GENERAL SUMMARY

The intersection of RNA interference (RNAi) and heterochromatin formation brought together two areas of gene regulation that had previously been thought to operate by different, perhaps even unrelated, mechanisms. Using cytological staining methods, heterochromatin was originally defined nearly 80 years ago as those chromosome regions that retained a condensed appearance throughout the cell cycle. Early investigators studying the relationship between chromosome structure and gene expression noticed that certain chromosome rearrangements resulted in the spreading of heterochromatin into adjacent genes, which then became silent. But the stochastic nature of spreading gave rise to genetically identical populations of cells that had different pheno-types, providing a striking example of epigenetic regulation. The term RNAi was first used to describe gene silencing when homologous antisense or double-stranded RNA (dsRNA) is introduced into the nematode Caenorhabditis elegans. It was soon recognized that a related mechanism accounted for posttranscriptional transgene silencing (PTGS) described earlier in petunia and other plants. In contrast, heterochromatin was widely believed to operate directly at the chromatin level to cause transcriptional repression, by a mechanism referred to as transcriptional gene silencing (TCS). This chapter focuses on the relationship between the RNAi pathway and the formation of epigenetically heritable heterochromatin at specific chromosome regions. It draws on recent examples that demonstrate this relationship in the fission yeast Schizosoccharomyces pombe and the mustard plant Arabidopsis thaliana.

The fission yeast nuclear genome is composed of three chromosomes that range from 3.5 Mb to 5.7 Mb in size. Each chromosome contains large blocks of repetitive DNA, particularly at centromeres, which are packaged into heterochromatin. In addition, the mating-type loci (which control cell type) and subtelomeric DNA regions also contain repetitive sequences that are packaged into heterochromatin. We now know that the assembly of DNA into heterochromatin plays both regulatory and structural roles. In the case of the mating-type loci in yeast, regulation of gene transcription by heterochromatin is important for cell-type identity. In the case of telomeres and centromeres, heterochromatin plays a structural role that is important for proper chromosome segregation during cell division. Moreover, repetitive DNA sequences and trans-posable elements account for a large fraction, in some cases more than half, of the genomes of many eukaryotic cells. Heterochromatin and associated mechanisms play a critical role in maintaining genome stability by regulating the activity of repeated sequences. Recent studies have uncovered a surprising requirement for components of the RNAi pathway in the process of heterochromatin formation in fission yeast and have provided insight into how these two pathways can work together at the chromatin level. Briefly, small interfering RNA (siRNA) molecules, which are a signature of RNAi and other dsRNA silencing mechanisms, assemble into the RNA-lnduced Transcriptional Silencing (RITS) complex and direct epigenetic chromatin modifications and heterochromatin formation at complementary chromosome regions. RITS uses siRNA-dependent base-pairing to guide association with either DNA or nascent RNA sequences at the target locus destined to be silenced, an association that is stabilized by direct binding to methylated histone H3. The presence of these two activities in RITS triggers heterochromatin formation in concert with well-known heterochromatin-asso-ciated factors and directly links RNA silencing to heterochromatin modification.

In A. thaliano and other eukaryotes (with the exception of Saccharomyces cerevisiae), centromeric DNA regions are also composed of repetitive elements. These and other repeat sequences, such as retroelements and other transposons, are the source of siRNAs, attracting histone H3K9 and DNA methylation. Here again, several components of the RNAi pathway are required for the initiation and maintenance of these repressive methylation events. In this chapter, we discuss how heterochromatic siRNAs are produced and mediate DNA and/or chromatin modifications in fission yeast and A. thaliana.

1 Overview of the RNAi Pathway

Хотя термин RNAi первоначально был использован для описания молчания, которое обеспечивается экзогенной dsRNA у C. elegans (Fire et al. 1998), сегодня он широко обозначает молчание генов, которое запускается неким типом dsRNA. Ступени процесса RNAi включают генерацию dsRNA (которая может быть эндогенной или экзогенной, такой как вирусная РНК), процессинг в siRNA и нахождение этими молекулами или мРНК (PTGS) или регионов хроматина (TGS), чтобы вызывать эффект молчания. Следовательно, поэтому прежде обсуждения компонентов RNAi кухни (machinery), специфичной для TGS, мы обсудим источник dsRNA, который приводит RNAi кухню в действие.

dsRNA могут возникать в результате двунаправленной транскрипции повторяющихся элементов ДНК или транскрипции молекул РНК, внутри которых могут спариваться основания, чтобы сформировать сегменты dsRNA (see Fig. 1, a and b, соотв.). Напр., транскрипция областей инвертированных повторов продуцирует молекулы РНК, которые укладываются обратно на самих себя, чтобы создать шпилечные структуры. dsRNAs затем расщепляются с помощью Dicer, RNase III класса ribonuclease, которая генерируют siRNAs. Это комплементарные дуплексы размером в 21-27 nucleotides (nt), которые имеют характерный в 2-nt довесок на каждом 3' конце дуплекса (Hamilton and Baulcombe 1999; Zamore et al. 2000; Bernstein et al. 2001; Elbashir et al. 2001; Hannon 2002; Zamore 2002; Bartel 2004; Baulcombe 2004). Эти дуплексы раскручиваются в однонитчатые siRNA, чтобы действовать в качестве гидов, в ходе взаимодействия спаривающихся оснований с комплементарными последовательностями мишенями. Они, следовательно, являются факторами специфичности и играют центральную роль во всех механизмах RNAi-обусловленного молчания.

Кстати, идентифицированы два родственных комплекса, которые включают siRNA: RISC и RITS. В RNA-Induced Silencing Complex (RISC), siRNAs распознают мРНК мишени и инициируют их деградацию с помощью эндонуклеотического расщепления внутри области мРНК, основания которой спарены с siRNA (Hannon 2002; Bartel 2004). RNase H домен семейства белков Argonaute/PIWI (субъединица RISC) осуществляет это событие инициального расщепления мРНК. В ядерном RNA-Induced Transcriptional Silencing (RITS) комплексе (сходном с RISC), siRNAs наводят комплекс на регионы хромосом для модификации хроматина (Verdel et al. 2004; Buhler et al. 2006). Этот RITS-обеспечиваемый путь РНК и является предметом данной главы.

