Участие в Передаче Сигналов

Principles of bioactive lipid signalling: lessons from sphingolipids Yusuf A. Hannun & Lina M. Obeid Nature Reviews Molecular Cell Biology 9, 139-150 (February 2008) \| doi:10.1038/nrm2329
It has become increasingly difficult to find an area of cell biology in which lipids do not have important, if not key, roles as signalling and regulatory molecules. The rapidly expanding field of bioactive lipids is exemplified by many sphingolipids, such as ceramide, sphingosine, sphingosine-1-phosphate (S1P), ceramide-1-phosphate and lyso-sphingomyelin, which have roles in the regulation of cell growth, death, senescence, adhesion, migration, inflammation, angiogenesis and intracellular trafficking. Deciphering the mechanisms of these varied cell functions necessitates an understanding of the complex pathways of sphingolipid metabolism and the mechanisms that regulate lipid generation and lipid action. Рис.1. \| An overview of the roles of sphingolipids in biology. Рис.2. \| Sphingolipid metabolism and interconnection of bioactive sphingolipids. Рис.3. \| Parallel networks of sphingolipid signalling. Рис.4. \| Transport and transbilayer movement of bioactive sphingolipids. Рис.5. \| Examples of ceramide signalling pathways and their role in stress responses. Рис.6. \| SK–S1P receptors and signalling. Box 1 \| Compartmentalization of pathways of sphingolipid metabolism Box 2 \| Unique and particular properties of bioactive lipids DATABASES OMIM Niemann–Pick disease UniProtKB S1P lyase alkaline SMase SK1 SK2 acid SMase neutral SMase CERT PKB PKCζ" PKCδ FURTHER INFORMATION Yusuf A. Hannun's homepage Lina M. Obeid's homepage Ceramide web site	Хотя концепция 'bioactive lipids' - широко определяется как изменения в уровнях липидов, которые вызывают функциональные последствия - прошли десятилетия в процессе её создания и только начинаем извлекать доход в последние 20 лет и в 21-м веке она становится в центр исследований клеточной биологии. Запоздалое признание имеет свои корни в более ранних априорных представлениях об исключительной роли липидов в энергетическом метаболизме и в структуре мембран, это предупредило более широкое толкование функциональной роли липидов. Эти препятствия в первую очередь возникли из-за множества врожденных трудностей работы с липидами, их энзимами и их мишенями. В своем пионерском исследовании в 1950s, Hokin and Hokin наблюдали быстрый оборот inositol phospholipids на срезах поджелудочной железы, который стимулировался с помощью acetylcholine¹. Однако, значение этого наблюдения для клеточной функции оставалось относительно невостребованным в течение нескольких лет, до тех пор, пока diacylglycerol (DAG) и inositol-1,4,5-trisphosphate (Ins(1,4,5)P3) не оказались задействованы в специфической регуляции protein kinase C (PKC) и в высвобождении calcium², соотв., что приводило к различным клеточным реакциям. Концептуально, демонстрация прямой активации PKC с помощью липида DAG сцементировала идею, что липид (роль которого уже была установлена в промежуточном обмене веществ) может регулировать передачу клеточных сигналов и возвестила эру биоактивных липидов. Исследования последних 40 лет также установили eicosanoids (и др. продукты метаболизма arachidonic кислоты) в качестве ключевых меж- и внутриклеточных липидных сигнальных молекул, которые прежде всего участвуют в обеспечении или разрешении воспалительной реакции³. Дальнейшие исследования показали, что большинство минорных продуктов метаболизма inositol phospholipid, таких как phosphatidylinositol-3,4,5-trisphosphate (PtdIns(3,4,5)P3), также служат в качестве ключевых промежуточных образований в передаче клеточных сигналов. Др. производные glycerolipid регуляторные молекулы включают phosphatidic acid (PA), monoacylglycerols и anandamide (лиганды кандидаты для cannabinoid рецепторов), lyso-phosphatidic acid и platelet activating factor (PAF). Др. группой биоактивных липидов, которая вышла из тени в последние два десятилетия, являются sphingolipids. Первым из них был идентифицирован sphingosine, который обнаруживает плейотропные эффекты на протеин киназы и др. мишени. Sphingosine и родственный ему sphingoid bases играют роль в регуляции актинового цитоскелета, эндоцитоза, клеточного цикла и апоптоза⁴ (Fig. 1). Ещё больший упор был сделан на сфинголипидах ceramide и sphingosine-1-phosphate (S1P). Ceramide обеспечивает большинство реакций на клеточные стрессы, включая регуляцию апоптоза⁵ и клеточного старения⁶, тогда как S1P играет критическую роль в клеточной жизнеспособности, миграции клеток и воспалении⁷ (Fig. 1). Недавние добавления к семейству биоактивных сфинголипидов включают ceramide-1-phosphate (C1P, который играет роль в воспалении и переносе пузырьков^8-10), glucosylceramide (который участвует в post-Golgi трафике и резистентности к лекарствам^11,12), lyso-sphingomyelin и dihydroceramide. В дополнение к огромному количеству клеточных процессов, с которыми ассоциируют сфинголипиды, дальнейшие уровни сложности передачи сигналов sphingolipid только начинают расшифровывать. Эта сложность возникает в результате метаболического взаимодействия биоактивных липидов (Fig. 2), так что изменение одного липида вызывает метаболические 'ripple' эффекты с функциональными последствиями. Более того, энзимы липидного метаболизма (вход в эти пути) являются часто гидрофобными мембранными белками, которыми пренебрегли в простых биохимических и клеточных исследованиях. Варьирующие биофизические свойства регуляторных липидов также вызывают осложнения, связанные с их субклеточной локализацией и механизмами действия. Следовательно, всеобъемлющее понимание биоактивных сфинголипидов (и др. липидов в целом) нуждается, по крайне мере, в двух уровнях исследований. На базовом уровне существует необходимость вычленения различных специфических механизмов, с помощью которых метаболизм сфинголипидов регулируется и молекулярные механизмы, с помощью которых продукты