Способ Интерпретации Клетками

Morphogen gradient interpretation by a regulated trafficking step during ligand-receptor transduction J.Jullien, J.Gurdon Genes and Dev. - 2005. - V.19. No 22, P.2682-2694
Клетки нуждаются в корректной интерпретации концентраций морфогена, когда морфоген уже не присутствует во внеклеточной среде. Эта память о воздействии морфогена необходима для правильного предопределения судьбы клеток. Полученные данные демонстрируют ранее не распознанную ступень в интерпретации морфогена - временную остановку, которая останавливает дальнейший прогресс лиганд-рецептор комплекса между интернализацией и лизосомной деструкцией. Передача сигналов продолжается во время этой остановки, что составляет основу памяти о концентрации морфогена. Показано, что продолжительная передачи сигналов необходима для Dynamin-зависимой интернализации комплекса. Rab5QL- и Rab7QL-обусловленное увеличение скорости эндо-лизосомной прогрессии не влияет на память. Напротив, память исчезает при увеличении доставки рецепторов в лизосомы за счет экспрессии Smad7/Smurf2 ubiquitin лигазы. Предполагается, что основой памяти является долго действующее нахождение сигнального комплекса в эндо-лизосомном пути. Регулирование продолжительности этой ступени помогает детерминировать выбор экспрессируемых генов, лежащий в основе интерпретации градиента. Рис.1. \| Memory of activin concentration requires continuing serine–threonine kinase activity. Рис.2. \| Type 1 and type II activin receptors traffic together from the plasma membrane to the endosomes of animal cap cells during the period of activin exposure memory. Рис.3. \| Dynamin-dependent internalization of activin receptors is necessary for gene induction in response to activin. Рис.4. \| Activin internalization is necessary for gene induction in response to activin. Рис.5. \| Receptor endocytic trafficking and cellular memory of activin exposure. Рис.6. \| Endocytic trafficking and formation of an activin gradient. Рис.7. \| Model of memory complex signaling during morphogen gradient interpretation.	Одиночное сигнальное событие может генерировать несколько разных клеточных судеб в их правильном пространственном взаимоотношении. Это происходит потому. что клетки могут считывать свою позицию во внеклеточном градиенте молекул морфогена [Gurdon, Bourillot, 2001]. Как клетки интерпретируют свою позицию в концентрационном градиенте не совсем ясно. Важно понять, что предопределяет то, как долго клетка сохраняет одну и ту же реакцию. Главным ответом клетки на морфоген является, насколько известно, активация нижестоящих генов, обычно кодирующих транскрипционные факторы. Благодаря концентрации морфогена вокруг, клетка д. изменяться с момента времени, когда стартует сигнальный процесс, важно чтобы клетки продолжала сохранять один и тот же ответ достаточно долго, чтобы одна реакция на морфоген превалировала над др., зависимыми от концентрации ответами, которые может осуществлять та же самая клетка. Простейшим механизмом предопределения продолжительности реакции на морфоген является для клетки изменение её реакции непрерывно в непосредственной пропорции на концентрацию внеклеточного морфогена. Но мы знаем, что этого не происходит. В случае activin клетки запускают свою реакцию как только концентрация морфогена увеличивается, но если эта концентрация снижается, то клетка запоминает на насколько часов наивысшую концентрацию, действию которой подверглась [Dyson, Gurdon, 1998]. Эта память гарантирует, что клетка будет иметь одну и ту же реакцию на концентрацию достаточно долго, чтобы достичь одного определенного исхода и в конечном итоге детерминировать судьбу клетки. У эмбрионов такая память о морфогене, по-видимому, существенная часть интерпретации морфогенетического градиента. Время, в течение которого клетки воспринимают эффективную концентрацию морфогена, и время, в течение которого клетки активируют нижестоящие гены, может быть, в самом деле, разделено несколькими часами. Напр., мРНК activin впервые выявляется в эмбрионе на ст. 8-9, когда впервые обнаруживается и фосфорилирование Smad2 [Lee et al., 2001; Schohl,Fagott 2002; Piepenburg et al., 2004]. Несмотря на это строгая транскрипция Xbra, индуцированная activin, появляется только на ст. 10-10.5, т.