Центральные белки Argonaute и Dicer необходимы для дополнительного типа RNA silencing механизма, использующего microRNAs (miRNA). РНК, транскрибируемые с эндогенных некодирующих генов, которые первоначально формируют шпилечные структуры РНК, благодаря расширенным dsRNA областям, подвергаются процессингу в miRNA посредством серии ступеней (Bartel 2004; Filipowicz et al. 2005). Подобно siRNAs, miRNAs размером 21-24 nt образуют часть RISC посредством белков Argonaute, чтобы находить специфические мРНК. Такой таргетинг может приводить к расщеплению мРНК посредством PIWI/RNAse H домена и трансляционной репрессии, связанной со взаимодействиями с 7meG шапочкой наe 5'-конце мРНК. Это может быть связано с секвестрацией мРНК на цитоплазматических RNA-processing органеллах, известных как P тельца (Processing bodies). Т.о., по крайней мере, два разных dsRNA-processing пути приводят к генерации siRNA или miRNA, всё же эти РНК используют сходную кухню для инактивации родственных мРНК. Путь miRNA отличается сам по себе, т.к. все miRNAs продуцируются с помощью эндогенных некодирующих генов, которые в основном регулируются онтогенетически, и, в свою очередь, обычно находят и онтогенетически регулируют молчание гомологичных генов. Хотя dsRNAs могут формироваться с помощью отжига (annealing) направляющей и обратной РНК, что происходит в результате двунаправленной транскрипции

Figure 1. Sources of dsRNA, Which Act as a Substrate for Generation of siRNAs by the Dicer Ribonuclease, and Are the Trigger for RNA Silencing (a) Bidirectional transcription has been observed at the 5. pombe centromeric repeats and the cenH region of the silent mating-type locus, (b) Transcription through inverted repeats found in many plant and animal cells can potentially produce dsRNA. (c) Transcription of aberrant RNAs that may lack proper processing signals may trigger dsRNA synthesis by RdRPs.

или происходит в шпилечных структурах, в некотоирых клетках RNAi нуждается в дополнительных энзимах, чтобы производить dsRNA. Это RNA-directed RNA polymerase (RdRP), обнаруженная у растений и C. elegans (Dalmay et al. 2000; Sijen et al. 2001). Она использует siRNAs в качестве праймеров, чтобы генерировать больше dsRNA, которые могут затем подвергаться процессингу в дополнительные siRNA с помощью Dicer. Первичной функцией RdRP является, как полагают, амплификация RNAi реакции, но как будет обсуждено ниже, RdRPs могут играть более специфические роли в инициации синтеза dsRNA (see Section 5). В самом деле, она безусловно участвует в процессе, приспособленном для продукции лучшей защитной реакции хозяина на введение экзогенных dsRNA. Эта идея подкрепляется тем фактом, что RdRPs не участвуют в miRNA путях молчания (Sijen et al. 2001). Интересно, что насекомые (включая Drosophila) и позвоночные (включая млекопитающих) лишены узнаваемых RdRP-подобных последовательностей в своих геномах, но остается возможным, что др. полимеразы осуществляют синтез dsRNA у этих организмов.

Как затем функционируют различные механизмы РНК молчания? Они хорошо законсервированы у организмов в пределах от делящихся дрожжей до растений и до человека и они играют центральную роль в регуляции генной экспрессии и геномной стабильности (благодая образованию стабильного гетерохроматина в центромерах и теломерах). Кроме того, эти механизмы молчания участвуют в защите против транспозонов и вирусных РНК посредством деградации их РНК транскриптов (Plasterk 2002; Li and Ding 2005). Наконец, транскрипция с некоторых транспозонов генерирует аберрантные РНК, которые запускают RNAi с помощью механизма, как полагают, участвующего в превращении аберрантных транскриптов в dsRNA с помощью RdRPs (Fig. 1) (Baulcombe 2004).

2 Early Evidence Implicating RNA as an Intermediate in Transcriptional Gene Silencing

Прежде обсуждения хорошо известных примеров RNAi-based модификаций хроматина у делящихся дрожжей и Arabidopsis коротко рассмотрим ранние эксперименты, которые подтвердили роль РНК в осуществлении модификаций хроматина и ДНК. Самые ранние доказательства роли промежуточных РНК образований в TGS получены в исследованиях растительных viroids. Potato spindle tuber viroid (PSTV) состоит из 359-nt РНК генома и реплицируется посредством РНК-ОНК пути. Введение PSTV в геном табака приводит к метилированию ДНК гомологичных ядерных последовательностей, тем не менее трансгенных по происхождению (Wassenegger et al. 1994). Однако, эти и интегрированные копии PSTV ДНК становятся метилированными только у растений, которые поддерживают транскрипцию viroid РНК, указывая на участие промежуточных РНК образований, которые управляют метилированием ДНК (Wassenegger et al. 1994). Более того у Arabidopsis продукция аберрантных транскриптов каким-то образом приводит к метилированию ДНК всех гомологичных промоторных регионов и к транскрипционному молчанию генов (Mette et aL 1999). Это вместе с находками, что репликация вирусных геномов у растений ведет к продукции малых РНК размером в 22 nt, подтвердило, что RNAi-родственные механизмы обеспечивают метилирование ДНК (Mette et al. 2000). Эти наблюдения, а также индуцируемое повторами молчание с помощью трансгенов, которое впервые было открыто у petunia и табака, теперь широко обнаруживаются как самые ранние примеры молчания с помощью RNAi (Napoli et al. 1990; discussed in Chapter 9).

Дальнейшие доказательства связи между RNAi и TGS получены в исследованиях индуцированного повторами молчания генов у Drosophila (see Chapter 5). Введение множественных тандемных копий трансгена приводит к молчанию как трансгенных, так и эндогенных копий (Pal-Bhadra et al. 1999). Такое молчание нуждается в chromo-доменовом белке Polycomb, который участвует также в упаковке гомеозисных регуляторных генов в гетерохроматин-подобные структуры вне их собственных доменов действия (Francis and Kingston 2001). Кроме того, такое индуцированное повторами молчание генов нуждается в Piwi, в члене семейства Drosophila Argonaute, необходимого для RNAi (Pal-Bhadra et al. 2002). У Tetrahymena, др. член семейства Piwi белков, Twi1, необходим для накопления малых РНК и массивной элиминации ДНК, которая наблюдается в соматическом макрроядре простейших (see Chapter 7). Эти и более недавние результаты, обсуждаемые в Section 8 указывают на то, что путь RNAi участвует в сборке репрессивных структур хроматина у мух.

Др. индуцированные повторами механизмы молчания описаны у filamentous грибов, включая мутацию Repeat-Induced Point (RIP) у Neurospora crassa и Methylation Induced Pre-meiotically (MIP) у Ascobolus immersus? которые, по-видимому, не участвуют в промежуточных РНК образованиях, т.к. они появляются независимо от транскрипционного состояния локуса (Galagan and Selker 2004). Вместо этого, RIP и MIP вовлекают парные локусы, где (напр.) две из трех копий гена молчащие, указывая тем самым на некоего типа механизм ДНК-ДНК взаимодействия с вовлечением гомологичных локусов в индукцию молчания. Напротив, молчание непарных ДНК в мейозе (silencing of unpaired DNA in meiosis (MSUD)), которое происходит у Neurospora, нуждается в пути RNAi (Shiu et al. 2001; discussed in Chapter 6) и может иметь параллели с др. организмами, включая C elegans (Maine et al. 2005; see Chapter 15).

