Shiv I. S. Grewal and Songtao Jia Nature Reviews Genetics (January 2007) | doi:10.1038/nrg2008
The formation of heterochromatin, which requires methylation of histone H3 at lysine 9 and the subsequent recruitment of chromodomain proteins such as heterochromatin protein HP1, serves as a model for the role of histone modifications and chromatin assembly in epigenetic control of the genome. Recent studies in Schizosaccharomyces pombe indicate that heterochromatin serves as a dynamic platform to recruit and spread a myriad of regulatory proteins across extended domains to control various chromosomal processes, including transcription, chromosome segregation and long-range chromatin interactions.
Рис.1. | Mechanisms for the initiation of heterochromatin assembly.
Рис.2. | RNAi-mediated heterochromatin assembly and silencing in fission yeast.
Рис.3. | Heterochromatin as a platform for the recruitment of effectors across extended domains.
Рис.4. | Heterochromatin recruits both silencing and anti-silencing factors.
Рис.5. | A model for a possible role for small RNAs in genome organization.
Рис.6. | Heterochromatin regulates cell-type specific spreading of a protein complex.
Box 1 | Complexities of heterochromatin in fungi, ciliates, plants and mammals
Box 2 | The main heterochromatic regions in fission yeast
В клетках эукариот геномная ДНК упакована с помощью гистоновых и не гистоновых белков, чтобы сформировать хроматин. Каждая единица хроматина или нуклеосома содержит ДНК в 146 bp, обмотаны вокруг октомера из гистонов1. Энзимы, модифицирующие гистоны, хроматин-ремоделирующие комплексы и метилирование ДНК, как полагают, являются компонентами прирожденных эпигенетических механизмов, которые помогают компактизировать и организовать геномы в дискретные домены хроматина2,3. Такая организация лежит также в основе многих аспектов поведения хромосом, таких как транскрипция, рекомбинация и репарация ДНК4.
В 1928, Heitz впервые отличил гетерохроматин от эухроматина на основании дифференциальной компакции в интерфазе5. Эухроматин оказался менее конденсированным, более доступным и в целом более легко транскрибируемым, в то время как гетерохроматин обычно сильно конденсирован, недоступен и высоко упорядочен в массивы нуклеосом6. Образование и поддержание гетерохроматина использует разного типа информацию, включая хромосомную локализацию, ядерную локализацию и присутствие и плотность повторяющихся элементов ДНК7-9. Хромосомные регионы, которые содержат высокие плотности повторяющихся элементов ДНК, такие как кластеры сателлитных последовательностей и мобильных элементов, которые обнаруживаются в центромерах, теломерах и , являются основынми местами образования гетерохроматина8-10. Эти регионы остаются конденсированными во время клеточного цикла и обозначаются как конституитивный гетерохроматин. Однако, гетерохроматин обнаруживается также в онтогенетически регулируемых локусах, в которых состояние гетерохроматина изменяется в ответ на клеточные сигналы и генную активность. Эти области обозначаются как факультативный гетерохроматин.
Ключевым признаком гетерохроматина является его способность распространяться и тем самым влиять на экспрессию генов регион-специфическим и сиквенс-специфическим образом. Когда гетерохроматин распространяется через домены, он обычно вызывает эпигенетическую репрессию соседних последовательностей, процесс, обозначаемый как молчание. При инактивации Х хромосомы самок млекопитающих гетерохроматин распространяется от специфического сайта зарождения (nucleation), вызывая молчание большей части Х хромосомы, регулируя тем самым дозу генов11. Гетерохроматин может также репрессировать рекомбинацию, это защищает целостность генома за счет предотвращения незаконной рекомбинации между разбросанными повторяющимися элементами ДНК9. Фактически, контроль 'паразитических' мобильных элементов рассматривают как оригинальное эволюционное преимущество гетерохроматинового молчания9,12. Сегодня установлено, что гетерохроматин, который собирается в определенном отношении на паразитических элементах ДНК также вносит вклад в некоторые биологические процессы. Напр., неправильная функция центромер наблюдается при нарушении образования гетерохроматина13,14. Дефекты гетерохроматина также затрагивают ядерную организацию и онтогенетически контролируемые дально-действующие взаимодействия хроматина между цис-действующими регуляторными элементами и локусами мишенями15-17.
Хотя эпигенетическое молчание генов становится почти синонимом гетерохроматинизации, имеются сообщения в литературе, согласно которым образование гетерохроматина нуждается в активации генной экспрессии7,18,19. Гистон H3, метилированный по лизину 9 (H3K9me) и гетерохроматиновый белок , которые необходимы для образования гетерохроматина, обнаруживают ассоциацию с субнабором транскрибируемых генов20-23. Более того, было показано, что гетерохроматиновые белки рекрутируют факторы, которые облегчают доступ RNA polymerase II (Pol II) к локусам гетерохроматина24. С точки зрения многосторонней роли гетерохроматина в разных клеточных функциях, которые в некоторых случаях вовлекаются в противоположные клеточные активности24, наша концепция гетерохроматина нуждается в пересмотре.