биоактивных липидов передают свои соотв. сигналы. На продвинутом и липид-специфическом уровне такое понимание нуждается в знании метаболической организации энзимов метаболизма сфинголипидов и их взаимоотношений, субклеточной и субмембранной локализации липидами опосредованных путей, метаболической трансформации биоактивных липидов и интеграции или координации всех реакций. Целью обзора является информирование о базовой организации и принципах обеспечиваемой сфинголипидами клеточной регуляции и предоставление современного понимания о сигнальных путях специфических сфинголипидов. Introducing the sphingolipid family Метаболизм сфинголипидов появляется в основном у эукариот, но обнаружен также род бактерий Sphingomonas. Пути метаболизма сфинголипидов обладают уникальной метаболической точкой вхождения (serine palmitoyl transferase; SPT), которая формирует сначала сфинголипид на de novo пути, и уникальной точкой выхода, S1P lyase, которая разрывает S1P на non-sphingolipid молекулы. Множественные метаболические ступени в промежутке составляют очень сложную сеть, которая связывает метаболизм многих сфинголипидов (Fig. 2). В этой сети ceramide (и в меньшей степени dihydroceramide) может рассматриваться как метаболический узел (hub), т.к. он занимает центральную позицию в биосинтезе и катаболизме сфинголипидов. Короче, сфинголипиды синтезируются de novo из serine и palmitate, которые конденсируются, чтобы сформировать 3-keto-dihydrosphingosineблагодаря дей2ствию SPT^13,14.В свою очередь, 3-keto-dihydrosphingosine редуцируется до dihydrosphingosine, вследствие ацетилирования с помощью (dihydro)-ceramide synthase (известной также как Lass или CerS)¹⁵. Ceramide формируется с помощью десатурации dihydroceramide¹⁶ (Fig. 2). На пути биосинтеза sphingolipid (Fig. 2), ceramide может быть фосфорилирован с помощью ceramide kinase¹⁷, гликозилирован с помощью glucosyl или galactosyl ceramide synthases¹⁸, или может захватывать головную группу phosphocholine от phosphatidylcholine (PC) при биосинтезе sphingomyelin (SM) благодаря действию SM synthases¹⁹, которая также служит для генерации DAG из PC. Разрушение комплекса сфинголипидов (Fig. 2) происходит благодаря действию специфических hydrolases, приводя к образованию glucosylceramide и galactosylceramide. Затем специфические β-glucosidases и galactosidases гидролизуют эти липиды, чтобы регенерировать ceramide^{20, 21}. Разрушение SM катализируется с помощью одной из нескольких sphingomyelinases (SMases)²². Они включают acid SMase, neutral SMases and alkaline SMase. Ceramide может быть разрушен с помощью одной из многих ceramidases^{23, 24}, приводя к образованию sphingosine, который. по-видимому, приобретает одну из двух судеб. Sphingosine может быть (спасен) 'salvaged' или подвергнут рециклингу на sphingolipid путях (Box 1), или он может быть фосфорилирован одной из двух sphingosine kinases²⁵, SK1 и SK2 (Fig. 2). Продукт S1P может быть дефосфорилирован, чтобы регенерировать sphingosine благодаря действию специфических внутриклеточных S1P phosphatases²⁶ и возможно благодаря действию не-специфических lipid phosphate phosphatases^{27, 28}. Альтернативно, S1P lyase может необратимо расщеплять S1P, чтобы генерировать ethanolamine phosphate и hexadecenal (который, в свою очередь, может редуцировать palmitate и впоследствии повторно инкорпорировать в пути метаболизма липидов)²⁹. Complexities of sphingolipid signalling В осмыслении передачи клеточных сигналов в основном преобладает каноническая парадигма cyclic АМФ, при этом существует путь линейной передачи сигналов, в котором участвуют рецепторы, циклаза, цАМФ и цАМФ-зависимая протеин киназа, и в которой цАМФ выполняет сигнальную функцию. Однако, передача сигналов sphingolipid проявляется дополнительными слоями сложности по сравнению с путем цАМФ. В отличие от относительной простоты биохимически изолированного цАМФ пути, энзимы липидного метаболизма интимно связаны др. с др., генерируя взаимосвязанную сеть (Fig. 2), которая служит для регуляции не только уровней индивидуальных биоактивных липидов, но и также их метаболического взаимопревращения. Более того, имеются множественные пути, которые могут оперировать параллельно (Fig. 3). Также в отличие от растворимых молекул цАМФ, биоактивные сфинголипиды обладают гидрофобными свойствами; следовательно, физиологическое окружение биоактивных липидов по большей части ограничено биологическими мембранами. Итак, критический и уникальный набор свойств действует в клетке, чтобы предопределить субклеточную локализацию sphingolipid-опосредуемых путей и и транспорта биоактивных липидов поперек и между мембранами. The interconnectivity of sphingolipid metabolism. Беспрецендентная сложность взаимных соединений сфинголипидов позволяет клеткам оркестрировать клеточные реакции путем регуляции взаимных превращений сфинголипидов. Напр., активация SMase генерирует ceramide в качестве непосредственного липидного продукта. Однако, последующее действие ceramidase, ceramide kinase, SM synthase или glucosylceramide synthase может в принципе превращать ceramide сигнал в один из тех, обеспечивается с помощью sphingosine (и следовательно, S1P), C1P, DAG или glucosylceramide, соотв.