е. 4-4 ч спустя [Dyson,Gurdon,1988; Bourillot et al., 2002; Piepenburg et al., 2004]. Существование такой памяти в интерпретации градиента морфогена продемонстрировано так же на мышах, клетки которых в зачатке конечности нуждаются в запоминании воздействия Shh, чтобы правильно изменить свою судьбу позднее [Harfe et al., 2004]. Базовая последовательность событий передачи сигналов TGF-β впервые была установлена в культивируемых клетках (Shi, Massague, 2003). Во время передачи сигналов activin внеклеточный лиганд сначала соединяется со своим типа II рецептором, что позволяет типа I рецептору присоединиться к комплексу. Типа II рецептор фосфорилирует типа I рецептор, который в свою очередь фосфорилирует Smad2 и он ассоциирует с Smad4, чтобы вступить в ядро и активировать промотор нижестоящих генов. В таких культивируемых клетках TGFβ рецепторы интернализуются лиганд независимым способом (Ehrlich et al., 2001; Di Guglielmo et al., 2003). Активация Smad2, по-видимому, осуществляется в основном внутри клетки, на уровне эндосом, где акцессорные белки, такие как SARA или cPML, способствуют ассоциации Smad2 с TGFβ рецепторами (Hayes et al., 2002; Di Guglielmo et al., 2003; Lin et al., 2004). Неизвестно, существует ли память о воздействии TGFβ в культивруемых клетках. Доступные данные указывают на то, что после как непрерывного, так и пульсового воздействия на культивируемые клетки TGFβ уровень фосфорилированного Smad2 достигает пика между 0.5 и 1 ч после добавления лиганда и затем снижается (Lo, Massague, 1999; Di Guglielmo et al., 2003). Это подтверждает, что культивируемые клетки не обнаруживают памяти о воздействии лиганда, характерной для эмбриональных клеток. Предварительные исследования с воздействием activin на эмбриональные клетки Xenopus laevis установили следующее (Dyson,Gurdon, 1998; Bourillot et al., 2002). Во-первых, ~50% молекул activin соединяются с клетками анимальной шапочки, оставаясь ассоциированными с клетками, по крайней мере, 5 ч. Во-вторых, фосфорилирование и транслокация в ядро Smad2, внутриклеточная трансдукци молекул активина продолжается, по крайней мере, 4 ч после 10-мин пульсового воздействия activin. В-третьих, пул активированных Smad2, формируемый во время воздействия activin не является достаточно стабильным, чтобы объяснить память, т.к. этот инициальный пул деградирует с 1 ч полу-жизни. В-четвертых, память зависит от продолжающейся активности серин/треониновой киназы. Механизм, с помощью которого память о воздействии activin сохраняется в течение определеного количества времени в эмбриональных клетках Xenopus laevis, неизвестен. Здесь мы проследили внутриклеточную судьбу лиганд/рецептор комплекса и показали, что критической ступенью в детерминации продолжительности передачи сигналов является время, проведенное этим комплексом в эндо-лизосомном пути эмбриональных клеток. Эндоцитоз необходим для генерации сигнальных комплексов, в то время как задержка поставки в лизосомы гарантирует сохранение передачи сигналов такими интернализованными комплексами. Наши результаты позволяют предложить концепцию регуляторной ступени на пути реакции на внутриклеточный морфоген. Они также позволяют механистическое понимание того, как память о концентрации морфогена выбирает специфический генный ответ. Discussion An internalized receptor-ligand comlex for prolonged signaling В клеточных линиях роль интернализации рецепторов в TGFβ сигнальной трансдукции неясна. Существующие противоречия исходят из того факта, что клеточные линии не могут быть тестированы в отношении зависимых от концентрации реакций на TGFβ лиганды. По нашим данным происходит полное устранение генной индукции в ответ на activin, если интернализация рецепторов нарушена в клетках эмбрионов Xenopus laevis. Это указывает на то, что эффективная передача сигналов происходит только когда рецепторы накапливаются внутри клетки, в эндосомном компартменте, где мы обнаруживаем интернализованные рецепторы. Возможно, что Smad2, как и в клеточных линиях, доставляется в эндосомы посредством адапторного белка, такого как SARA, вследствие чего усливалется передача сигналов из этого компартмента (Tsukazaki et al., 1998]. Но тот факт, что activin сам по себе тоже должен интернализоваться для правильной передачи сигналов, говорит о том, что локализация лиганда в эндосомы также необходима для вышестоящей ступени активации передачи сигналов от Smad2. Возможно, что эндосомы также создают пригодную среду для активации ActRIB за счет activin-ActRII комплекса. Передача сигналов с помощью др. секретируемых факторов, таких как nerve growth factor (NGF), также обнаруживает