Важной темой становится то, что гетерохроматин обеспечивает механизм для рекрутирования и распространения регуляторных белков (эффекторов), которые влияют на различные аспекты биологии хромосом. Хотя эти эффекторы могут быть нацелены на индивидуальные локусы сиквенс-специфическим способом, способность гетерохроматина распространяться создает независимую от последовательностей платформу, позволяющую рекрутирование этих эффекторов на уровне хроматиновых доменов. Это может облегчать координированный контроль локусов, которые иначе неспособны рекрутировать эффекторы сами по себе.
С эволюционной точки зрения многоцелевой характер гетерохроматина может представлять собой серию событий. В самом деле, хотя все эукариоты используют механизмы эпигенетического молчания, разные клоны обладают определенно иными аспектами регуляции гетерохроматина в зависимости от хромосомного контекста (Box 1). Соблазнительно, но не столь уж неожиданно, найти, что, многие из одних и тех же модификаций гистонов и белки, которые необходимы для сборки молчащих структур гетерохроматина, являются в др. условиях напротив существенными для активации генов.
Исследования на разных системах внесли вклад в наше понимание гетерохроматина и его биологического значения (Box 1). Множественные пути модификаций гистонов и метилирование ДНК у высших эукариот участвуют в сборке гетерохроматина2,3,25 (Box 1). Однако, всё увеличивающийся список факторов (которые часто работают с перекрыванием), которые участвуют в образовании гетерохроматина25,26, связанный с размером и сложностью геномов у высших эукариот, осложняют дальнейшие усилия понять основные механизмы, которые лежат в основе образования гетерохроматина. В свете таких осложнений, делящиеся дрожжи Schizosaccharomyces pombe предоставляют уникальные преимущества для изучения структуры и функции хроматина. В отличие от почкующихся дрожжей, их геном содержит большие гетерохроматиновые регионы (Box 2), несмотря на небольшие размеры генома. Более того недавние исследования показали, что имеются законсервированные пути образования гетерохроматина между делящимися дрожжами и высшими эукариотами. По этой причине мы в основном сфокусируемся на недавних достижениях в деле понимания образования гетерохроматина и его функции у S. pombe. Сравнение с др. системами см в Box 1.
Mechanisms of heterochromatin assembly
HP1 and histone modifications in heterochromatin assembly. Первоначально открытый у Drosophila melanogaster, HP1 принадлежит сильно законсервированному семейству хроматиновых белков с гомологией, обнаруживаемой от делящихся дрожжей (, и ) до человека (HP1α, HP1β and HP1γ)6. Эти белки содержат N-терминальный chromodomain, короткую изменчивую шарнируную область, и за исключением Chp1, chromoshadow домен. Каждый HP1 белок взаимодействует с разными факторами, которые участвуют в разных аспектах структуры и функции Mechanisms of heterochromatin assemblyа. Диверсификация изоформ HP1 проявляется также в самостоятельных паттернах локализации. В то время как HP1α and HP1β распределяются в основном в доменах перицентромерного гетерохроматина, HP1γ локализуется в дискретных эухроматиновых сайтах6. Соединение HP1 белков с хроматином осуществляется очень динамично27,28. У S. pombe, описаны две кинетически самостоятельные популяции Swi6 с разным временем пребывания в гетерохроматине29, хотя значение этой находки остается до конца непонятым. Гистоны и их модификации играют критические роли в формировании гетерохроматина2. Гетерохроматин обладает характерными профилями модификаций гистонов, которые отличаются по гипоацетилированию и H3K9 метилированию; эухроматин характеризуется ацетилированием гистона H4 и метилированием гистона H3 по лизину 4 (H3K4me)30-34. Метилирование гистонов служит в качестве 'молекулярного якоря', рекрутирующего белки, которые или непосредственно модифицируют хроматин или рекрутируют др. белки, которые делают это35. Напр., H3K9me создает сайт связывания для Swi6/HP1 chromodomain, чтобы рекрутировать эти факторы в гетерохроматиновые локусы31,36,37. У D. melanogaster, связанный с хроматином HP1 в свою очередь обеспечивает рекрутирование histone methyltransferase , или непосредственно или посредством бифункционального связывающего партнера, SU(VAR)3-7 (Ref. 38). SU(VAR)3-9 является главным продуцентом H3K9me метки2,39; пока он переносит эту реакцию на соседний гистон, процесс сборки гетерохроматина продолжается. У S. pombe, эквивалентный процесс, cryptic loci regulator 4 ()-зависимого метилирования H3K9, инициируется независимо от Swi6, но последующее распространение метилирования H3K9 через домен существенно зависит от Swi640. Учитывая мультимеризацию Swi6/HP1 посредством chromoshadow домена41,42,и способность Swi6/HP1 соединяться с многочисленными белками, которые участвуют в образовании гетерохроматина, включая histone deacetylases (HDACs)43-46, было предположено, что Swi6/HP1, когда соединяется с метилированным H3K9, то служит в качестве сборочной платформы для хроматин-модифицирующих факторов, которые участвуют в стабилизации (поддержании) и распространении гетерохроматина40,45. Эта общая стратегия метилирования гистонов, действующая в качестве якоря для рекрутирования эффекторов, не ограничена гетерохроматином. Аналогичные механизмы используют и эухроматиновые локусы, где H3K4me и H3K36me рекрутируют хроматин модулирующую и HDAC активности, соотв., чтобы транскрибировать гены47-51.