(Fig. 2). Интересно, что клеточные уровни др. биоактивных сфинголипидов обнаруживают те же сценарии с высоким сходством³⁰. Напр., в большинстве типов клеток SM присутствует в концентрациях, которые на порядок величин выше, чем таковые для ceramide; следовательно, незначительные изменения в SM могут приводить к выраженным изменениям в ceramide. Кроме того, ceramide часто обнаруживается в концентрациях, которые больше чем на порядок величин выше концентраций sphingosine. Следовательно, непосредственный гидролиз лишь 3-10% вновь образованного ceramide может удваивать уровни sphingosine. Сходным образом фосфорилирование 1-3% sphingosine может удваивать уровни S1P (Fig. 1). Учитывая эти метаболические данные, становится возможным, что когда энзимы сфинголипидов участвуют в процессе, то непосредственный продукт этого энзима может не быть фактическим сигнальным эффектором. Следовательно, важно определить, какой липидный продукт или субстрат в действительности обеспечивает сигнал. Напр., с помощью участия SMase или SKs в клеточно специфических реакциях нельзя непосредственно придти к выводу, что это является ceramide или S1P, который непосредственно обеспечивает такую функцию. К счастью, сегодня доступны инструменты и подходы к этим процессам. Это высоко чувствительная масс спектрометрия для анализа сфинголипидов^30,31, молекулярные инструменты, которые производят почти полную молекулярную идентификацию всех известных энзимов метаболизма сфинголипидов, и RNA interference, которая успешно используется в исследованиях клеточной биологии метаболизма и функции липидов. Parallel networks of sphingolipid signalling. Множественность некоторых путей метаболизма сфинголипидов создает др. уровень сложности, который накладывается на основную кальку (blueprint) метаболизма сфинголипидов, обсужденного выше. Это лучше всего иллюстрируется на примере ceramide synthases¹⁵ (Fig. 3). Шесть индивидуальных ceramide synthases катализируют образование dihydroceramides или ceramides (в зависимости от того является ли субстратом dihydrosphingosine или sphingosine, соотв.). Важно, что эти ceramide synthases обнаруживают характерные предпочтения к различным fatty acyl-CoA субстратам и, следовательно, они генерируют разные ceramides с уникальными N-сцепленными жирными кислотами. Разные ceramides могут локализоваться в самостоятельных субкомпартментах и могут выполнять самостоятельные функции. В качестве др. примера , acid SMase и neutral SMase могут действовать на SM, чтобы генерировать ceramide. Однако, эти два энзима регулируются по-разному, локализуются в отдельных субклеточных компартментах (Box 1) м могут даже генерировать ceramides с разными молекулярными свойствами. Subcellular localization of bioactive sphingolipids. Большинство энзимов метаболизма сфинголипидов обнаруживает специфическую субклеточную локализацию (Box 1), и это оказывает выраженные эффекты на передачу сигналов и регуляторные функции генерируемых сфинголипидов. Напр., acid SMase локализуется преимущественно в эндолизосомном пути, но при определенных условиях может также перемещаться на плазматическую мембрану, преимущественно на наружный листок³². Neutral SMase2, по-видимому, локализуется на внутреннем листке плазматической мембраны. SK1 и SK2 , по-видимому, действуют преимущественно на sphingosine субстрат, который располагается в мембранах, которые необходимы для транслокации SK энзимов из их цитозольного компартмента на плазматическую мембрану (и др. мембраны) и для соединения с анионными липидами³³. Поэтому очень возможно, что SK энзимы обладают множественными субклеточными локализациями, что и диктует разные функциональные реакции. Эти характеристики в купе с плохой растворимостью липидов (Box 2) в клетках, накладывают определенные ограничения на субклеточную локализацию биоактивных липидов. В отсутствие специфических механизмов транспорта этих липидов, места генерации биоактивных липидов и диктуют их место действия, если не доказано иное. Биоактивные сфинголипиды (и липиды в целом) могут быть подразделены на отдельные классы, которые могут отличаться по своим биофизическим свойствам (Box 2). Некоторые биоактивные липиды, такие как C1P и phosphatidylinositol-3-phosphate, несут ионные заряды при нейтральном pH и содержат две гидрофобные цепочки. Эти липиды скорее всего располагаются в компартменте своего возникновения и вряд ли проникают спонтанно через бислой. Вторая группа, которая включает ceramide и DAG, представлена нейтральными гидрофобными молекулами, которые также ограничены компартментами своего формирования, но они могут легко проникать (flip-flop) через мембраны³⁴. Третья группа представлена одноцепочечными липидами и она включает sphingosine, S1P, lyso-sphingomyelin и lyso-phosphatidic acid. Эти молекулы обладают достаточной растворимостью в жидкости, чтобы перемещаться между мембранами. Напр., было подсчитано, что ~70% остатков sphingosine располагается в мембранах при физиологических условиях pH, а остальные 30% растворимы³⁵. Эти молекулы могут, следовательно, быстро уравновешиваться в мембранах. Более важно, учитывая их amphipathic природу (т.е. растворимость как в воде, так и органических растворителях), что эти молекулы могут обладать surfactant активностью. Следовательно, не является сюрпризом, что их клеточные уровни обнаруживают тенденцию находиться среди наинизших из всех биоактивных липидов. Transport and flipping of bioactive sphingolipids. Для биоактивных сфинголипидов, чтобы вызвать функциональные реакции, они д. быть доступны для взаимодействия с соотв. непосредственными медиаторами. Субклеточное ограничение биоактивных сфинголипидов и некоторых их мишеней ставят некоторые вопросы, как взаимодействующие партнеры способны встречаться (Fig. 4). Напр., S1P возможно генерируется на внутреннем листке плазматической мембраны в ответ на действие tumour necrosis factor-a (TNFa) и др. агонистов^{36, 37}. Всё же очевидно, что он достигает наружного листка плазматической мембраны, чтобы взаимодействовать с S1P рецепторами (S1PRs)³⁸. Соответственно, два члена сверхсемейства ABC транспортеров , как было предположено, регулируют транспорт S1P (Fig. 4). Cystic fibrosis transmembrane regulator (CFTR) участвует в интернализации S1P из плазматической мембраны³⁹, тогда как ABCтранспортер ABCC1 , как было недавно установлено, облегчает утечку S1P⁴⁰. Ceramide transfer protein CERT , как было установлено, влияет на транспорт ceramide с места его синтеза в эндоплазматическом ретикулеме (ER) в аппарат Golgi и необходим для синтеза SM (но не для синтеза glucosylceramide)⁴¹ (Box 1). Учитывая взаимодействие CERT с phosphatidylinositol phosphates и его потенциал регуляции с помощью фосфорилирования, эта ступень