потребность в интернализации как рецептора, так и лиганда (Kuruvilla et al., 2004]. Dj время развития периферической нервной системы NGF оказывается на кончиках аксонов и способствует выживанию клеточных тел, расположенных на расстоянии в несколько клеточных диаметров. Эта ситуация представляет собой др. пример, в котором необходима память. Информация, высвобождаемая на кончиках аксонов, запоминается для транспорта в тело клетки. Это происходит за счет продукции постоянно активного NGF/NGF рецепторного комплекса, который всё ещё способен передавать сигнал после ретроградного транспорта в тело клетки. Этот механизм памяти о воздействии лиганда может быть использован в разных ситуациях в развитии, в которых воздействие лиганда и эффективная передача сигналов в клеточное ядро разделены во времени и/или пространстве. Мы полагаем. что интернализация лиганда является способом стабилизации взаимодействия лиганд-рецептор путем предупреждения потери лиганда во внеклеточной среде. Наши данные сравнимы с моделью, в которой память базируется на активном комплексе из activin и его типа I и II рецепторов. Наблюдение с помощью конфокального анализа тесной ассоциации происходящих с клеточной поверхности ActRIB и ActRII хорошо согласуется с этим предположением. Memory of activin exposure is determined by kinetics of activin receptor endo-lysosomal trafficking Процесс, с помощью которого морфогенетический градиент интерпретируется эмбриональными клетками в случае activin следующий. Всё увеличивающееся количество рецепторов связывается по мере добавления внеклеточного лиганда. Устойчивое состояние концентрации активированных Smad2 в ядре пропорционально максимальному количеству с лигандами связанных рецепторов (Bourillot et al. 2002). Мы установили, что это количество активированных рецепторов сохраняется несколько часов даже, когда внутриклеточный лиганд уменьшается. Выбор активации нижестоящего гена, а следовательно, и детерминация судьбы клетки предопределляется не только наивысшим достигнутым уровнем оккупации рецепторов, но и что важно продолжительностью времени, в течение которого этот уровень передачи сигналов персистирует (память). Это потому, что короткий период экспрессии какого-либо типа гена не дает достаточное количество генного продукта, чтобы предопределить какую-либо клеточную судьбу. Полученные результаты показывают, что продолжительность времени, в течение которого определенной силы сигнал персистирует, зависит от времени, проведенного ligand/receptor memory комплексом в endo-lysosomal пути клетки. Это то, что поддерживает внутриклеточную концентрацию активного Smad2 на наивысшем уровне и это, следовательно, детерминирует выбор клеточной судьбы как результат интерпретации градиента. Работа Di Gugiielmo et al. (2003) подтверждает гипотезу, что эндсомы являются основным сигнальным компартментом для TGFβ рецепторов. Предлагаемое объяснение для увеличения сигнальной способности рецепторов в этом компартменте является то, что они защищены от деградации. Это наблюдение согласуется с наблюдаемой стабильностью комплекса памяти, отмеченное в данном исследовании. Di Gugiielmo et al. также представили доказательства, что деградация рецепторов требует вступления на др. путь трафика, использующий smad7/Smurf2 комплекс. Модель предполагает, что в клеточных линиях состояния, в которых рецепторы ступают на один из двух путей trafficking (сигнальные эндосомы или путь деградации)на уровне плазматических мембран. Т.к. мы не наблюдали интернализованных рецепторов, отправляемых обратно в плазматическую мембрану, то мы предположили, что этот переход от передачи сигналов на путь деградации происходит внутриклеточно, возможно на уровне мультивезикулярных телец (see Fig. 7 and below). Наши результаты расширяют заключения работ на клеточных линиях до событий, которые происходят, когда нормальные эмбрионы принимают решения по судьбам клеток. Согласно нашей модели стабильность сигнального комплекса является критической для интерпретации концентрации морфогена. Figure 7A суммирует разные уровни, на которых количества сигнальных комплексов регулируются в клетке. Тест памяти позволяет нам генерировать пул рецепторов, движущихся синхронно по лизосомному пути. Только те лиганд-рецептор комплексы, которые активно передают сигнал, когда клетка компетентна, чтобы транскрибировать гены, детерминирующие финальную судьбу клеток. Это исключает активированные рецепторы на плазматической мембране во внутренние пузырьки MVBs (see Fig. 7B). Т.