Heterochromatin nucleation by RNAi and DNA-binding factors. Инициальное целенаправленное попадание гетерохроматина в сайт нуклеации является отличным от последующих ступеней гетерохроматинового распространения и поддержания. Стратегии, которые используются для направления гетерохроматина, отличаются в зависимости от хромосомного контекста (Fig. 1). Локальные wvc-действующие последовательности могут способствовать установлению факультативного гетерохроматина, как в примере с RB и KRAB-KAP1-обусловленном рекрутировании HP1 и SUV39 белков52,53. Однако, образование конституитивного гетерохроматина связано с присутствием повторяющихся элементов ДНК. Повторяющаяся природа этих элементов скорее, чем любые специфические первичные последовательности ДНК, по-видимому, запускают и направляют образование гетерохроматина54-56. Несколько линий доказательств указывают на то, что это может быть важной и законсервированной ролью для не кодирующих РНК и в этом контексте57.
RNAi первоначально было определено как механизм пост-трансляционного молчания58. Но стержневая RNAi кухня (machinery) (которая включает (Dcr), (Ago) и (RdRP)) также меняет структуру хроматина и молчание генов также на уровне транскрипции.
Роль RNAi в модификации генома вообще-то лучше всего изучена у S. pombe. Прежде чем генетические и биохимические исследования выявили связь между Argonaute белками и RNAi59, эти белки, как было известно участвуют в поддержании стволовых клеток60. Когда переключение типов спаривания у делящихся дрожжей следует stem-cell lineage-like паттерну61, то единственный ген, кодирующий Argonaute (ago1) мутантен. Потеря ago1 не влияет на паттерн переключения типов спаривания, но мутантные клетки обнаруживают дефекты сегрегации хромосом - фенотип, который обнаруживается также в клетках, у которых дефектно образование гетерохроматина13,62. Последующий анализ показал, что Ago1, Dcr1 и Rdp1 необходимы для гетерохроматинового молчания, а также для гетерохроматин-специфичных модификаций хроматина (таких как H3K9me) на центросомах и области типа спаривания40,63. Нпротив, белок семейства Argonaute Twi1, как было установлено, необходим для запрограммированной элиминации ДНК у Tetrahymena thermophila, процесса, который использует сборку гетерохроматина64,65. Последующие исследования показали, что кухня RNAi также затрагивает гетерохроматин у растений, мух, Caenorhabditis elegans и млекопитающих57,66-70.
Модификация хроматина сопровождается генерацией small interfering RNAs (siRNAs), которые подбирают соотв. геномные последовательности мишени, следовательно, RNAi непосредственно участвует в сборке гетерохроматин гетерохроматина34,64,71-74. У S. pombe, Pol-II-based транскрипция повторяющихся элементов существенна для запуска продукции siRNA и образования гетерохроматина34,75,76. Отметим, что компоненты RNAi соединяются на всём протяжении преимущественно со всеми основными гетерохроматиновыми доменами генома S. pombe34. Специфические классы повторяющихся элементов, обозначенных как dg и dh повторы (Box 2), являются важным источником из этих гетерохроматиновых доменов34. Эти повторы достаточны, чтобы nucleate гетерохроматин в эктопические места RNAi-зависимым способом40,77. Более того эндогенный локус mating-type (mat), dg- и dh-подобный элемент - cenH - служит как RNAi-зависимый центр нуклеации гетерохроматина40,78,79.
Но ДНК-связывающие белки также могут nucleate конституитивный гетерохроматин. Напр., сиквенс-специфические ДНК-связывающие транскрипционные факторы и кооперирут с (an HDAC), чтобы nucleate М в области типа спаривания S. pombe45,80,81. Базирующаяся на ДНК нуклеаци, по-видимому, является самостоятельным путем, работающим параллельно с RNAi-управляемой нукелацией45. Перекрывающиеся ДНК- и РНК-базирующиеся механизмы зарождения гетерохроматина оперируют, по-видимому, также в теломерах S. pombe, где теломерные повторы связывающий белок (ортолог TRF1 и TRF2 человека) вносит вклад в нуклеацию гетерохроматина, как это делает RNAi кухня путем взаимодействия с dh-подобными последовательностями34,82,83. Более того, факторы, которые соединяются с повторяющимися элементами ДНК, такие как CENP-B белки, вносят вклад в образование гетерохроматина на центромерах84. Базирующиеся на ДНК механизмы также оперируют на центромерах и теломерах у млекопитающих85 и могут кооперировать с базирующимися на РНК механизмами для эффективной сборки гетерохроматина.