3 RNAi and Heterochromatin Assembly in S. pombe

Хромосомы S. pombe содержат обширные гетерохроматиновые регионы ДНК, которые ассоциируют с лежащими в основе повторяющимися элементами ДНК в центромерах и молчащих локусах типов спаривания (mat2/3) (Grewal 2000; Pidoux and All-shire 2004). Каждая центромера делящихся дрожжей содержит уникальную central core region (cnt), которая фланкируется двумя типами повторов, называемых innermost (imr) и outermost (otr) повторами (Fig. 2). Область otr сама состоит из dh и dg повторов.

Образование гетерохроматина у S. pombe использует совместное действие ряда транс-действующих факторов. Сюда входят histone deacetylases (HDACs), Clr4, гистоновая H3 lysine 9 methyltransferase (HKMT)и histone H3K9-methyl связывающие белки, Swi6 (гомолог HP1) и Chpl. Инициальное рекрутирование Swi6 и Clr4 на хроматин, как было предположено, приводит к распространению H3K9 метилирования и образования гетерохроматина посредством последовательных циклов катализируемого с помощью Clr4 метилирования H3K9, купированного с Swi6-обусловленным распространением на соседние нуклеосомы посредством их само-ассоциации (Grewal and Moazed 2003).

Мутации компонентов пути RNAi неожиданно приводили к потере центромерного гетерохроматина и накоплению некодирующих прямых и обратных транскриптов с двунаправленных промоторов внутри каждого dg и dh повтора (Fig. 2) (Volpe et al. 2002). Делящиеся дрожжи содержат одиночный ген для каждого из RNAi белков, Dicer, Argonaute и RdRP (dcrl⁺ agol⁺ and rdpl⁺ соотв.). Делеция любого из этих генов приводит к потере метилирования гистонов H3K9, а мутанты обнаруживают дефекты в сегрегации хромосом, которые обычно ассоциируют с дефектами в сборке гетерохроматина (Provost et al. 2002; Volpe et al. 2003). Более того, секвенирование библиотеки малых РНК делящихся дрожжей идентифицировало ~22-nt РНК, которые картируются исключительно в центромерных повторах и рибосомальных ДНК повторах, указывая тем самым, что cen РНК могут продуцировать dsRNAs, которые превращаются в siRNAs (Reinhart and Bartel 2002). Т.о., было предположено, что путь RNAi

Figure 2. Organization of Heterochromatic Chromosome Regions in 5. pombe and A. thaliana The centromere of 5. pombe chromosome 1 is shown as an example. The unique central core (cntl) region is flanked by innermost (imrL and imrR) and outermost (otrL and otrR) repeats. The otr region is transcribed in both directions, giving rise to forward (blue) and reverse (red) transcripts. The region between the mat2 and mat3 genes contains a domain that is homologous to the centromeric dg and dh repeats (cenH) and is also bidirectionally transcribed. Atfl and Perl are DNA-binding proteins that act in parallel with RNAi in mating-type silencing. Arabidopsis centromeres are composed of 180-bp repeats (green) interspersed with retrotransposable elements (yellow). Forward transcripts initiating within the long terminal repeat (LTR) of the retroelement and reverse transcripts initiating within the 180-bp repeats are indicated.

может рекрутировать Swi6 и Clr4 на хроматин, чтобы инициировать и/или поддержать образование гетерохроматина в каждом из указанных выше локусах (Fig. 3) (Hall et al. 2002; Volpe et al. 2002).

Интересно, что TGS и PTGS механизмы, по-видимому, вносят вклад в подавление cen РНК. Транскрипт с прямой (forward) нити преимущественно молчащий на транскрипционном уровне, как показывают RNAi мутанты (Volpe et al. 2002). Транскрипты cen с обратной нити, однако, не затрагиваются мутантами Swi6 (Volpe et al. 2002), и замалчивание этих cen-reverse транскриптов происходит преимущественно на пост-транскрипционном уровне.

RNAi играет также роль в замалчивании локусов типов спаривания (mat2/3) (Hall et aL 2002). Локус mat2/3 прерывается областью ДНК, которая высоко гомологична центромерным повторам (называется cenH, cenHomology)(Fig. 2). Подобно cen повторам област cenH транскрибируется в разных направлениях, чтобы продуцировать прямую и обратную РНК (Noma et aL 2004). Эти cenH транскрипты накапливаются на высоких уровнях у RNAi мутантов. Напротив, RNAi не обязательна для молчания репортерного трансгена, вставленного в mat2/3, если молчание сперва каким-то образом не поставлено под угрозу. Причина подобного различия заключается в том, что частично перекрывающийся механизм молчания использует два ДНК-связывающих белка, Perl и Atfl, которые соединяются с mat2/3, рекрутируя кухню гетерохроматина независимо от

Figure 3. Assembly of Heterochromatin Involves the Concerted Action of Histone-modifying Enzymes (HDACs and Clr4). and Histone-Wnding Proteins (e.g., Swti) and Can Be Directed by the RNAi Machinery
Deacetylation by HDACs is followed by recruitment of Clr4 and his-tone H3K9 methylation. Swi6 binds to H3K9-methylated histone tails, and spreading results from sequential cycles of H3K9 methylation that are coupled to SvW6 otigomerization.

RNAi (Jia et al. 2004). Это достаточно для молчания репортерного гена в отсутствие RNAi, но не предупреждает накопление некодирующих cenH транскриптов (Fig. 2).

4 Small RNAs Initiate Heterochromatin Assembly in Association with an RNAi Effector Complex

Открытие, что RNAi путь участвует в формировании гетерохроматина у делящихся дрожжей и в транскрипционном молчании генов в др. системах ставит вопрос о том, как он может непосредственно регулировать структуру хроматина. Очистка Chpl, хромодоменового белка, который является структурным компонентом гетерохроматина, привела к идентификации RITS комплекса (Verdel et al. 2004). RITS содержит у делящихся дрожжей белок Agol и Tas3, белок с неизвестной функцией, помимо Chpl. Он содержит также центромерные siRNAs, которые продуцируются с помощью Dicer ribonuclease, и важно, что RITS ассоциирует с регионами центромерных повторов siRNA-зависимым способом. RITS, следовательно, как предполагается, использует центромерные siRNAs, чтобы найти специфические регионы хромосом для инактивации и это создает прямую взаимосвязь между RNAi и сборкой гетерохроматина (Fig. 4).

Подобно RISC, который обеспечивает PTGS, RITS использует siRNAs для распознавания мишеней. В отличие от RISC, однако, RITS ассоциирует с хроматином и инициирует образование гетерохроматина в противоположность инактивации мРНК. Как могут siRNAs находить специфические регионы хромосом? Предложены два возможных механизма. В первой модели siRNAs соединяются с Agol в RITS комплексе и д. каким-то образом спаривать основания с не раскрученной двойной спиралью ДНК. Во второй модели RITS-ассоциированные siRNAs спаривают основания с транскриптами некодирующей РНК в локусе мишени (Fig. 4).