о., модификации в продукции (интернализации) или удалении (отправление в лизосомы) сигнальных рецепторов с эндосомного пути, могут вмешиваться в ряд комплексов, эффективно передающих сигналы в клетках во время принятия клеткой судьбоносных решений (Fig. 7A). Наблюдаемая стабильность сигнальных комплексов указывает на то, что клетки интерпретируют морфогенетический градиент путем интеграции всех сигналов, которые они получили перед детерминацией клеточной судьбы скорее, чем путем реакции на самую последнюю концентрацию морфогенетического градиента вокруг них. Накопление сигнальных комплексов затем предопределяет стабильное накопление активированных Smad2 в ядре, что д. в свою очередь, детерминировать реакцию транскрипции соотв. генов (Dyson and Gur-don 1998; Bourillot et al. 2002). Наши результаты показывают, что стабильность комплекса памяти обычно достигается за счет задержки отправления рецепторов в лизосомы. Эта ступень регулирует и идентифицирует новый уровень интерпретации градиента морфогена. Механистически это позволяет объяснить длительную память о воздействии морфогенетического морфогена. Участие endo-lysosomal пути в регуляции интерпретации морфогена недавно подтверждено на рыбках данио, где белок dpr2, как было показано, регулирует передачу сигналов nodalу эмбрионов (Zhang et al. 2004). В культивируемых клетках этот белок локализуется в лизосомах и снижает стабильность TGFβ рецептора ALK5. Receptor endocytic trafficking is not involved in activin gradient formation Столь же важно для механизма формирования паттерна с помощью морфогена форма и протяженность морфогенетического градиента. В крыльях Drosophila , как полагают, морфогенетические градиенты возникают с помощью серии раундов эндоцитоза/экзоцитоза морфогена (transcytosis) (Entchev et al. 2000; Dubois et al. 2001; Seto et al. 2002; Zhu and Scott 2004). В предыдущем исследовании на Xenopus было показано, что морфогенетические градиенты формируются за счет простой внеклеточной диффузии в этой системе (Jones et al. 1996; McDowell et al. 1997). Это заключение частично базировалось на способности TGFβ фактора пересекать слой, лишенный TGFβ рецепторов. У эмбрионов наиболее вероятно, что морфогенетический градиент формируется на всем протяжении ткани из чувствительных клеток. Мы расширили ранее проведенный анализ путем сравнения распределения градиента в нормальной и дефицитной по интернализации чувствительной ткани. Наши данные показали, что распределение градиента не зависит от статуса эндоцитотического пути. Распространение морфогена с помощью трансцитоза, наблюдаемого у Drosophila, не происходит у Xenopus. Это хорошо коррелирует с тем фактом, что мы не наблюдаем возвращения activin рецепторов в плазматическую мембрану после своей интернализации, это подтверждает, что трансцитоз не происходит в клетках анимальной шапочки (Fig. 2). У Drosophila был предположен транспорт морфогена с помощью длинных клеточных отростков, связывающих источник с воспринимающими клетками (cytonemes) (Ramirez-Weber and Romberg 1999). Этот процесс также вряд ли происходит в тканях Xenopus, как в обоих наших 3D и 2D тестах с использованием нарушений связей между клеточными слоями. Др. возможным объяснением дальнодействующей передачи сигналов activin через ткань может быть механизм, с помощью которого activin достигает воспринимающих клеток, локализованных только на небольшом расстоянии от источника. Дальнейшее распространение д. в этом случае происходить путем секреции activin этими стимулированными воспринимающими клетками. В предыдущей работе было показано, что клетки, экспрессирующие постоянно активные типа I рецепторы, не секретируют факторы, индуцирующих мезодерму (Jones et al. 1996). Это наблюдение указывает на то, что имеющие отношение к делу механизмы вряд ли участвуют в дально-действующей передаче сигналов activin, но не исключают механизма, который является ActRI независимым. Наши результаты с использованием Follistatin или супернатанта клеточных культур показали, что клетки, воспринимающие активин, вряд ли секретируют какие-либо факторы, индуцирующие мезодерму. Более того, дальнодействующая передача сигналов activin нуждается в функциональном ActRlI в воспринимающих клетках (McDowell et al. 1997). Всё это строго подтверждает аргумент против механизма распространения градиента морфогена и интерпретации у ранних эмбрионов Xenopus.