Mechanism of RNAi-mediated heterochromatin assembly. Информация о базирующемся на RNAi гетерохроматиновом молчании получена путем очистки RITS (RNA-induced transcriptional gene silencing) комплекса из S. pombe86. RITS содержит Ago1 и siRNAs, которые соответствуют прежде всего dg и dh RITS гетерохроматиновым повторам. Он содержит таже новый белок и chromodomain белок Chp1. Когда клетки лишены Dicer, то потеря siRNAs сопровождается делокализацией RITS из центромерных регионов. Это наблюдение и результаты, которые показали, что RITS необходим для метилирования H3K9 не центромерных повторах, указывают на то, что присутствие siRNAs в RITS обеспечивает специфичность его локализации и необходимо для последующего рекрутирования Clr4 histone methyltransferase (HMTase). Пока не установлено, действительно ли RITS непосредственно обеспечивают гистон-модифицирующей активностью, но накапливаются доказательства, что RITS являются 'молекулярными наблюдателями', которые прикреплены к гетерохроматиновым локусам (частично путем связывания Chp1 chromodomain с H3K9me79,87), чтобы превратить транскрипты повторов в siRNAs79,88.
RITS связывание с гетерохроматиновыми доменами нуждается также в Clr4. Потеря Clr4 или мутации в H3K9me-связывающем chromodomain из Chp177 вызывают дефектный процессинг транскриптов повторов, что коррелирует с потерей siRNAs, которые связаны с RITS79. Искусственное прикрепление RITS к возникающим транскриптам вызывает сборку гетерохроматина, но Dicer-зависимым способом89. Следовательно, локализации RITS самой по себе недостаточно, чтобы нуклеировать гетерохроматин в отсутствие siRNAs.
Генетические доказательства показывают, что RNAi-обусловленный процессинг транскриптов повторов и образование гетерохроматина происходят благодаря позитивной петле обратной связи (Fig. 2), в которой RITS формирует основу более крупного RNAi комплекса, который собирается на хроматине79. RITS рекрутирует RDRC комплекс, который содержит Cid12, Hrr1 и Rdp1; RdRP активность Rdp1 существенна для превращения синтезируемых транскриптов в siRNAs88,90.
Процессинг транскриптов повторов также нуждается в slicer активности Ago1; мутации в законсервированных остатках, которые существенны для каталитической функции Ago1 устраняют продукцию siRNA, что коррелирует с дефектами сборки гетерохроматина91,92.
Возникает мнение, что H3K9me метка, которая устанавливается с помощью транс-действующей RNAi кухни и/или ДНК-связывающих факторов, стабильно прикрепляет RITS к хроматину, который в свою очередь рекрутирует RDRC и вообще-то Dicer, чтобы превращать возникающие транскрипты в siRNAs. Эти siRNAs образуют обратную связь, чтобы запускать дальнейшее рекрутирование гетерохроматиновой кухни. Как siRNAs локализуют гистон-модифицирующие активности, в частности, Clr4 HMTase, пока неизвестно, хотя ясно, что Clr4 является частью cullin 4 (Cul4)-based E3 ubiquitin ligase комплекса93-96, который возможно взаимодействует с RNAi факторами, такими как RITS. Также, Rik1, др. член этого комплекса, содержит WD-beta-propeller домены, которые обнаруживаются в некоторых РНК-связывающих белках97. Rik1 может (прямо или косвенно) обеспечивать связь между siRNAs и нуклеацией гетерохроматина40,93. Будучи нуклеированным, однако, гетерохроматина и RNAi факторы распространяются за пределы инициального сайта нуклеации, позволяя им тем самым осуществлять контроль над соседними последовательностями.
Boundaries of heterochromatin domains
Способность гетерохроматина распространяться д.б. ограничена, чтобы предупредить несоответствующее вторжение в соседний эухроматин. Клетки используют множественные механизмы, чтобы ограничить распространение гетерохроматина98. Один из таких механизмов вовлекает пограничные элементы ДНК, которые участвуют в определении границ между гетерохроматином и соседними доменами хроматина98,99. Факторы, которые рекрутируются на пограничные элементы, могут предварять сборку нуклеосом, приводя к нарушению прилагающего массива нуклеосом, что, как полагают, необходимо для распространения гетерохроматина100. В некоторых случаях пограничные элементы рекрутируют специализированные факторы, чтобы создавать активное хроматиновое окружение, которое противодействует распространению гетерохроматина24,98,101. Это хорошо показано в исследованиях пограничных элементов в локусе β-globin кур, в котором высокие уровни H3K4me и ацетилирования гистонов, которые поставляются с помощью сиквенс-специфического ДНК-связывающего белка USF, противодействуют распространению гетерохроматина98. У Saccharomyces cerevisiae RNA Polymerase III (Pol III) комплекс, когда связан с локусом tRNA, кооперирует с хроматин-модифицирующими факторами, чтобы создать функциональную гетерохроматиновую границу101. Недавние исследования на S. pombe указывают на то, что пограничные элементы ограничивают как гетерохроматин, так и ассоциированные с ним факторы определенной областью генома. Напр., inverted repeat (IR) пограничные элементы, фланкирующие гетерохроматиновые домены в области типа спаривания у S. pombe, блокируют распространение гетерохроматина33,102 и ассоциированных факторов, включая RITS, Clr3 HDAC и некоторые др. белки17,24,45,79.