Согласно любой модели ассоциация RITS с хроматином посредством siRNA приводит к рекрутированию Glr4 HKMT и к последующему метилированию гистона H3K9. Это сопровождается связыванием Swi6 и распространением метилирования H3K9 и гетерохроматина. Однако, Clr4 рекрутируется также для ассоциации RITS с хроматином, указывая тем самым, что он обеспечивает метилирование H3K9, с которым комплекс RITS может соединяться, тем самым стабилизируя свою ассоциацию с хроматином. Хромодомен Chpl, как уже известно, соединяется специфически с метилированными H3K9 остатками (Partridge et al. 2002), a мутации в Clr4 или в хромодомене Chpl, которые затрагивают это взаимодействие, приводят к потере связывания RITS с хроматином (Partridge et aL 2002; Noma et al. 2004). Более того, RITS может также соединяться с хроматиновыми доменами, которые покрыты метилированными H3K9 посредством хромодоемена

Figure 4. RNAi and siRNA-directed Assembly of Heterochromatin in S. pombe Both Dicer and RDRC are required for siRNA generation. Initial targeting is proposed to involve RITS and siRNA-mediated recognition of cognate transcripts. The binding of RITS is stabilized by association of the chromodomain of Chpl with H3K9 methylated histone. The recruitment of Clr4 and Swi6 mediates the spreading of H3K9 methylation.

Chpl в mat2/3 и теломерных регионах в отсутствии siRNAs (Noma et al. 2004; Petrie et al. 2005). Итак, комплекс RITS обнаруживает сродство к хроматину посредством связывания Chpl с метилированными H3K9 и посредством спаривания оснований siRNA или с ДНК или РНК транскриптами.

Недавние доказательства строго подтверждают роль RITS и siRNAs в инициации сборки гетерохроматина. Buhler et al. (2006) использовали сайт-специфический РНК-связывающий белок для искусственной связи RITS комплексов с РНК транскриптами обычно активного ura4⁺ гена. Удивительно, это привязывание приводит к генерации ura4⁺ siRNAs и молчанию гена ura4⁺ по способу, который нуждается как в компонентах RNAi, так и гетерохроматина. Кроме того, эта система делает возможной прямую оценку способности вновь сгенерированных siRNAs инициировать метилирование H3K9 и связывание Swi6, которые являются молекулярными маркерами для образования гетерохроматина. Интересно, что вновь сгенерированные ura4⁺ siRNAs, как было установлено, находятся под негативным контролем консервативной siRNA ribonuclease, Eril, которая ограничивает их локусом, где они продуцируются. Однако, когда ген, кодирующий Eril делетирован, то ura4⁺ siRNAs способны действовать в транс-положении, чтобы заставлять молчать вторую копию in trans to silence a second copy of the ura4⁺ гена, которая вставлена в др. хромосому той же клетки. Этот эксперимент демонстрирует, что siRNAs могут действовать как факторы специфичности, которые управляют RITS и сборкой гетерохроматина в ранее активной области генома.

Способность siRNAs инициировать молчание у S. pombe была также исследована с использованием др. метода, который имеет отношение к экспрессии шпилечных РНК, чтобы продуцировать siRNAs, гомологичные трансгену GFP (Sigova et al. 2004). В этой системе, шпилечные siRNAs способствуют молчанию GFP репортерного гена на PTGS, но не TGS, уровне (Sigova et al. 2004). Неясно, почему шпилечные siRNAs не могут индуцировать TGS и сборку гетерохроматина на хромосомной копии GFP. Одним из возможных объяснений является то, что гетерохроматин собирается в специфических субъядерных местах, а сборка вне этих мест происходит неэффективно (Gasser et al. 2004; Chapter 4).

5 dsRNA Synthesis and siRNA Generation

Двунаправленная транскрипция центромерных повторов ДНК д. в принципе создавать инициальный источник dsRNA у делящихся дрожжей (Volpe et al. 2002). dsRNA, возникающая в результате отжига forward и reverse транскриптов, д. затем становиться субстратом для Dicer ribonuclease. Однако, RNA-directed RNA polymerase (Rdpl) и ассоциированные с ней кофакторы, а также Clr4 HKMT, также необходимы для продукции siRNAс помощью Dicer (Hong et al. 2005; Li et al. 2005; Buhler et al. 2006). Эти наблюдения указывают, что генерация гетерохроматиновых siRNAs с помощью Dicer связана с хроматином и с Rdpl-зависимыми событиями (Fig. 4).

Энзим Rdpl находится в мультипротеиновом комплексе, который также содержит Hrrl, РНК helicase, и Cidl2, члена β семейства ДНК полимераз, которые включают poly(A) polymerase энзимы (Motamedi et al. 2004). Этот комплекс был назван RNA-directed RNA polymerase complex (RDRC), и все его субъединицы необходимы для образования гетерохроматина в центромерных регионах ДНК (Motamedi et al. 2004). Как ожидалось благодаря присутствию Rdpl, RDRC обладает RNA-directed RNA polymerase активность in vitro, a мутации, которые устраняют эту активность устраняют также RNAi-зависимое молчание in vivo (Motamedi et al. 2004; Sugiyama et al. 2005). Активность по синтезу РНК in vitro RDRC не нуждается в siRNA праймере (Motamedi et al. 2004). RITS может, следовательно, обеспечивать in vivo специфичность путем рекрутирования RDRC на избранную РНК матрицу посредством siRNA. В соответствии с этой гипотезой, субъединицы RDRC необходимы для генерации siRNA, а RITS комплексы, очищенные из клеток, которые лишены каких-либо из субъединиц RDRC, лишены и siRNAs (Motamedi et al. 2004; Li et al. 2005; Sugiyama et al. 2005; Buhler et al. 2006).

Присутствие Cidl2 в RDRC является интригующим и открывается возможность, что др. полимеразная активность участвует в ассоциированном с хромосомами РНК молчании. Т.к. некоторые члены этого семейства обладают poly(A) полимеразной активностью, то одна из возможностей заключается в том. что аденилирование Rdpl-продуцируемой dsRNA может быть важным для их дальнейшего процессинга. Интересно, что Cidl2-подобные белки законсервированы у всех эукариот (Table 1); мутации в Rde-3, члена этого семейства у C. elegans, вызывает дефектную RNAi (Chen et al. 2005), подтверждая законсервированную роль этого энзима в пути RNAi. Существуют доказательства синтеза и процессинга dsRNA, ассоциированных с генерацией гетерохроматиновых siRNAs, происходящих на хромосомах, в местах транскрипции некодирующих центромерных РНК (Fig. 4). Доказательства включают, во-первых, что Rdpl может быть поперечно связан с центромерными повторами ДНК (Volpe et al. 2002; Sugiyama et al. 2005) и с прямыми и обратными РНК транскриптами, которые возникают из этих регионов (Motamedi et al. 2004). Как и в случае с поперечным связыванием с ДНК, поперечное связывание с центромерными РНК нуждается в Dicer и Clr4, и является, следовательно, siRNA- и хроматин-зависимым. Во-вторых, генерация siRNA нуждается в компонентах хроматина, включая Clr4, Swi6 и HDAC Sir2 (Hong et al. 2005; Li et al. 2005; Buhler et al. 2006).Наконец, ассоциация RDRC с RITS зависит от siRNAs, а также Clr4, указывая тем самым, что она происходит на хроматине (Motamedi et al.2004).

