышц, но асимметричная экспрессия никогда не обнаруживается в задней или передней мезодерме (data not shown). Зачаток непарного дорсального плавника сходным образом экспрессируют Shh в дорсальной и дистальной частях мезодермы, но, что курьезно, транскрипты Shh обнаруживаются также в передней части мезодермы (Fig. 1c). Однако, мы заметили, что передняя экспрессияr Shh в зачатке дорсального плавника, по-видимому, происзводное состояние у скатов, т.к. у акул зачаток дорсальных плавников экспрессирует Shh исключительно в задней и дорсальной частях мезодермы и зачатках мышц (Fig. 1l).

Затем мы продемонстрировали, что регуляция ретиноевой кислотой экспрессии Shh законсервирована в зачатках плавников у chondrichthyan. In ovo воздействие ретиноевой кислотой, то на ст. 25–27 эмбрионы всегда имеют в результате измененную экспрессию Shh в парных зачатках плавников у скатов: обычная в заденй и дорсальных частях экспрессия Shhстрого регулируется позитивно, наблюдается эктопическая передняя экспрессия и экспрессия Shh несоответственно поддерживается на ст. 31 (Fig. 1d, e). Пространственные домены Shh не меняются в зачатках дорсальных плавников, но экспрессия усиливается (Fig. 1f). Мы установили, что ретиноевой кислотой обеспечиваемая регуляция экспрессии Shh также законсервирована у основной ray-finned рыбы Polyodon spathula, с эктопической экспрессией Shh, обнаруживаемой в переденей чести мезодермы зачатков плавников у эмбрионов, обработанных ретиноевой кислотой помимо обычного заднего домена (Fig. 1m, n). В комбинации с предыдущими исследованиями на рыбках данио^3-5, нашим данные показывают, что регуляция экспрессии Shh с помощью ретиноевой кислоты является , по-видимому, примитивным состоянием для всех парных придатков позвоночных.

Ретиноевая кислота изменяет паттерны скелета придатков у скатов способом, согласующимся с эктопической экспрессиией Shh, классическая фенотипическая реакция ранее не была продемонстрирована у каких-либо не-тетрапод (Fig. 2). Наиболее поразительным оказалось то, что обнаруживаются сходные с тетраподами зеркальные удвоения дорсальных плавников, обработанных на ст. 27/28; эктопический metapterygium (обычный наиболее задний элемент ) формируется вдоль переднего —также как и заднего — края плавника с с ветвленем радиусов медиально от обоих (Fig. 2b, f, j, n). В грудных плавниках ретиноевая кислота вызывает делецию передних регионовв, которые могут соотвествовать почти половине плавника, и posteriorizes качественные характеристики скелетных элементов, формирующихся вдоль затронутого переднего края плавника (Fig. 2g, k, o). Особенно, повторяющиеся сегментированные, линейные палочки (rod), представляющие обычную переднюю границу скелета плавника (propterygium) трансформируются в серию раздвоенных хрящевых блоков, типичных для нормальной морфологии metapterygial вдоль заднего края (compare Fig. 3a–c). Обработанный ретиноевой кислотой брюшной плавник обнаруживает сходную трансформировнную морфологию (Fig. 2d, h, l, p).

Способность ретиноевой кислоты вызывать дозово- и стадио-зависимые эфекты на скелетный паттерн6 также законсервирована у скатов. Повышающиеся дозы вызывают всё более тяжелую потерю передних областей и все более выраженную постериоризацию propterygial хрящей (Fig. 2a–p). Ранне воздействие на стадиях до образования плавников (стадии ниже 22) индуцирует формирование грудных плавников вентральнее по отношению к нормальным грудным плавникам, как это наблюдалось и у рыбок данио13, и постериризует морфологию переденей части плечевого пояса (Fig. 2q, s; Fig. 3g–j). Воздействие на более поздних стадиях (ст. 30/31) приводит к снижению таяжести набора дефектов, указывая тем самым на прогрессивную детерминацию скелетного паттерна во время изученных стадий (Fig. 2u–x). Наконец, увеличение дозы ретиноевой кислоты увеличивает количество формируемых эктопических лучей (radials) в межрадиальных пространствах парных плавников (Fig. 3d–f), что коррелирует с усилением активности Shh в дистальной части мезодермы (Fig. 1d, e).

Наши находки, что Shh экспрессируется в задней части мезодермы плавников ската, подтверждают функциональный параллелизм с зачатками конечностей терапод, где экспрессия Shh инициируется, сопутствуя образованию зачатков и контролю как формирования скелетных элементов, так качественных особенностей вдоль всей передне-задней оси^2,14,15. Однако, задержанное начало экспрессии Shh у ската (7–10 день после образования зачатка) говроти против его роли в глобальной регуляции передне-задней полярности, но подтверждает более позднюю роль в формировании скелетного паттерна элементов. ограниченных задними частями. Фактические размеры на ст. 29/30 зачатков плавников у скатов подтверждают эту гипотезу; экспрессия Shh ограничивается задними 10 из более чем в 3,000 mum длиной зачатков грудного плавника (в несколько раз шире зачатков коневчностей у тетрапод) это делает мало вероятным, что белок SHH может существенно диффундировать, чтобы регулировать формирование паттерна любого, кроме наиболее проксимально формируюмых скелетных элементов (see ref. 16).

Скелетные изменения указывают на то, что индуцированные в передних частях грудных плавников скатов на стадии 31 имплантации смоченных SHH кусочков, еще больше подтверждают гипотезу. Более того, SHH эффекты оказались пространственно ограниченными, затрагивающими только немногие лучи на обеих сторонах от кусочков (Fig. 3k, l). SHH респецифицирует полярность фланкирующих лучей плавника, перенаправляя все разветвления хрящей прочь от источника SHH и тем самым воспроизводя свойства, которые присущи зоне поляризующей активности тетрапод¹⁷. Наконец SHH индуцирует образование дополнитеьных лучей во фланкирующих межрадиальных пространствах , это согласуется с ранне обнаруженной корреляцией между образованием эктопических лучей и обусловленной ретиноевой кислотой эктопической экспрессией Shh (compare Fig. 1d, e to Fig. 3d–f). Т.о., в комбинации с нашими предыдущими данными мы выявляем законсервированные и новые роли для передачи сигналов Shh в формировании паттерна зачатков плавников у chondrichthyan fin, которые согласуются с филогенетической позицией и уникальной морфологией плавников скатов .

Наше исследование строго подтверждает мнение, что фундаментальный механизм, контролирующий формирование передне-заднего паттерна придатков использует регулируемую передачу сигналов Shh, и является глубоко законсервированным у gnathostomes (see Supplementary Fig. 3). Мы также показали, что различия во временных и пространственных доменах экспрессии Shh в плавниках скатов по сравнению с таковоыми в коненостях тетрапод прекрасно коррелируют с морфологическим многообразием этих структур. Поэтому мы полагаем. что регуляторные изменения в передаче сигналов Shh могут служить важным потенциальным источником для генерации морфологического разнообразия, в дополнение к эволюции нижестоящих чувствительных к Shh сетям генов. Chondrichthyans д.быть информативным компонентом для будущего сравнительного анализа развития и эволюции придатков и в качестве наиболее базового состояния для существющих сейчас позвоночных с конечностями и особенно важны для разрешения первичных генетических circuitry, которые формируются, чтобы сформировать паттерн самых ранних плавников.