IR пограничные элементы содержат B-boxes: сайты связывания для Pol III transcription factor, TFIIIC103. Соединение TFIIIC с B-боксами в отсутствие Pol III является признаком, который является общим для IR пограничных элементов и для т. наз 'chromosome organizing clamps', которые как полагают, прикрепляют хромосомы к периферии ядра. Привязка пограничных элементов к фиксированным ядерным структурам, по-видимому, отделяет гетерохроматин от эухроматина и организует геном в специализированные высшего порядка 'loop' домены99,104,105. Сходный механизм может оперировать на центромерах S. pombe, где кластеры tRNAs демаркируют границы гетерохроматиновых доменов34,103,106,107.
Существование множественных механизмов для ограничения распространения гетерохроматина и ассоциированных с ним факторов подчеркивает важность собственно организации хроматина для поддержания гомеостаза генома.
The functions of heterochromatin
Помимо репрессии транскрипции и рекомбинации повторяющихся элементов ДНК9,12, The functions of heterochromatin обеспечивает собственно расхождение хромосом и дальнодействующие взаимодействия хроматина. Но как гетерохроматин выполняет столь разнообразные функции? Доказательства, полученные на S. pombe и др. системах показывают, что гетерохроматин служит в качестве само-собирающегося остова из 'tethers', таких как H3K9me, и 'adaptors', таких Swi6/HP1, чтобы рекрутировать эффекторные белки, которые в свою очередь регулируют различные хромосомные процессы (Fig. 3). Способность гетерохроматина распространяться в цис-положении и скоординированно регулироваться в транс-положении с др. гетерохроматиновыми регионами7 являет собой мощный инструмент. Она создает способ поставки факторов на последовательности, которые будут иначе лишены сайтов связывания для их рекрутирования, и напротив способ контроля множественных локусов скоординированным образом.
Heterochromatin and transcriptional gene silencing. Сборка гетерохроматина в общем-то ассоциирует с крупномасштабной конденсацией хроматина и реорганизацией ядерных доменов7,12. Оба эти фактора могут понижать доступность транскрипционной кухни для гетерохроматиновых локусов. Соседние Swi6/HP1 молекулы, которые связаны с разными нуклеосомами, могут димеризоваться посредством chromoshadow домена41,42, обеспечивая конденсацию. Однако, в соответствии с недавними доказательствами Swi6/HP1 не только динамически соединяется с гетерохроматином27,28, но и также действует как рекрутирующая платформа для хроматин-модифицирующих активностей, которые могут, в свою очередь, предотвращать доступность подлежащих последовательностей для транскрипционной кухни45. У S. pombe, chromodomain белки Chp2 и Swi6 , как полагают, служат в качестве платформы для распространения HDAC Clr3 от места нуклеации к удаленным локусам мишеням45. Деацетилирование с помощью Clr3 поддерживает гетерохроматин путем стабилизации H3K9 trimethylation, но оно также предупреждает доступ Pol II (Ref. 45) (Fig. 4). Ацетилирование гистоновых концов непосредственно влияет на взаимодействие между нуклеосомами и редуцирует конденсацию хроматина с помощью nucleosome-remodelling факторов108. Следовательно, деацетилирование гистонов и репозиционирование нуклеосом с помощью ремоделирующих энзимов могут быть критическими ступенями при сборке конденсированных структур хроматина высшего порядка. Др. модификации, такие как метилирование гистонов, или факторы. которые соединяются с этими модификаторами, облегчают рекрутирование и распространение HDAC и ремоделирующих активностей.
Сходные механизмы могут оперировать у высших эукариот (напр. у растений и млекопитающих) и филаментозных грибов, хотя гетерохроматиновое молчание в этих системах зависит от сложного взаимного общения между метилированием ДНК и метилированием гистонов (однако, см. Box 1)109,110. Метилирование ДНК и гистонов возможно являются комплементарными метками, которые рекрутируют ген-замалчивающие активности. У млекопитающих метилирование ДНК рекрутирует MBD (methyl-CpG-binding domain) белки111, которые, аналогично HP1, могут служить в качестве загрузочных платформ для рекрутирования хроматин-ремоделирующих факторов. В самом деле, MBD белки формируют комплексы с HDACs112.
Heterochromatin and post-transcriptional gene silencing in cis. Молчание гетерохроматиновых последовательностей в некоторых системах также использует пост-транскрипционный процессинг транскриптов с помощью RNAi-родственных механизмов. Как упоминалось выше, H3K9me гетерохроматиновые белки делают возможным предпочтительную поставку RNAi эффекторных комплексов, таких как RITS и RDRC, на повторяющиеся элементы ДНК, включая диспергированные повторы34,79,88,90. Гетерохроматин позволяет также RNAi кухне распространяться в цис-положении и оперировать в крупных хромосомных доменах. Оказавшись на месте он обеспечивает механизм мониторинга, детекции и удаления несоответствующих, происходящих из повторов транскриптов34,79,88.