Одиночное сигнальное событие может генерировать несколько разных клеточных судеб в их правильном пространственном взаимоотношении. Это происходит потому. что клетки могут считывать свою позицию во внеклеточном градиенте молекул морфогена [Gurdon, Bourillot, 2001]. Как клетки интерпретируют свою позицию в концентрационном градиенте не совсем ясно. Важно понять, что предопределяет то, как долго клетка сохраняет одну и ту же реакцию. Главным ответом клетки на морфоген является, насколько известно, активация нижестоящих генов, обычно кодирующих транскрипционные факторы. Благодаря концентрации морфогена вокруг, клетка д. изменяться с момента времени, когда стартует сигнальный процесс, важно чтобы клетки продолжала сохранять один и тот же ответ достаточно долго, чтобы одна реакция на морфоген превалировала над др., зависимыми от концентрации ответами, которые может осуществлять та же самая клетка.

Простейшим механизмом предопределения продолжительности реакции на морфоген является для клетки изменение её реакции непрерывно в непосредственной пропорции на концентрацию внеклеточного морфогена. Но мы знаем, что этого не происходит. В случае activin клетки запускают свою реакцию как только концентрация морфогена увеличивается, но если эта концентрация снижается, то клетка запоминает на насколько часов наивысшую концентрацию, действию которой подверглась [Dyson, Gurdon, 1998]. Эта память гарантирует, что клетка будет иметь одну и ту же реакцию на концентрацию достаточно долго, чтобы достичь одного определенного исхода и в конечном итоге детерминировать судьбу клетки. У эмбрионов такая память о морфогене, по-видимому, существенная часть интерпретации морфогенетического градиента. Время, в течение которого клетки воспринимают эффективную концентрацию морфогена, и время, в течение которого клетки активируют нижестоящие гены, может быть, в самом деле, разделено несколькими часами. Напр., мРНК activin впервые выявляется в эмбрионе на ст. 8-9, когда впервые обнаруживается и фосфорилирование Smad2 [Lee et al., 2001; Schohl,Fagott 2002; Piepenburg et al., 2004]. Несмотря на это строгая транскрипция Xbra, индуцированная activin, появляется только на ст. 10-10.5, т.е. 4-4 ч спустя [Dyson,Gurdon,1988; Bourillot et al., 2002; Piepenburg et al., 2004]. Существование такой памяти в интерпретации градиента морфогена продемонстрировано так же на мышах, клетки которых в зачатке конечности нуждаются в запоминании воздействия Shh, чтобы правильно изменить свою судьбу позднее [Harfe et al., 2004].

Базовая последовательность событий передачи сигналов TGF-β впервые была установлена в культивируемых клетках (Shi, Massague, 2003). Во время передачи сигналов activin внеклеточный лиганд сначала соединяется со своим типа II рецептором, что позволяет типа I рецептору присоединиться к комплексу. Типа II рецептор фосфорилирует типа I рецептор, который в свою очередь фосфорилирует Smad2 и он ассоциирует с Smad4, чтобы вступить в ядро и активировать промотор нижестоящих генов. В таких культивируемых клетках TGFβ рецепторы интернализуются лиганд независимым способом (Ehrlich et al., 2001; Di Guglielmo et al., 2003). Активация Smad2, по-видимому, осуществляется в основном внутри клетки, на уровне эндосом, где акцессорные белки, такие как SARA или cPML, способствуют ассоциации Smad2 с TGFβ рецепторами (Hayes et al., 2002; Di Guglielmo et al., 2003; Lin et al., 2004). Неизвестно, существует ли память о воздействии TGFβ в культивруемых клетках. Доступные данные указывают на то, что после как непрерывного, так и пульсового воздействия на культивируемые клетки TGFβ уровень фосфорилированного Smad2 достигает пика между 0.5 и 1 ч после добавления лиганда и затем снижается (Lo, Massague, 1999; Di Guglielmo et al., 2003). Это подтверждает, что культивируемые клетки не обнаруживают памяти о воздействии лиганда, характерной для эмбриональных клеток.