Table 1. Conservation of RNAi and heterochromatin proteins

^a An obvious ortholog of the chromodomain protein, Chpl, has not been identified in the other model organisms listed here, but most eukaryotic cells contain multiple chromodomain proteins. CMT3 in Arabidopsis is a chromodomain DNA methyltransferase, which acts in the same pathway as AG04 and may be analogous to Chpl.
^b No obvious orthologs of Tas3 have been identified, but it shares weak sequence similarity with a mouse ovary testis specific protein (NP_035152).
^c Cidl2 belongs to a large family of conserved proteins that share sequence similarity with the classic poly(A) polymerase as well as 2'-5'-oligoadenylate enzymes.
^d C elegans have about 20 SET domain proteins, but an H3K9 HKMT has not yet been identified in this organism.
^e S. pombe contains another Rikl -like protein, Ddb1, which is involved in DNA damage repair. Metazoans and plants appear to contain only a single Rik1-like gene, called Ddb1, which has been shown to be involved in DNA damage repair, but it is unknown whether it also participates in heterochromatin formation.

Т.о., генерация dsRNA и гетерохроматиновых siRNAs может использовать рекрутирование RDRC на ассоциированные с хроматином синтезируемые пре-мРНК транскрипты, как показано на Рис. 5 (Martienssen et al. 2005; Verdel and Moazed 2005). Тот факт, что транскрипция и генерация siRNA скорее всего происходят одновременно подкрепляет различия между механизмами РНК молчания, которые обеспечивают модификации хроматина и PTGS. Однако, это различие вряд ли абсолютно. Напр., у C. elegans мутации в некоторых компонентах хроматина, подобно у S. pombe, приводят к дефектам RNAi и к транспозонами индуцируемому РНК молчанию (see Table 1) (Sijen and Plasterk 2003; Grishok et al. 2005; Kim et al. 2005), возникает возможность, что в некоторых случаях синтез и процессинг dsRNA может происходить на хромосомах независимо от того, происходит ли молчание на TGS или PTGS уровне.

6 RNA-RNA Versus RNA-DNA Recognition Models

Неразрешенным вопросом при детальной разработке роли RNAi в сборке гетерохроматина является, ассоциирует ли RITS/RDRC с ДНК или синтезируемой РНК. Наблюдение, что прикрепленные компоненты RNAi кухни к генным транскриптам могут индуцировать гетерохроматин-зависимое молчание генов в цис-положении, ясно демонстрирует, что этот процесс может обеспечиваться посредством инициальных взаимодействий с синтезируемыми РНК транскриптами (Buhler et al. 2006). Важно, что цис-ограничение исключает возможность того, что инициальные события синтеза dsRNA и генерации siRNA происходят на зрелых транскриптах, когда продукты мРНК

Figure 5. Model for Co-transcriptional dsRNA and siRNA Cener-ation, and Recruitment of the Or4-Wk1-Cul4 Histone Methyt-transferase Complex in 5. pombe

от разных аллелей не могут быть различены. более того, прямым предсказанием модели взаимодействия РНК-РНК является то, что транскрипция на локусе мишени д. быть необходима для RNAi-обеспечиваемой сборки гетерохроматина. Хотя потребность в транскрипции не была протестирована непосредственно, мутации в двух разных субъединицах RNA polymerase II (RNA pol II), обозначенных Rpb2 и Rpb7, приводят к специфическим дефектам в генерации siRNA и сборке гетерохроматина, но не влияют на общую транскрипцию (Djupedal et al. 2005; Kato et al. 2005). Это напоминает мутантов Rbpl, которые имеют дефекты по модификации гистонов (т.e., H3K4 метилированию и H2B ubiquitination), связанные с транскрипционной элонгацией (Hampsey and Reinberg 2003), и представляют собой прецедент для гипотезы, что RNAi-обеспечиваемое H3K9 метилирование и образование гетерохроматина может быть купировано с транскрипционной элонгацией посредством ассоциации RNAi комплексов с RNA pol II. Фактически, в противоположность широко распространенному мнению, что гетерохроматин является недоступной структурой, которая ингибирует транскрипцию, RNAi-обеспечиваемая сборка гетерохроматина оказывает незначительный или не оказывает эффекта на ассоциацию RNA pol II с S. pombe центромерными повторами (Volpe et al. 2002; Djupedal et al. 2005; Kato et al. 2005; Buhler et al. 2006). Следовательно, синтезируемые РНК транскрипты, которые действуют как матрицы для RITS в модели РНК-РНК распознавания, присутствуют в гетерохроматиновых доменах (Fig. 4).

Модель RNA-RNA targeting также подтверждается наблюдением, что компоненты RITS и RDRC комплексов могут быть локализованы на некодирующих центромерных РНК, используя in vivo эксперименты по поперечному связыванию (Motamedi et al. 2004). Такое расположение является siRNA-зависимым, это указывает на то, что оно использует взаимодействия спаривания оснований с некодирующей РНК. Кроме того, оно нуждается в Clr4 HKMT, указывая тем самым, что оно купировано со связыванием RITS с метилированными H3K9 и происходит на хроматине. Несмотря на это возможность того, что siRNAs могут также распознавать непосредственно ДНК посредством взаимодействий спаривания оснований не может быть исключено, Напр., у растений siRNAs, которые комплементарны промоторным регионам, которые являются (преимущественно) не транскрибируемыми, всё ещё могут управлять метилированием ДНК, др. модификацией, которая имеет место во время образования гетерохроматина внутри этих регионов (see Chapter 9).

7 How Does RNAi Recruit Chromatin-modifying Enzymes?

Рекрутирование Clr4 и Swi6 является ключевой ступенью в инициации метилирования гистона H3K9 и сборки гетерохроматина, согласно ауторегуляторной связанной с модификациями модели (Figs. 3 and 4) (Grewal and Moazed 2003). Однако, ассоциация RITS с хроматином и Clr4-катализируемое метилирования гистона H3K9 являются независимыми процессами, поэтому трудно определить событие, которое является инициальным триггером для RNAi-зависимой сборки гетерохроматина. Одним из решений этой проблемы является то, что siRNA-зависимые взаимодействия спаривания оснований могут предоставлять инициальный сигнал для сборки гетерохроматина (Fig. 4). В согласии с этой гипотезой, генерация de novo generation of ura4⁺ siRNAs способствует молчанию ранее активной копии ura4⁺ гена, которое связано с рекрутированием RITS и Swi6 на хроматин (Buhler ct al. 2006). Инициальное связывание RITS может быть, однако, временным и трудно определимым; стабильное связывание RITS с хроматином нуждается в двойных взаимодействиях между (1) RITS-связанными siRNAs и синтезируемым транскриптом и (2) связыванием chromo-домена Chpl с метилированным H3K9. В этой модели RITS сам по себе непосредственно рекрутирует Clr4. Альтернативно, Clr4 может рекрутироваться с помощью параллельного пути, который использует один или более ДНК-связывающих белка, как в случае замалчивания генов типа спаривания и в теломерных регионах (Jia et al. 2004; Kanoh et al. 2005). При любом сценарии, Clr4-обусловленное метилирование H3K9 д. быть необходимо для стаблизиции ассоциации RITS ч хроматином, что затем ведет к рекрутированию RDRC, синтезу dsRNA и генерации siRNA (Fig. 5).