метаболизма ceramide может регулироваться с помощью путей метаболизма inositol липида и с помощью протеин киназ⁴² и фосфатаз. Как нейтральный липид, ceramide, по-видимому, может flip-flop через мембраны с непринужденностью, и в самом деле, исследования на модельных мембранах и мембранах эритроцитов подтверждают это предположение³⁴ (Fig. 4). Однако, неясно может ли ceramide, который формируется на более сложных биологических мембранах проникать с такой же эффективностью или организация ceramide в микродомены (существуют специализированные липидные домены в плазматической мембране; see the review by van Meer and colleagues in this issue) может ограничивать перемещение ceramide с наружного листка на внутренний листок. Ограничение flipping (или flopping со внутреннего на наружный листок) д. оказывать значительные эффекты на сигнальные функции ceramide. Напр., ceramide, который генерируется с помощью acid SMase в наружном листке, может осуществлять иные функции по сравнению с ceramide, который генерируется на внутреннем листке с помощью neutral SMase2 (Ref. 22). Итак, биофизические и метаболические характеристики, рассмотренные выше, вносят уровень сложности, который отсутствует в др. сигнальных путях. Имеется, по крайней мере, 26 самостоятельных энзимов. которые действуют на ceramide как их субстрат или продукт и которые, следовательно, обладают потенциалом регулировать уровни ceramide. Эти энзимы обнаруживают специфические и варьирующие субклеточные локализации. Более того, ceramide сам является семейством тесно родственных молекул с, по крайней мере, 50 самостоятельными молекулярными разновидностями, которые могут быть различены с помощью их acyl цепочек, hydroxylations и desaturation (Fig. 3). Следовательно, уровни ceramide могут регулироваться в разных компартментах с помощью самостоятельных механизмов в разные времена. Mechanisms of action: ceramide and S1P Понимание, как биоактивные липиды действуют и как они передают сигналы, требует выяснения механизмов, с помощью которых эти липиды действуют. Можно представить себе два общих механизма действия липидов: межлипидные взаимодействия, с помощью которых кандидаты биоактивных липидов влияют на структуру мембраны и/или взаимодействие мембранных белков внутри мембранного бислоя (see the review by van Meer and colleagues in this issue); или взаимодействия между липидом и белком, с помощью которых изменения в липидах модулирую функцию белков мишеней, которые взаимодействуют специфически с кандидатами биоактивных липидов. Физиологические уровни биоактивных липидов четко влияют (или даже диктуют) механизмы их действия. Следы липидов, таких как S1P, взаимодействуют с рецепторами высокого сродства, которые способны чувствовать их низкие уровни. Липиды, которые обнаруживают промежуточные мембранные концентрации, такие как ceramide или DAG (которые часто составляют 0.1-1.0% от общих мембранных липидов), действуют на мишени с промежуточным сродством. Напротив, очень трудно предвидеть, сколько обильные липиды, такие как SM, могут иметь специфических мишеней, т.к. сродство взаимодействий должно быть низким. Это не исключает белки, которые могут соединяться с этими липидами с высоким сродством, но в таком случае такие белки не должны быть способны ощущать изменения в уровнях этих липидов. Наивысшие уровни таких липидов, однако, придают им способность изменять общие свойства и субструктуру мембран, если и когда их уровни меняются. Для ceramide и S1P, внимание сфокусировано на определении действия непосредственных белковых мишеней. Некоторые белки кандидаты, как было показано. взаимодействуют с ceramide in vitro и в клетках (Fig. 5). Сюда входят ceramide-activated Ser-Thr phosphatases (CAPPs), такие как PP1 и PP2A, которые связывают ceramide in vitro⁴³. Они умеренно активируются с помощью ceramide и обнаруживают предпочтение к естественным стереоизомерам. Исследования на клетках связаны с действием ceramide на CAPPs и индукцией дефосфорилирования белка. Напр., ceramide-индуцируемые агенты (такие как TNFa или загрузка клеток palmitate) индуцируют дефосфорилирование продукта гена retinoblastoma RB44, PKCalpha45, protein kinase B (PKB or AKT⁾⁴⁶ и др. белков зависимым от ceramide способом. Однако, чтобы продемонстрировать прямую клеточную активацию фосфатаз с помощью ceramide, необходимы экспериментальные доказательства (напр., наблюдение транслокации). Определение специфических сайтов связывания этого процесса активации может привести к улучшению понимания того, как эти взаимодействия происходят и могут также предоставить специфические инструменты для изучения этих путей. Кроме того, как было показано, ceramide активируют PKCζ^{47, 48}, киназу KSR49 и cathepsin D50. Последний, как полагают, является специфической мишенью для лизосомно генерированных ceramide и может связывать действие лизосомной acid SMase с митохондриальным путем апоптоза⁵⁰. Активация PKCζ с помощью ceramide участвует в регуляции мембранного потенциала, ингибировании AKT и про-апоптических функциях^{48, 51}. S1P является одним из наиболее растворимых сфинголипидов и присутствует в низких наномолярных концентрациях в клетках (но в высокой наномолекулярной концентрации в сыворотке, где он ассоциирует с липопротеинами и альбумином⁵²). Он взаимодействует с S1PRs⁵³, который является G protein-coupled receptors (GPCRs) высокого сродства и и является единственным из известных рецепторов для S1P , которые были идентифицированы. Пять S1PRs (S1PR1-5) обнаруживают избирательную тканевую экспрессию, это является критическим для их биологических функций и используют хорошо-известные пути GPCR внутриклеточной передачи сигналов, чтобы обеспечить свои специфические эффекты (Fig. 6). S1P кроме того осуществляет S1PR-независимые действия внутриклеточно, такие как индукция высвобождения кальция⁸, хотя их механизмы остаются неизвестными. Т.