Предварительные исследования с воздействием activin на эмбриональные клетки Xenopus laevis установили следующее (Dyson,Gurdon, 1998; Bourillot et al., 2002). Во-первых, ~50% молекул activin соединяются с клетками анимальной шапочки, оставаясь ассоциированными с клетками, по крайней мере, 5 ч. Во-вторых, фосфорилирование и транслокация в ядро Smad2, внутриклеточная трансдукци молекул активина продолжается, по крайней мере, 4 ч после 10-мин пульсового воздействия activin. В-третьих, пул активированных Smad2, формируемый во время воздействия activin не является достаточно стабильным, чтобы объяснить память, т.к. этот инициальный пул деградирует с 1 ч полу-жизни. В-четвертых, память зависит от продолжающейся активности серин/треониновой киназы.

Механизм, с помощью которого память о воздействии activin сохраняется в течение определеного количества времени в эмбриональных клетках Xenopus laevis, неизвестен. Здесь мы проследили внутриклеточную судьбу лиганд/рецептор комплекса и показали, что критической ступенью в детерминации продолжительности передачи сигналов является время, проведенное этим комплексом в эндо-лизосомном пути эмбриональных клеток. Эндоцитоз необходим для генерации сигнальных комплексов, в то время как задержка поставки в лизосомы гарантирует сохранение передачи сигналов такими интернализованными комплексами. Наши результаты позволяют предложить концепцию регуляторной ступени на пути реакции на внутриклеточный морфоген. Они также позволяют механистическое понимание того, как память о концентрации морфогена выбирает специфический генный ответ.

Discussion

An internalized receptor-ligand comlex for prolonged signaling

В клеточных линиях роль интернализации рецепторов в TGFβ сигнальной трансдукции неясна. Существующие противоречия исходят из того факта, что клеточные линии не могут быть тестированы в отношении зависимых от концентрации реакций на TGFβ лиганды. По нашим данным происходит полное устранение генной индукции в ответ на activin, если интернализация рецепторов нарушена в клетках эмбрионов Xenopus laevis. Это указывает на то, что эффективная передача сигналов происходит только когда рецепторы накапливаются внутри клетки, в эндосомном компартменте, где мы обнаруживаем интернализованные рецепторы. Возможно, что Smad2, как и в клеточных линиях, доставляется в эндосомы посредством адапторного белка, такого как SARA, вследствие чего усливалется передача сигналов из этого компартмента (Tsukazaki et al., 1998]. Но тот факт, что activin сам по себе тоже должен интернализоваться для правильной передачи сигналов, говорит о том, что локализация лиганда в эндосомы также необходима для вышестоящей ступени активации передачи сигналов от Smad2. Возможно, что эндосомы также создают пригодную среду для активации ActRIB за счет activin-ActRII комплекса.

Передача сигналов с помощью др. секретируемых факторов, таких как nerve growth factor (NGF), также обнаруживает потребность в интернализации как рецептора, так и лиганда (Kuruvilla et al., 2004]. Dj время развития периферической нервной системы NGF оказывается на кончиках аксонов и способствует выживанию клеточных тел, расположенных на расстоянии в несколько клеточных диаметров. Эта ситуация представляет собой др. пример, в котором необходима память. Информация, высвобождаемая на кончиках аксонов, запоминается для транспорта в тело клетки. Это происходит за счет продукции постоянно активного NGF/NGF рецепторного комплекса, который всё ещё способен передавать сигнал после ретроградного транспорта в тело клетки. Этот механизм памяти о воздействии лиганда может быть использован в разных ситуациях в развитии, в которых воздействие лиганда и эффективная передача сигналов в клеточное ядро разделены во времени и/или пространстве. Мы полагаем. что интернализация лиганда является способом стабилизации взаимодействия лиганд-рецептор путем предупреждения потери лиганда во внеклеточной среде.