Clr4, как недавно было установлено, является компонентом мультипротеиновго комплекса, который содержит гетерохроматиновый белок Rik1, a Cullin E3 ubiquitin ligase, Cul4, и несколько др. белков (Hong et al. 2005; Horn et al. 2005; Jia et al. 2005; Li et al. 2005). Эти Clr4-ассоциированные белки еще больше подкрепляют связь между РНК и формированием гетерохроматина. Белок Rik1 является членом большого семейства β propeller WD repeat белков, которые участвуют в связывании ДНК и РНК. Члены этого семейства белков включают include the Cleavage Polyadenylation Specificity Factor A (CPSF-A)? участвующий в сплайсинге пре-мРНК, a DNA damage binding 1 (Ddbl) белок участвует в связывании поврежденной УФЛ ДНК. CPSF-A является особенно интересным т.к. Rik1 обладает сходными последовательностями с его предполагаемым РНК-связывающим доменом, участвующим в распознавании последовательностей полиаденилирования мРНК (Barabino et al. 2000). Белок Ddbl, подобно Rik1, является компонентом Cul4 E3 ubiquitin ligase комплекса и участвует в распознавании и репарации поврежденной УФЛ ДНК (Higa et aL 2003; Zhong et al. 2003). Интересная возможность заключается в том, что Rik1 действует способом. который сходен с CPSF-A и Ddbl, соединяясь с RNAi-генерируемыми продуктами во время сборки гетерохроматина (Fig. 5).

8 RNAI-mediated Chromatin and DNA Modifications in Arabidopsis

Механизм, с помощью которого RNAi производит гетерохроматиновые модификации у растений, сходен с механизмом у делящихся дрожжей, но имеются также и множество отличий. Наиболее важным отличием является то, что растения имеют метилированную ДНК во многих репрессивных областях гетерохроматина. В этом отношении они напоминают позвоночных, но отличаются от червей и Drosophila (Lippman and Martienssen 2004). 4 генетических скрининга по мутациям, которые имеют отношение к РНК-обеспечиваемому TGS, открыли мутации в H3K9-специфических HKMTs и в компонентах RNAi, но они также выявили необходимую функцию DNA methyltransferases, SWI/SNF ремоделирующие комплексы и новую РНК полимеразу (Baulcombe 2004). Эти скрининги описаны в деталях в Chapter 9, но здесь мы кратко сравним механизм у делящихся дрожжей и растений.

Каждый из скринингов по silencing мутациям использовал инвертированные повторы, введенные в транс-положение, чтобы индуцировать молчание эндогенных или трансгенных репортерных генов. Смягчение молчания указывает на мутации, которые возникли в необходимом компоненте пути молчания. Использованными эндогенными генами были PAI2 (участвует в биосинтезе аминокислот) (Mathieu and Bender 2004) и SUPERMAN (транскрипционный фактор, который регулирует развитие цветков) (Chan et al. 2004), а в качестве репортерных генов были использованы, управляемы или с помощью сильного вирусного промотора или сильного специфичного для семян промотора (Matzke et al. 2004). В каждом случае, промотор был предназначен к молчанию, в некоторых случаях вместе с остальной частью гена. Ряд генов был обнаружен благодаря этим скринингам (Figure 6) (see also Table 1 of Chapter 9). Идентифицирован только один RNAi мутант только в одном из скринингов и это был ген argonaute (AG04). Однако, три из скринингов открыли мутации в DNA methyltransferases, включая MET1 и CMT3. Третья DNA methyltransferase, родственная DNMT3 млекопитающих, открыта с помощью reverse генетики, т.к. её активность кодируется с помощью DRM1 и DRM2, двух перекрывающихся генов, неспособных быть детерминированными в одиночном мутантном скрининге (see Chapter 9). В самом деле, перекрывание может объяснить неспособность обнаружения дополнительных компонентов аппарата RNAi: напр., хотя DCL3 (DICER-LIKE 3) b RNA-DEPENDENT RNA POLYMERASE2 (RDRP) преимущественно необходимы для продукции 24-nt siRNA, ассоциированной с транспозонами и повторами, по крайней мере, два др. DCL гена у Arabidopsis могут замещать DCL3 до некоторой степени (Gasciolli et al. 2005).

Figure 6. Summary of RNAi and Chromatin Proteins Required for RNAi-mediated DNA and Histone Mcthytation fa Arabidopsis Synthesis of dsRNA from repeated DNA elements provides a substrate for Dicer-mediated cleavage and siRNA generation (DCL3 and other Dicers). RNA-directed RNA polymerases (RdRP, RdR2) and RNA polymerase IV (RNA Pol IV) may be directly involved in the synthesis of dsRNA or its amplification siRNAs then load onto Argonaute proteins (e.g., AG04), which is likely to help target cognate repeat sequences for DNA and H3K9 methylation in association with other factors.

Lh/ мутанты, обнаруженные при PAI2 скрининге, включают мутантов в гене H3K9 метилтрансферазы KYP/SUVH4 и в chromodomain-содержащем гене ДНК метилтрансферазы CMT3. Параллелизм в делящимися дрожжами в данном случае поразителен, т.к. комплекс RITS содержит как белок Argonaute, так и chromodomain белок Chpl, который зависит от H3K9 метилирования для свой ассоциации с хромосомой. В отличие от делящихся дрожжей, однако, потеря CMT3 или H3K9me2 не ведет к потере siRNA у Arabidopsis (Lippman et al. 2003), и пока не совсем ясно, действительно ли эти белки формируют комплекс с AG04. Существуют однако несколько иных H3K9-специфических HKMTs у Arabidopsis, по крайней мере, три из которых имеют генетическую функцию, так что перекрываемость также может быть частью объяснения (Ebbs et al. 2005).

Мутации в др. ДНК метилтрансферазах, MET1 и DRM1/2, в противопооложность мутациям в CMT3 ведут к потере накопления siRNA, по крайней мере, с субнабора транспозонов и с тандемных повторов, которые обычно дают siRNA, если они транскрибируются (Martienssen 2003). В этих случаях потеря siRNA коррелирует с потерей H3K9me2 (Cao et aL 2003; Lippman et al. 2003). Мутации в SWI2/SNF2 chromatin-ремоделирующей ATPase DDMl (decreased DNA methylation) также устраняют siRNA и накопление H3K9me2 с широкого круга транспозонов, хотя если siRNA сохраняется, то она является H3K9me2 (Lippman et al. 2003). Возможно, следовательно, что siRNA у растений связана с хромосомами посредством метилированных ДНК вместо или в дополнение к связыванию посредством метилированных гистонов, как в случае S. pombe (Fig. 7).