к. внутриклеточная молекулярная мишень для S1P не идентифицирована, то его внутриклеточная роль остается предметом спекуляций и неослабного интереса. Sphingolipid-mediated cell regulation Основное внимание будет уделено трем специфическим путям передачи сигналов ceramide и пути SK1-S1P в воспалении и ангиогенезе в порядке внесения ключевых игроков и предоставления некоторого представления о наших знаниях сфинголипидами обусловленной клеточной регуляции. De novo synthesis of sphingolipids and stress responses. Путь синтеза de novo биосинтеза сфинголипидов, который находится в ER, проявился в качестве ключевого механизма в клетках эукариот для регуляции уровней ceramide и др. сфинголипидов. В клетках млекопитающих синтез de novo ceramide усиливается в ответ на некоторые хемотерапевтические агенты, такие как etoposide и daunorubicin^{54, 55}, и др. индукторы апоптоза, такие как стимуляция B-клеточных рецепторов⁵⁶. Про-апоптический FAS путь стимулирует синтез de novo , который, как было установлено, активирует PP1. Это приводит к дефосфорилированию SR белков, которые являются регуляторами сплайсинга РНК, функция которого регулируется с помощью фосфорилирования⁵⁷. Это склоняет баланс про- и анти-апоптических мРНК в пользу про-апоптических caspase-9 и BCL-X⁵⁷. Интересно, что путь de novo метаболически приводится в движение в ответ на изменения в концентрациях serine и palmitate, т.к. SPT обладает значением K_m к двум субстратам, которые находятся в пределах их обычных внутриклеточных концентраций⁵⁸ (Fig. 1). В самом деле. недавнее исследование на дрожжах продемонстрировало, что тепловой стресс индуцирует острый приток serine в ER, который управляет синтезом de novo ⁵⁹. Активация этого пути у дрожжей приводит к временному накоплению sphingoid bases, сопровождаемому накоплением sphingoid base phosphates, а затем и ceramide. Многочисленные исследования показали, что sphingoid bases, которые генерируются на этом пути, обеспечивают специфические реакции на тепловой стресс⁶⁰, включая регуляцию пищевой permeases⁶¹, цитоскелетных изменений⁶², ареста клеточного цикла⁵⁹ и трансляции РНК⁶³. Регуляция синтеза ^{de novo} с помощью palmitate может играть ключевую роль в диабете и метаболическом синдроме (Fig. 5a). Появившиеся доказательтсва указывают на то, что нагрузка palmitate ведет к накоплению ceramide, который активирует PP2A и приводит в результате к дефосфорилированию и инактивации AKT⁴⁶, ключевого медиатора в передаче сигналов инсулина и метаболического контроля. Ceramide могут оказывать дополнительные эффекты на AKT и на др. мишени, которые совместно вызывают ухудшение чувствительности к инсулину и гибель клеток островков^{64, 65} (процесс наз. lipoptosis) и может вносить вклад в др. диабетические осложнения. Недавнее исследование на мышах показало, что ингибирование синтеза ceramide, или с помощью фармакологического воздействия или генетических манипуляций, предупреждает резистентность к инсулину, индуцируемую жирными кислотами, ожирением или глюкокортикоидами⁶⁵. Хотя значение этого пути сегодня оценено по достоинству, некоторые ключевые вопросы ещё необходимо решить. Повышенный отток через de novo путь не обязательно ведет к накоплению ceramide, независимо от того, будет ли в дальнейшем метаболическая трансформация (напр.. в SM, C1P или glucosylceramide) ограничена или лимитирована (как это было продемонстрировано в некоторых случаях апоптоза, при которых SM synthase и glucosylceramide synthase (GCS) супрессируются). Также неясно, если путь de novo действует исключительно в ER или также на др. ассоциированных с ER мембранах (таких как, ассоциированные с митохондриями мембраны или ядерные мембраны), то локализация пути de novo возможно должна быть связана с регуляцией ER стрессов, но это ещё следует оценить. Acid SMase and the salvage pathway in stress signalling. Множественные стрессовые стимулы, такие как УФЛ и ионизирубющая радиация, связывание death рецепторов и химиотерапевтические агенты (включая platinum, paclitaxel и histone deacetylase ингибиторы) как было установлено, активируют acid SMase, обычно в течение нескольких минут клеточной стимуляции (Fig. 5b). Это было продемонстрировано прежде всего с помощью обнаружения повышенной активности in vitro энзима и это явилось указанием на некоторые пост-трансляционные модификации acid SMase. В немногих исследованиях активация SMase, как было установлено, сопровождается транслокацией на плазматическую мембрану и одновременной генерацией ceramide⁶⁶. Помимо этих корреляций проведено несколько исследований, чтобы получить прямые указания участия acid SMase в генерации ceramide и нижестоящих реакциях или благодаря использованию генетический мутаций энзима (полученных от пациентов с Niemann-Pick disease)⁶⁷, нокаутных мышей, которые лишены acid SMase⁶⁸, small interfering (si)RNA-обусловленного нокдауна⁶⁹ или фармакологических ингибиторов⁷⁰, таких как один из tricyclic amines, desipramine или imipramine. Однако, такие фармакологические исследования необходимо интерпретировать с осторожностью, т.к. эти ингибиторы имеют и др. мишени, включая acid ceramidase⁷¹. Нокаут или нокдаун гена четко показали участие acid SMase в обеспечении апоптической и стрессовой реакций на ионизирующую радиацию и УФЛ^68,72, и на низкие концентрации FAS лигандов⁷³. Однако, др. исследования демонстрируют повышенную чувствительность к FAS, но пониженную митотическую стимуляцию Т клеток у нокаутных мышей⁷⁴. Механизмы, которые участвуют в активации acid SMase в ответ на стрессовые агенты, определены плохо. Недавние результаты показали, что энзим активируется с помощью реактивных видов кислорода и в частности, с помощью nitrosative стресса⁷⁵. Др. недавние исследования предоставили доказательства регуляции acid SMase с помощью фосфорилирования в ответ на активацию PKCδ, и это участвует в обеспечении эффектов УФЛ на активацию acid SMase⁷². Эти исследования только начинают предоставлять информацию о важной механистической связи между путями стрессовых реакций, которые прежде рассматривались как самостоятельные (acid SMase, nitrosative stress иPKCδ). Ceramide, которые генерируются с помощью acid SMase, как полагают, располагаются или в лизосомах или на плазматической мембране (Box 1). Оба места правдоподобны, т.