Наши данные сравнимы с моделью, в которой память базируется на активном комплексе из activin и его типа I и II рецепторов. Наблюдение с помощью конфокального анализа тесной ассоциации происходящих с клеточной поверхности ActRIB и ActRII хорошо согласуется с этим предположением.

Memory of activin exposure is determined by kinetics of activin receptor endo-lysosomal trafficking

Процесс, с помощью которого морфогенетический градиент интерпретируется эмбриональными клетками в случае activin следующий. Всё увеличивающееся количество рецепторов связывается по мере добавления внеклеточного лиганда. Устойчивое состояние концентрации активированных Smad2 в ядре пропорционально максимальному количеству с лигандами связанных рецепторов (Bourillot et al. 2002). Мы установили, что это количество активированных рецепторов сохраняется несколько часов даже, когда внутриклеточный лиганд уменьшается. Выбор активации нижестоящего гена, а следовательно, и детерминация судьбы клетки предопределляется не только наивысшим достигнутым уровнем оккупации рецепторов, но и что важно продолжительностью времени, в течение которого этот уровень передачи сигналов персистирует (память). Это потому, что короткий период экспрессии какого-либо типа гена не дает достаточное количество генного продукта, чтобы предопределить какую-либо клеточную судьбу. Полученные результаты показывают, что продолжительность времени, в течение которого определенной силы сигнал персистирует, зависит от времени, проведенного ligand/receptor memory комплексом в endo-lysosomal пути клетки. Это то, что поддерживает внутриклеточную концентрацию активного Smad2 на наивысшем уровне и это, следовательно, детерминирует выбор клеточной судьбы как результат интерпретации градиента. Работа Di Gugiielmo et al. (2003) подтверждает гипотезу, что эндсомы являются основным сигнальным компартментом для TGFβ рецепторов. Предлагаемое объяснение для увеличения сигнальной способности рецепторов в этом компартменте является то, что они защищены от деградации. Это наблюдение согласуется с наблюдаемой стабильностью комплекса памяти, отмеченное в данном исследовании. Di Gugiielmo et al. также представили доказательства, что деградация рецепторов требует вступления на др. путь трафика, использующий smad7/Smurf2 комплекс. Модель предполагает, что в клеточных линиях состояния, в которых рецепторы ступают на один из двух путей trafficking (сигнальные эндосомы или путь деградации)на уровне плазматических мембран. Т.к. мы не наблюдали интернализованных рецепторов, отправляемых обратно в плазматическую мембрану, то мы предположили, что этот переход от передачи сигналов на путь деградации происходит внутриклеточно, возможно на уровне мультивезикулярных телец (see Fig. 7 and below). Наши результаты расширяют заключения работ на клеточных линиях до событий, которые происходят, когда нормальные эмбрионы принимают решения по судьбам клеток.

Согласно нашей модели стабильность сигнального комплекса является критической для интерпретации концентрации морфогена. Figure 7A суммирует разные уровни, на которых количества сигнальных комплексов регулируются в клетке. Тест памяти позволяет нам генерировать пул рецепторов, движущихся синхронно по лизосомному пути. Только те лиганд-рецептор комплексы, которые активно передают сигнал, когда клетка компетентна, чтобы транскрибировать гены, детерминирующие финальную судьбу клеток. Это исключает активированные рецепторы на плазматической мембране во внутренние пузырьки MVBs (see Fig. 7B). Т.о., модификации в продукции (интернализации) или удалении (отправление в лизосомы) сигнальных рецепторов с эндосомного пути, могут вмешиваться в ряд комплексов, эффективно передающих сигналы в клетках во время принятия клеткой судьбоносных решений (Fig. 7A). Наблюдаемая стабильность сигнальных комплексов указывает на то, что клетки интерпретируют морфогенетический градиент путем интеграции всех сигналов, которые они получили перед детерминацией клеточной судьбы скорее, чем путем реакции на самую последнюю концентрацию морфогенетического градиента вокруг них. Накопление сигнальных комплексов затем предопределяет стабильное накопление активированных Smad2 в ядре, что д. в свою очередь, детерминировать реакцию транскрипции соотв. генов (Dyson and Gur-don 1998; Bourillot et al. 2002).