Насколько распространена роль пост-транскрипционного молчания генов в cis (cisPTGS) в гетерохроматиновом молчании? Потеря Dicer из DT40 клеток кур или мышиных эмбриональных стволовых клеток приводит к накоплению транскриптов из гетерохроматиновых повторяющихся последовательностей68,69,113. Более того, ядерный RNAi-родственный процесс деградирует межгенные транскрипты кластера генов β-globin114. Дальнейший анализ необходим, чтобы определить, может ли RNAi кухня рекрутироваться на гены. которые, покрыты гетерохроматиновыми факторами, чтобы обеспечить процессинг их транскриптов.
Чем же обусловлена близкая связь между pre- и post-транскрипционным молчанием? У S. pombe, одиночный Argonaute белок надзирает за ядром и цитоплазмой и обеспечивает как cisPTGS, так и классический RNAi ответ79,115. Когда гетерохроматин обеспечивает рекрутирование компонентов RNAi на повторяющиеся элементы ДНК, то он заставляет молчать как эти локусы, так и создает 'factories' для продукции siRNA79,88,90. Эти siRNAs обладают потенциалом двойного назначения. Они принуждают молчать гетерохроматин, но они могут также экспортироваться в цитоплазму, чтобы заставить RISC-подобный комплекс нейтрализовать будущую инвазию с помощью сходных последовательностей и деградировать любые транскрипты, которые избегают RITS механизма (Fig. 2).
Heterochromatic RNAs, higher-order organization and gene silencing. РНК, которая происходит из повторов, может структурно вовлекаться в сборку гетерохроматина. HP1 нуждается в РНК, чтобы собирать конденсированный хроматин в клетках млекопитающих; его РНК-связывающий домен расположен в шарнирной области между chromo- и chromoshadow доменами116,117. Образование эктопических хроматиновых волокон среди перицентромерного гетерохроматина и др. HP1-связывающих регионов, особенно областей, содержащих повторяющиеся элементы у D. melanogaster118,119, может в принципе также использовать РНК. У S. pombe, RNAi кухня необходима для образования кластеров в теломерах в приблизительно 2-4 тельца на периферии ядра120. Было предположено, что siRNAs, которые продуцируются в цис, вместе с транс-действующими факторами, могут функционировать как клей, чтобы способствовать укладке или образованию кластеров из диспергированных гетерохроматиновых локусов (Fig. 5). В самом деле, недавнее исследование выявило siRNA горячие точки вблизи концов всех трех хромосом S. pombe и локальное обогащение компонентами RNAi во всех этих локусах34. Благодаря избыточности путей сборки гетерохроматина, потеря RNAi кухни не оказывает влияния на уровни H3K9me и Swi6 на теломерах82,120. Несмотря на это, когда клетки каталитически инактивируют RdRP, то теряют свою способность продуцировать siRNAs, образование теломерных кластеров также не происходит, указывая тем самым, что образование кластеров может непосредственно контролироваться с помощью RNAi-родственного процесса88. У D. melanogaster компоненты RNAi Dicer 2, PIWI и Argonaute ко-локализуются с Polycomb group (PcG) тельцами и необходимы для потенциации PcG-зависимых хромосомных ассоциаций между эндогенными гомеозисными генами121. Более того, мутации в компонентах RNAi, как было установлено, меняют чувствительное к спариванию молчание121,122, в котором два или более PcG response elements (PREs) участвуют в joint дально-действующих silencing взаимодействиях. Итак, RNAi кухня, которая рекрутируется на локусы мишени, по-видимому, вносит вклад в регуляцию относительной локализации и архитектуры хромосом. Это может также помогать компартментализации регионов внутри ядра123. Один или оба из этих процессов могут, в свою очередь, способствовать эффективному молчанию локусов мишеней124.
Heterochromatin control of long-range interactions. Способность гетерохроматина влиять на организацию ядра15,16 может использоваться эволюцией, чтобы осуществить взаимодействия между регуляторными элементами, которые способны осуществлять региональный контроль на расстоянии от их локусов мишеней19. Т.к. гетерохроматин может быть дифференциально модифицирован в ответ на образование клонов клеток или онтогенетические сигналы32,33,125, то различия в структуре гетерохроматина или его способности рекрутировать факторы, также могут иметь ширко-идущие последствия для онтогенетически контролируемых дально-действующих взаимодействий и ядерной организации. Schizosaccharomyces pombe имеют немногие онтогенетические состояния. Тем не менее гетерохроматин испытывает критические онтогенетические изменения у этого организма17 (Fig. 6).