к. acid SMase, как убедительно было показано, существует в обоих субклеточных сайтах. В лизосомах ceramide, как было установлено, взаимодействуют непосредственно с protease cathepsin D и чтобы активировать её, возможно вызывают расщепление и активацию про-апоптического белка BID⁵⁰ (Fig. 5b). На плазматической мембране действие ceramide менее определено, но предполагается, что они обеспечивают capping рецепторов (образование микроскопических кластеров) и/или образование микродоменов⁷⁰. В качестве иллюстрации сложной природы метаболизма ceramide, недавно было показано, что активация acid SMase в ответ на форболовые эфиры также ведет к сопутствующему увеличению формирования ceramide за счет пути переработки (или рециклинга) ⁷⁶. На этом пути sphingosine превращается в ceramide благодаря действию ceramide synthases (Box 1). Это может объяснить некоторые кажущиеся расхождения в литературе, где как acid SMase, так и de novo путь (базируясь на ингибировании ceramide synthase с помощью fumonisin B1) участвуют в некоторых клеточных реакциях (напр., to doxorubicin). Важно, что fumonisin B1 ингибирует ceramide synthases и невозможно отличить de novo синтез от рециклинга (Box 1). Следовательно, можно предположить в этих случаях, что acid SMase связана с рециклингом. Neutral SMase2 in cytokine action. Многие исследования связаны с активацией neutral SMase на действие некоторых внеклеточных цитокинов и стрессовые реакции⁷⁷, а список индукторов обнаруживает значительное перекрывание с активаторами acid SMase. Однако, прогресс в молекулярном вычленении путей, обеспечиваемых neutral SMase, только начат вследствие недавней идентификации neutral SMase-2 (nSMase2) в качестве настоящей sphingomyelinase^{78, 79}. Важно. что нокаут энзима, как было установлено, ведет к низкому росту, а естественные мутации у nSMase2 (fro/fro мышей) приводят к ломкости костей^{80, 81}. nSMase2 has been implicated in several cell responses. Она остро активируется с помощью цитокинов TNFa и interleukin (IL)-1 и, как было показано, обеспечивает эффекты IL-1 на передачу сигналов (фосфорилированием c-Jun N-terminal kinase (JNK))⁸², и эффекты TNFa на индукцию генов (в том числе и endothelial nitric oxide synthase (eNOS))⁸³. Энзим, как было установлено, индуцируется во время старения гепатоцитов мышей и обусловливает снижение чувствительности гепатоцитов на передачу сигналов IL-1⁸⁴. nSMase2, как было установлено, обеспечивает, по крайней мере частично, эффекты TNFa на клеточную адгезию и миграцию⁸⁵. Несколько исследований выявили участие nSMase2 в цитотоксическом действии amyloid peptide-β, демонстрируя ослабление этих реакций в клетках, в которых nSMase2 послана в нокдаун с помощью siRNA^{86, 87}. Долговременная индукция энзима наблюдается после слияния (confluence) клеток (энзим и был первоначально клонирован как cell confluence-associated (CCA) ген⁸⁸) и участвует в обеспечении ареста клеточного цикла, который индуцируется при клеточном контакте⁸⁹. Механизмы. участвующие в активации nSMase2 выяснены недостаточно. TNFa , как было показано, индуцирует транслокацию энзима на плазматическую мембрану с помощью механизма, зависящего от активации p38 mitogen-activated protein kinase (MAPK)⁸⁵. В сливающихся клетках и клетках ткани (гепатоцитах), nSMase2 располагается базально на плазматической мембране. Важно, что она, по-видимому, располагается на внутреннем листке плазматической мембраны, где может располагаться преимущественно минорный пул SM⁹⁰. SK1-S1P in inflammation and angiogenesis. Твердо установлено участие SK1-S1P-S1PR оси во множественных сигнальных путях^{38, 91}. Многие факторы роста, такие как epidermal growth factor и platelet-derived growth factor, а также цитокины TNFa и IL-1, остро активируют SK1, приводя к временным повышениям уровней S1P (обычно в 2-3 раза)²⁵. Эта стимуляция нуждается в PKC⁹², phospholipase D (PLD)⁹³ и/ или в extracellular signal-regulated kinase (ERK) MAPKs, которая действует выше SK1 (Ref. 94). PKC может действовать непосредственно или косвенно посредством PLD и ERK, в то же время предполагается, что ERK непосредственно фосфорилирует SK1 по остатку Ser225 (Ref. 94), это необходимо для её транслокации на плазматическую мембрану. PLD генерирует phosphatidic кислоту, которая может непосредственно связывать SK1 и приводить к её ассоциации с мембраной³³. S1P, которая генерируется с помощью этого процесса, обнаруживается преимущественно во внеклеточном пространстве и, учитывая её zwitterionic характер, эти результаты подтверждают необходимость в механизмах активного транспорта. В самом деле, как было недавно предположено, ABC транспортер ABCC1 необходим для транспортировки S1P с внутреннего листка плазматической мембраны на внешнюю сторону клетки⁴⁰. Альтернативно, SK1 сама также обнаруживается вне клеток. Оказавшись вне клетки, S1P соединяется с S1PRs с высоким сродством и запускает типичные GPCR сигнальные пути⁹⁵ (Fig. 6). На клеточном уровне путь SK1-S1P изучался в связи с действием цитокинов, с множественными функциями, связанными с про-воспалительным действием TNFa (and IL-1). После 10 мин стимуляции TNFa, активируется SK1 с помощью механизма, который зависит от TRAF (TNFa receptor-associated factor) и ERK⁹⁶. Исследования нокдауна выявили участие SK1 в обеспечении эффектов TNFa на индукцию cyclooxygenase-2 (COX2), продукцию prostaglandins^{37, 97}, индукцию адгезивных молекул⁹⁸ и активацию eNOS⁸³. Интересно, что нокдаун S1P phosphatase или S1P lyase (ключевых энзимов, метаболизирующих S1P) увеличивает продукцию prostaglandin, одновременно с увеличением уровней S1P³⁷. Это указывает на то, что S1P является медиатором действия SK1, а не последующих метаболитов. На уровне организма путь SK1-S1P-S1P1R без сомнения участвует в регуляции ангиогенеза, т.