DDMl обладает изысканной специфичностью к транспозонам и повторам и д. каким-то образом распознавать их как являющихся отличными от генов. siRNA, вообще-то соединяющаяся с хромосомами посредством methyl-связывающих белков, д. обладать специфичностью, чтобы осуществлять подобное предназначение. Транспозоны и повторы у Arabidopsis являются главным источником 24-nt и некоторых 21-nt, siRNA, это согласуется с данной идеей (Lippman et al. 2004). Центромерные сателлитные повторы, которые располагаются в виде десятков тысяч тандемных копий на каждой из сторон каждой из центромер, также транскрибируются и превращаются с помощью RNAi (Fig. 6). Этот процессинг зависит от DCL3, RDR2 и DDMl. Молчание зависит также от H3K9me2 и CMT3. Однако, молчание более сложное, чем у делящихся дрожжей, т.к. ретротранспозоновые инсерции в повторы могут заставлять их молчать и это зависит от др. механизмов, включая MET1, DDMl и histone deacetylase HDA6 (May et al. 2005).

Как упоминалось ранее, у делящихся дрожжей субъединицы RNA pol II необходимы для молчания и продукции siRNA, это подтверждает идею, что аппарат RNAi- и chromatin-модификации рекрутируется на хромосомы с помощью синтезируемых транскриптов (Fig. 5). У Arabidopsis две субъединицы новой RNA polymerase (RNA pol IV) были выявлены в одном из 4-х упомянутых выше скринингов (Kanno et al. 2005), но впервые были изолированы как слабые мутации в PTGS, вместе с мутациями РНК-зависимой RNA polymerase (Herr et al. 2005). Пока неизвестно, какая матрица используется RNA pol IV, но предполагается, что это как метилированная ДНК (Onodera et aL 2005), так и двунитчатая РНК (Vaughn and Martienssen 2005). Толькол самые крупные субъединицы являются уникальными для RNA pol IV, которые, по-видимому, используют тот же самый набор из малых субъединиц, что и RNA pol II. Кроме того, SWI2/SNF2 ремодельеры хроматина, которые также были открыты в этих скринингах, могут изменять локальную структуру хроматина, чтобы усилить производительность РНК полимераз. Следовательно, возможно, что они облегчают транскрипцию посредством RNA pol IV (Kanno et al. 2004). Сходную роль можно предположить для DDMl, хотя потребность в

Figure 7. Hypothetical Models for the Role of RNA Pol IV In RNAi-directed DNA and/or Histone H3 Methylation (a) RNA pol IV transcribes methylated DNA; RdR2 synthesizes dsRNA using the RNA pol IV product. siRNAs then direct a methyltransferase complex to the chromosome, (b) RNA pol IV uses a dsRNA template synthesized by RdR2 to produce more siRNA template.

DDM1 (а также ремодельеров хроматина) в молчании транспозонов более сильная, чем таковая для RNA pol IV или др. SWI2/SNF2 белков.

Гены могут замалчиваться эпигенетически с помощью соседних транспозонов и важным примером у Arabidopsis является импринтированный гомеобоксный ген FWA (Kinoshita et al. 2004). Первые два экзона этого гена являются некодирующими и формируют тандемный повтор благодаря древней интеграции элемента SINE в этом сайте (Lippman et al. 2004). siRNAs с элемента SINE теряются у met1 (т.e., DNA methyltransferase) мутантов, а ген становится строго активированным в меристеме соцветия, приводя позднее к цветению. подобных фенотипов не наблюдалось у мутантов RNAi, даже если siRNA терялись, Вместо этого RNAi может играть роль в инициации молчания FWA, т.к FWA трансгены быстро становятся молчащими, когда впервые вносятся в растения и это молчание зависит от DCL3, RDR2 и AG04 (Chan et al. 2004). Молчание может затем поддерживаться с помощью метилирования ДНК, регулируемого за счет MET1. Сходным образом транспозоны, которые теряют siRNA у met1 мутантов, не могут быть принуждены к повторному молчанию при возвратных скрещиваниях, но те, которые не теряют siRNA могут замалчиваться посвторно, привлекая siRNA в возобновление молчания в цис-положении скорее, чем в транс (Lippman et al. 2003). Сходным образом, поздно цветущие FWA аллели стабильно наследуются в возвратных скрещиваниях после своего удаления из met1 или ddm1 мутантного фона, т.к. поддержание epialleles наследуемо (Soppe et al. 2000).

Наконец, возможно, что miRNA может управлять ДНК метилированием генов в некоторых условиях. DNA methylation of genes in some circumstances. мРНК с гена PHABULOSA направляется на расщепление с помощью miRNA 165 и 166 у Arabidopsis, a ген сам по себе метилируется ниже от области, которая соединяется (matches) с miRNA. Интересно, что эти match перекрывают соединения экзонов, так что сплайсированная РНК д. взаимодействовать с miRNA, если она ведет к метилированию (Bao et al. 2004). Однако, др. члены того же самого семейства генов не метилируются подобным образом и ни один из них не является геном мишенью для др. miRNA target genes (Martienssen et al. 2004; Ronemus and Martienssen 2005). Напротив, некоторые др. гены метилируются в геноме Arabidopsis и обычно на своём 3' конце, с помощью механизма, который нуждается в MET1, но не в DDM1 (Lippman et al. 2004; Tran et al. 2005). Остается посмотреть, участвует ли РНК в этом случае.

9 Conservation of RNAi-mediated Chromatin Modifications in Animals

Вообще-то наиболее изученные примеры эпигенетического молчания обнаружены у животных, включая Drosophila и C. elegans, а также мышей. Роль РНК и RNA interference в транскрипционном молчании и модификациях гетерохроматина, по-видимому, законсервирована у некоторых модельных животных, а также у простейших и растений. У Drosophila, и PIWI и PIWI класса гомолог Argonaute, Aubergine (Sting), необходимы для эпигенетическго и гетерохроматинового молчания (see also Chapter 5). Gypsy ретротранспозоны являются мишенями для молчания в клетках овариальных фолликулов и в гонадах самок с помощью самого PIWI (Sarot et al. 2004). Это обеспечивается с помощью гетерохроматинового гена Flamenco (с ещё неизвестной функцией), и нуждается в 5'UTR из Gypsy polyprotein гена. Обнаружение 25-27-nt малых РНК в этой области подтверждает, они появляются за счет RNAi-обеспечиваемого механизма. Cut-and-paste ДНК транспозоны также затрагиваются RNAi. Напр., определенные теломерные Р элементы (типа ДНК транспозона) могут супрессировать транспозицию куда-либо в геноме, если наследуются посредством зародышевой линии самок, приводя к строго репрессивному "цитотипу". Эта репрессия полностью зависит от PIWI гомолога Aubergine, а также от Swi6 гомолога HP1 (Reiss et aL 2004). Оэне все P-репрессивные цитотипы, такие как те, что обеспечиваются др., не теломерными P элементами, зависят от Aubergine или HP1.