Schizosaccharomyces pombe переключения между P (plus) и M (minus) mating-type осуществляется с помощью регулируемой рекомбинации61. Информация в экспрессируемом mat1 локусе замещается с помощью последовательностей, которые хранятся в транскрипционно молчащем mat2P или mat3M донорских локусах. Выбор донорского локуса неслучаен и почти всегда приводит к переключению на противоположный аллель. Рассмотрим задачу: оба молчащих локуса расположены на расстоянии от mat1 и внедрены в 20-kb блок гетерохроматина. Парадоксально, но гетерохроматин способствует выбору донора путем облегчения распространения recombination-promoting complex (RPC) специфичным от типа клеток образом17. В P клетках, RPC соединяется только с определенным энхансерным элементом, который располагается вблизи локуса mat3M. Напротив, в M клетках RPC распространяется по крупному домену, включая и mat2P локус. Зависимые от типа клеток межбелковые взаимодействия между RPC и Swi6/HP1, или упаковка высшего порядка, облегчаемая гетерохроматином, как полагают, является специфическим механизмом, объясняющим дифференциальное распространение гетерохроматинизации17. Независимо от этого, эти находки подчеркивают, что клон-специфический контроль гетерохроматином-обусловленного распространения является мощным регуляторным механизмом, даже у простых, одноклеточных организмов.
HP1-mediated heterochromatic gene expression. Несколькро линий доказательств указывают на то, что Swi6/HP1 обладают двойной функцией - обусловливая как транскрипционное молчание, так и активацию локусов мишеней6,18,19,21-23. Напр., два существенных гена у D. melanogaster, light и rolled, вставлены в гетерохроматин и их полная экспрессия нуждается как в HP1 (Ref. 18), так и в близости больших блоков гетерохроматина7. Более неожиданно то, что было установлено, что HP1 локализуется в активно транскрибируемых хит-шоковых пуфах 21 и у млекопитающих как в H3K9me, так и в HP1gamma, ассоциированных с кодирующими регионами активированных генов23. Роль HP1 в регуляции экспрессии генов также выявляется при картировании распределения HP1 у D. melanogaster20,22.Механизмы, с помощью которых HP1 белки обеспечивают активацию генов не достаочно поняты. Гетерохроматин может способствовать структурной организации, которая необходима для собственно экспрессии генов, и/или гетерохроматиновые белки могут непосредственно обеспечивать рекрутирование ген-активирующей кухни. В случае функциональных генов у D. melanogaster, которые внедрены в гетерохроматин, образование гетерохроматина может просто сохранять относительную ядерную локализацию и пространственное расположение гена и его вышестоящих регуляторных элементов19. Доказательства, полученные на S. pombe показывают, что Swi6, помимо создания платформы или остова для связывания silencing факторов, кроме того рекрутирует и анти-silencing факторы, которые способствуют доступности Pol-II и транскроипции в гетерохроматин-специфическом контексте (Fig. 4). Epe1, JmjC-домен содержащий белок делящихся дрожжей, который негативно регулирует гетерохроматиновую репрессию126, рекрутируется по всем гетерохроматиновым доменам с помощью Swi6, чтобы облегчить транскрипцию гетерохроматиновых повторов24. Баланс между silencing (HDACs) и анти-silencing факторами (Epe1), которые рекрутируются с помощью Swi6, является важным для детерминации статуса транскрипции локуса. Сходные механизмы д. действовать у высших эукариот. В частности, HP1 локализуется на транскрибируемых генах20,22 и может служить в качестве осциллятора генной транскрипции путем управления рекрутированием как silencing так и активаторных белков. Гетерохроматиновые белки, которые ассоциированы с транскрибируемыми генами, также могут рекрутировать хроматин-модифицирующие активности (такие как HDACs и факторы, ремоделирующие нуклеосомы), которые существенны для повторного установления структуры хроматина после транскрипции, что существенно для предупреждения ложных транскриптов, инициируемых со скрытых стартовых точек49-51 а также для поддержания целостности генома.
Regulation of chromosome segregation. Дефекты в образовании гетерохроматина, особенно те, что затрагивают перицентрические регионы, приводят к неправильной сегрегации хромосом13,14,62,127. У D. melanogaster, центромерный гетерохроматин может облегчать ахиазматическую (не-обменную) сегрегацию хромосом во время мейоза128. Посредством Swi6 гетерохроматин может непосредственно рекрутировать факторы, такие как cohesin, который существенен для слипчивости сестринских хроматид129,130. Cohesin точно ко-локализуется с компонентами гетерохроматина в 20-kb молчащем mating-type интервале (K. Noma and S.I.S.G., unpublished observations). Мутанты, которые дефектны по локализации Swi6, теряют cohesin из своих центромер и обнаруживают дефекты расхождения хромосом120,131. Хотя высокая плотность cohesin на центромерах может соотв. ориентировать 132, рекрутирование cohesin с помощью гетерохроматина также защищает целостность генома путем предупреждения перестроек хромосом130. HP1 также облегчает рекрутирование кинетохорных белков, таких как Mis12 и Mtw1133 и взаимодействует с inner centromere protein (INCENP)134, который регулирует расхождение хромосом135.