к. S1P1R присутствуют на высоких уровнях в эндотелиальных клетках и. как известно, выполняют важную роль в ангиогенезе; кроме того, нокаут S1P1R ведет к эмбриональной летальности из-за плохого развития сосудистой сети⁹⁹. Комбинированный нокаут SK1 и SK2 также воспроизводитт этот фенотип¹⁰⁰. Исследования эндотелиальных и гладкомышечных клеток подтверждают ключевую роль S1P в регуляции пролиферации, миграции эндотелиальных клеток и образовании ими трубок и в активации миграции и пролиферации гладкомышечных клеток¹⁰¹. Более того, S1P1R вместе с S1P3R и S1P4R концентрируются в лимфатических органах и играют ключевые роли в регуляции лимфоидной секвестрации и/или в выходе из лимфатических узлов¹⁰². Недавно, FTY270, аналог sphingosine, как было установлено, фосфорилируется с помощью SK2 и действует как мощный агонист S1P рецепторов. FTY720 теперь находится на клинических испытаниях его роли в иммунной модуляции (напр., множественном склерозе¹⁰³), тем самым подчеркивается важность S1P в регуляции функции лимфоцитов и иммунитета. l Важно также вспомнить, что SK1 и SK2 выполняют ключевую метаболическую функцию в предпоследнем разрушении всех сфинголипидов, причем необратимые разрушения продукта S1P ведут к метаболическому выходу из sphingolipid пути. Т.о., изменения в активности SK могут оказывать долговременные эффекты не только на уровни S1P, но и также ceramide, сложные sphingolipids и sphingoid bases. Это прекрасно демонстрируется с помощью siRNA исследований, которые показывают достоверное накопление ceramide в ответ на нокдаун SK1 (Ref. 104). Conclusions and future directions The above examples focus on specific, regulated sphingolipid pathways and enzymes that have been more extensively studied than other enzymes and pathways, such as SM synthases, ceramidases, ceramide synthases, GCS, CERT, S1P phosphatase and S1P lyase, which are currently subject to intensive investigation. Sphingolipids other than ceramide and S1P are emerging as candidate bioeffector molecules. These include C1P, which has roles in activation of phospholipase A2 (Refs 105,106), regulation of vesicular trafficking, phagocytosis10, macrophage degranulation9 and in mitogenesis¹⁰⁷. Glucosylceramide has been implicated in resistance to chemotherapeutic agents12, and may serve as the endogenous cargo for the P-glycoprotein transporter MDR1 (Ref. 108). Dihydroceramide, which had been shown to be inactive in apoptosis, has been implicated in mediating the growth inhibitory actions of fenretinide (a retinoid analogue used in the treatment of neuroblastoma), which has been shown to inhibit the activity of the desaturase^109-111. Lyso-sphingomyelin has been shown to induce multiple cellular effects, possibly mediated by binding to specific GPCRs¹¹². These additional pathways and bioactive metabolites clearly represent areas of future investigation. The examples described here highlight important roles for sphingoid bases, ceramide and S1P in regulation of the cell cycle, stress responses, pro-inflammatory pathways and cell migration, with key roles in apoptosis, inflammation and angiogenesis. These cellular roles extend to organismal function and pathobiology and have implications for the understanding of cancer biology, arthritis and inflammation, diabetes, immune function and neurodegenerative disorders^113-115. Notwithstanding the many difficulties and complexities in studying bioactive lipids, these examples demonstrate the power of modern cell biology and biochemistry in elucidating these pathways through the use of knockout mice, siRNA technology, liquid chromatography–mass spectrometry-based 'lipidomic' analysis, confocal microscopy, chemical biology, mathematical modelling and systems biology approaches. There are several take-home messages. First, this ever-enlarging spectrum of bioactive lipids has, in effect, reversed our assumptions about the putative functions of lipid metabolism and the roles of minor lipids. Past generations of investigators may have been sceptical of the significance of lipids in cell biology, but we are now at a point where one can almost assume that lipids, which have regulated levels, are 'bioactive until proven otherwise'. Second, it is clear that these pathways are now accessible to the cell biologist, provided that due attention is given to the peculiarities of bioactive lipids and their pathways, as discussed in this review. Third, sphingolipid-mediated pathways operate at the level of individual organelles, and thus should be studied as such. Functions of ceramide in the ER are clearly different from those at the plasma membrane; even in the membrane, ceramide seems to regulate different functions depending on whether it is formed at the inner or outer leaflet. Similar considerations may apply to SK1 and SK2 (Ref. 116). Fourth, the complexity of sphingolipid metabolism and the metabolic interconversion of bioactive sphingolipids provide the cell with an extremely rich repertoire for not only generating multiple signals, but also for fine-tuning specific responses. Therefore, the field of bioactive sphingolipids constitutes its own area of biological '-omics', the 'sphingolipidome'. This generates the anticipation that many modern analytical techniques and the mathematical approaches of systems biology will be brought to bear on this field, as has been trialled with modelling of the sphingolipid metabolic pathways of yeast¹¹⁷. The study of bioactive lipids is only now coming to the forefront of cell biology, representing possibly one of the last frontiers in molecular cell biology. Clearly, more work is required to dissect each of the many regulated pathways of bioactive sphingolipids and define the mechanisms of regulation of enzymes, roles of the pathways in specific cell responses, and mechanisms by which individual bioactive sphingolipids, which act in specific subcellular compartments, mediate those actions.