Наши результаты показывают, что стабильность комплекса памяти обычно достигается за счет задержки отправления рецепторов в лизосомы. Эта ступень регулирует и идентифицирует новый уровень интерпретации градиента морфогена. Механистически это позволяет объяснить длительную память о воздействии морфогенетического морфогена. Участие endo-lysosomal пути в регуляции интерпретации морфогена недавно подтверждено на рыбках данио, где белок dpr2, как было показано, регулирует передачу сигналов nodalу эмбрионов (Zhang et al. 2004). В культивируемых клетках этот белок локализуется в лизосомах и снижает стабильность TGFβ рецептора ALK5.

Receptor endocytic trafficking is not involved in activin gradient formation

Столь же важно для механизма формирования паттерна с помощью морфогена форма и протяженность морфогенетического градиента. В крыльях Drosophila , как полагают, морфогенетические градиенты возникают с помощью серии раундов эндоцитоза/экзоцитоза морфогена (transcytosis) (Entchev et al. 2000; Dubois et al. 2001; Seto et al. 2002; Zhu and Scott 2004). В предыдущем исследовании на Xenopus было показано, что морфогенетические градиенты формируются за счет простой внеклеточной диффузии в этой системе (Jones et al. 1996; McDowell et al. 1997). Это заключение частично базировалось на способности TGFβ фактора пересекать слой, лишенный TGFβ рецепторов. У эмбрионов наиболее вероятно, что морфогенетический градиент формируется на всем протяжении ткани из чувствительных клеток. Мы расширили ранее проведенный анализ путем сравнения распределения градиента в нормальной и дефицитной по интернализации чувствительной ткани. Наши данные показали, что распределение градиента не зависит от статуса эндоцитотического пути. Распространение морфогена с помощью трансцитоза, наблюдаемого у Drosophila, не происходит у Xenopus. Это хорошо коррелирует с тем фактом, что мы не наблюдаем возвращения activin рецепторов в плазматическую мембрану после своей интернализации, это подтверждает, что трансцитоз не происходит в клетках анимальной шапочки (Fig. 2). У Drosophila был предположен транспорт морфогена с помощью длинных клеточных отростков, связывающих источник с воспринимающими клетками (cytonemes) (Ramirez-Weber and Romberg 1999). Этот процесс также вряд ли происходит в тканях Xenopus, как в обоих наших 3D и 2D тестах с использованием нарушений связей между клеточными слоями. Др. возможным объяснением дальнодействующей передачи сигналов activin через ткань может быть механизм, с помощью которого activin достигает воспринимающих клеток, локализованных только на небольшом расстоянии от источника. Дальнейшее распространение д. в этом случае происходить путем секреции activin этими стимулированными воспринимающими клетками. В предыдущей работе было показано, что клетки, экспрессирующие постоянно активные типа I рецепторы, не секретируют факторы, индуцирующих мезодерму (Jones et al. 1996). Это наблюдение указывает на то, что имеющие отношение к делу механизмы вряд ли участвуют в дально-действующей передаче сигналов activin, но не исключают механизма, который является ActRI независимым. Наши результаты с использованием Follistatin или супернатанта клеточных культур показали, что клетки, воспринимающие активин, вряд ли секретируют какие-либо факторы, индуцирующие мезодерму. Более того, дальнодействующая передача сигналов activin нуждается в функциональном ActRlI в воспринимающих клетках (McDowell et al. 1997). Всё это строго подтверждает аргумент против механизма распространения градиента морфогена и интерпретации у ранних эмбрионов Xenopus.

Morphogen gradient interpretation by a regulated trafficking step during ligand-receptor transduction J.Jullien, J.Gurdon Genes and Dev. - 2005. - V.19. No 22, P.2682-2694

Morphogen gradient interpretation by a regulated trafficking step during ligand-receptor transduction
J.Jullien, J.Gurdon
Genes and Dev. - 2005. - V.19. No 22, P.2682-2694