Other functions that build on the heterochromatin platform. Гетерохроматин взаимодействует со многими др. эффекторными белками и комплексами25. Сюда входят и origin recognition complex (ORC), который маркирует и потенцирует источники репликации, и chromatin assembly factor (), который увязывает сборку хроматина с репликацией136,137. Эти взаимодействия указывают на то, что комплексы ORC и CAF1 могут рекрутировать HP1 и поощрять образование гетерохроматина или что гетерохроматин облегчает рекрутирование эти х белков, чтобы регулировать репликацию и способствовать наследованию эпигенетических состояний во время клеточных делений. Законсервированная протеин киназа, Hsk1-Dfp1, которая участвует в репликации ДНК, взаимодействует с Swi6 у S. pombe138. Возможно, что Swi6 рекрутирует этот киназный комплекс, чтобы активировать источники репликации внутри гетерохроматиновых областей.
Epigenetic reprogramming
среди всё увеличивающегося количества факторов, которые как известно, взаимодействуют с гетерохроматином, имеются белки, для которых ассоциация с хроматином является зависящей от клеточного цикла или регулируется в ответ на онтогенетические сигналы26. Динамическая природа Swi6/HP127-29 может облегчать быстрый переход в состояниях хроматина в ответ на изменения окружающих условий и/или онтогенетические сигналы, путем создания благоприятных возможностей для быстрого обмена ассоциированным и регуляторными белками. Др. словами, уровни владения Swi6/HP1-ассоциированными факторами локусами мишенями возможно отражают динамическое равновесие, которое имеет важные регуляторные последствия и может объяснить конкурентное рекрутирование различных факторов с помощью Swi6/HP1.
Вообще-то наиболее крайний случай репрограммирования событий нуклеации гетерохроматина обеспечивается деметилированием H3K9 с помощью JmjC семейства histone demethylases139-141, которые, как ожидается, полностью стирают гетерохроматиновые структуры. Др. привлекательная модель для динамических эффектов гетерохроматина предоставляется быстрым и обратимым фосфорилированием гистона 3 по серирну 10 (H3S10). Модификация H3S10 с помощью Aurora B и др. киназ мешает связыванию Swi6/HP1 chromodomains с H3K9me45,142,143 и это предоставляет потенциальную модель для регуляции стабильности гетерохроматина.
Модификации гетерохроматиновых белков представляют др. путь регуляции поставки эффекторов на гетерохроматиновые локусы. В этом механизме модификации, как полагают, меняют относительное сродство гетерохроматиновых белков к альтернативным партнерам по взаимодействию. В частности, HP1 белки, как известно, модифицируются различными пост-трансляционными модификаторами, включая фосфорилирование, ацетилирование, убиквитилирование, sumoylation и метитлирование138,144-146. У млекопитающих три самостоятельные изоформы HP1 подвергаются специфическим модификациям, которые глубоко изменяют их поведение145,147. Было бы интересно протестировать, могут ли ферментативные активности, которые модифицируют гистоны, также влиять на гетерохроматиновые белки, чтобы регулировать их связывание с эффекторными белками.
Conclusion
Genomes of higher eukaryotes contain large amounts of repetitive DNA sequences, such as transposons and retrotransposons. Any mechanism that evolved to protect the genome from invasion by such elements had to recognize the common features that these parasitic elements use to integrate and spread through the host genome. It is therefore not surprising that an RNAi pathway that uses small RNAs as specificity determinants to degrade transcripts and target heterochromatin to repetitive elements has evolved into a powerful genome-defense mechanism in diverse organisms.
Heterochromatin formation protects genomic integrity by rendering repetitive structures recombinationally inert and prohibiting potentially mutagenic transposition events. But the role of heterochromatin in genome maintenance is not limited to overcoming the harmful effects of repetitive elements. The ability of repeat-rich, gene-poor sequences to be a preferential target of heterochromatin assembly has been exploited during evolution to carry out various cellular functions. The formation of heterochromatin in association with repetitive sequences is crucial for functional organization of vital chromosomal structures such as centromeres and telomeres. The ability of heterochromatin to promote long-range interactions in a cell-type specific manner, and to clonally propagate gene expression patterns, is likely to contribute to the development of diverse cell lineages.
The realization that heterochromatin assembled at repetitive sequences provides a platform for the recruitment and spreading of various cellular activities, further to facilitating nuclear organization, underscores the regulatory potential of this specialized form of chromatin. This platform is probably a highly dynamic one that can change in response to cellular and environmental signals. Heterochromatin no longer represents the ultimate form of gene repression. Recruitment of regulatory proteins by heterochromatin offers a potent mechanism for coordinated regulation — involving both activation and repression of genes — at the domain level.
If evolution makes sense only in the context of the regulatory control of genes, we propose that heterochromatin, which is the main form of chromatin in higher eukaryotes, is positioned to be a deeply effective target for evolutionary change. Future investigations into assembly, maintenance and the many other functions of heterochromatin will shed light on the processes of gene and chromosome regulation.