Несцепленные трансгены у Drosophila замалчиваются пост-транскрипционно, если присутствуют во многих копиях (Pal-Bhadra et al. 1997, 2002). Молчание ассоциирует с большими количествами 21-nt siRNA и зависит от PIWI. Слившиеся трансгены также могут заставлять молчать др. др. транскрипционно, по способу, который нуждается в хроматиновом репрессоре Polycomb. Такое молчание не ассоциирует с повышенными уровнями siRNA с трансгенных транскриптов, но (в основном) зависят от PIWI. Вовлечение Polycomb в этом примере и HP1 в др. примерах PlWI-зависимого молчания связано с использованием RNAi пути и метилирования гистонов в процессе молчания. Тандемное расположение трансгенов также вызывает мозаичный эффект положения у Drosophila, и это variegation строго супрессируется с помощью мутаций в HP1, а также в piwi, aubergine, и предполагаемой RNA helicase Spindle-E (homeless) (Pal-Bhadra et al. 2004). Трансгены, вставленные в центрический гетерохроматин, также затрагиваются, м гетерохроматические уровни H3K9me2 редуцируются в spindle-E мутантных клетках. Эти наблюдения строго подтверждают роль как белков хроматина, так и компонентов пути RNAi молчания генов в гетерохроматине Drosophila.

В зародышевой линии самцов Drosophila гетерохроматиновые Suppressor of Stellate повторы {Su(ste)), локализованные на Y хромосоме, транскрибируются первыми на антисмысловой нити и затем на обеих нитях во время развития сперматоцитов, возможно благодаря инсерции соседнего транспозона (Aravin et aL 2001). Эти ядерные транскрипты необходимы для замалчивания смысловых транскриптов близко родственного Х-сцепленного Stellate гена, чья избыточная экспрессия приводит к дефектам сперматогенеза. Хотя гетерохроматиновые последовательности участвуют, молчание в этом случае возникает пост-трансприционно, оно ассоциирует с 25-27-nt siRNA и зависит от Aubergine и Spindle-E.

У C elegans описан пример TGS в соматических клетках. Он зависит от генов RNAi пути rde-1, dcr-1 rde-4 и rrf-1, а также гомолога HP1 и аппарата модификации гистонов (Grishok et aL 2005). Соматический гетерохроматин не является широко распространенным у C. elegans, но пример естественно возникшего RNAi-зависимого гетерохроматинового молчания был описан в зародышевой линии (Sijen and Plasterk 2003). Во время мейоза не спаренные последовательности, такие как X хромосома у самцов молчат за счет H3K9me2 и это молчание зависит от РНК-зависимой RNA polymerase (Maine et al. 2005; see Chapter 15), напоминая мейотическое молчание не спаренной ДНК (MSUD) у Neurospora (see Shiu et al. 2001; Chapter 6). Однако, др. компоненты RNAi аппарата ещё не обнаружили свое участие в этом процессе и неизвестно, связано ли это механистически с RNAi-обеспечиваемой сборкой гетерохроматина у делящихся дрожжей.

Наконец, подобно Drosophila, клетки млекопитающих лишены генов, связанных с РНК-зависимыми RNA polymerases, обнаруженными у растений, червей и грибов. Тем не менее антисмысловая РНК участвует в большинстве широко изученных эпигенетических феноменов, импринтинге и Х инактивации (see Chapters 19 and 17, respectively). В случае инактивации Х 17-kb сплайсированная и полиаденилированная некодирующая РНК, известная как Xist, необходима для молчания неактивной Х хромосомы, с которой она экспрессируется. Напротив, Xist сама молчит на активной Х хромосоме, процесс, который зависит частично от антисмысловой РНК Tsix. Молчание сопровождается модификациями гистонов, ассоциированных с вышестоящими регионами хроматина, которые помечены H3K9me2 и H3K27tae3 (see Chapter 17). Молчание др. импринтированных локусов у мышей, включая Igf2r и Dtkl-Gtl2 регион, также поддерживается за счет антисмысловых транскриптов с отцовского и материнского аллеля, соотв. В случае Dlkl-Gtl2 эта некодирующая РНК специфически превращается в miRNA, которая находит антисмысловые транскрипты с отцовского аллеля, кодирующего sushi (gypsy) класса ретротранспозон (Davis et al. 2005).

Хотя параллели с прямой и обратной транскрипцией с гетерохроматиновых повторов у S. pombe многочисленны, но роль самой RNAi в импринтинге и Х инактивации пока ускользает. Тем не менее внесение siRNA в линию раковых клеток может приводить к маркированию хроматина с помощью H3K9me2 на гомологичных промоторах (Ting et al. 2005). В некоторых случаях это может быть также результатом метилирования ДНК (Morris et aL 2004), вообще-то обеспечиваемым прямым связыванием малых РНК с ДНК-метилтрансферазами и DNA methylation binding белками (Jeffery and Nakielny 2004). Наконец, нокаут в клеточных линиях млекопитающих приводит к дефектам сегрегации хромосом, напоминающим те, что обнаружены у мутантных делящихся дрожжей, которые сопровождаются изменениями морфологии гетерохроматина, экспрессии сателлитных повторов и неправильной локализацией cohesin (Fukagawa et al. 2004; Kanellopoulou et aL 2005).

10 Concluding Remarks

The possibility that genes may be regulated by small RNA molecules was suggested over 40 years ago (Jacob and Monod 1961), as well as the notion that "control RNA" might be related to repeats (Britten and Davidson 1969). Since the identification of the lambda and lac repressors as site-specific DNA-binding proteins in Escherichia coli and the infecting bacteriophage lambda (Gilbert and Muller-Hill 1966; Ptashne 1967), studies of gene regulation have focused almost exclusively on the role of nucleic-acid-binding proteins as specificity factors. The discovery of small RNA molecules as specificity agents in diverse RNA silencing mechanisms now clearly establishes a role for RNA as a sequence-specific regulator of genes and their RNA products. Studies in fission yeast, Arabidopsisy and other model organisms have revealed a surprisingly direct role for small RNAs in mediating epi-genetic modifications of the genome that direct gene silencing and contribute to heterochromatic domains necessary for genome stability and nuclear division. Many important mechanistic questions remain at large, and future studies are likely to provide more surprises about how RNA regulates gene expression.

RNAi and Heterochromatin AssemblyMartinssen R., Moarch D. Epigenetics - Cold Spring Harbor (N.Y) 2007. - Chapt.8, P. 152-166

RNAi and Heterochromatin Assembly
Martinssen R., Moarch D.
Epigenetics - Cold Spring Harbor (N.Y) 2007. - Chapt.8, P. 152-166