Хотя концепция 'bioactive lipids' - широко определяется как изменения в уровнях липидов, которые вызывают функциональные последствия - прошли десятилетия в процессе её создания и только начинаем извлекать доход в последние 20 лет и в 21-м веке она становится в центр исследований клеточной биологии. Запоздалое признание имеет свои корни в более ранних априорных представлениях об исключительной роли липидов в энергетическом метаболизме и в структуре мембран, это предупредило более широкое толкование функциональной роли липидов. Эти препятствия в первую очередь возникли из-за множества врожденных трудностей работы с липидами, их энзимами и их мишенями.

В своем пионерском исследовании в 1950s, Hokin and Hokin наблюдали быстрый оборот inositol phospholipids на срезах поджелудочной железы, который стимулировался с помощью acetylcholine¹. Однако, значение этого наблюдения для клеточной функции оставалось относительно невостребованным в течение нескольких лет, до тех пор, пока diacylglycerol (DAG) и inositol-1,4,5-trisphosphate (Ins(1,4,5)P3) не оказались задействованы в специфической регуляции protein kinase C (PKC) и в высвобождении calcium², соотв., что приводило к различным клеточным реакциям. Концептуально, демонстрация прямой активации PKC с помощью липида DAG сцементировала идею, что липид (роль которого уже была установлена в промежуточном обмене веществ) может регулировать передачу клеточных сигналов и возвестила эру биоактивных липидов.

Исследования последних 40 лет также установили eicosanoids (и др. продукты метаболизма arachidonic кислоты) в качестве ключевых меж- и внутриклеточных липидных сигнальных молекул, которые прежде всего участвуют в обеспечении или разрешении воспалительной реакции³. Дальнейшие исследования показали, что большинство минорных продуктов метаболизма inositol phospholipid, таких как phosphatidylinositol-3,4,5-trisphosphate (PtdIns(3,4,5)P3), также служат в качестве ключевых промежуточных образований в передаче клеточных сигналов. Др. производные glycerolipid регуляторные молекулы включают phosphatidic acid (PA), monoacylglycerols и anandamide (лиганды кандидаты для cannabinoid рецепторов), lyso-phosphatidic acid и platelet activating factor (PAF).

Др. группой биоактивных липидов, которая вышла из тени в последние два десятилетия, являются sphingolipids. Первым из них был идентифицирован sphingosine, который обнаруживает плейотропные эффекты на протеин киназы и др. мишени. Sphingosine и родственный ему sphingoid bases играют роль в регуляции актинового цитоскелета, эндоцитоза, клеточного цикла и апоптоза⁴ (Fig. 1). Ещё больший упор был сделан на сфинголипидах ceramide и sphingosine-1-phosphate (S1P). Ceramide обеспечивает большинство реакций на клеточные стрессы, включая регуляцию апоптоза⁵ и клеточного старения⁶, тогда как S1P играет критическую роль в клеточной жизнеспособности, миграции клеток и воспалении⁷ (Fig. 1). Недавние добавления к семейству биоактивных сфинголипидов включают ceramide-1-phosphate (C1P, который играет роль в воспалении и переносе пузырьков^8-10), glucosylceramide (который участвует в post-Golgi трафике и резистентности к лекарствам^11,12), lyso-sphingomyelin и dihydroceramide.

В дополнение к огромному количеству клеточных процессов, с которыми ассоциируют сфинголипиды, дальнейшие уровни сложности передачи сигналов sphingolipid только начинают расшифровывать. Эта сложность возникает в результате метаболического взаимодействия биоактивных липидов (Fig. 2), так что изменение одного липида вызывает метаболические 'ripple' эффекты с функциональными последствиями. Более того, энзимы липидного метаболизма (вход в эти пути) являются часто гидрофобными мембранными белками, которыми пренебрегли в простых биохимических и клеточных исследованиях. Варьирующие биофизические свойства регуляторных липидов также вызывают осложнения, связанные с их субклеточной локализацией и механизмами действия.

Следовательно, всеобъемлющее понимание биоактивных сфинголипидов (и др. липидов в целом) нуждается, по крайне мере, в двух уровнях исследований. На базовом уровне существует необходимость вычленения различных специфических механизмов, с помощью которых метаболизм сфинголипидов регулируется и молекулярные механизмы, с помощью которых продукты биоактивных липидов передают свои соотв. сигналы. На продвинутом и липид-специфическом уровне такое понимание нуждается в знании метаболической организации энзимов метаболизма сфинголипидов и их взаимоотношений, субклеточной и субмембранной локализации липидами опосредованных путей, метаболической трансформации биоактивных липидов и интеграции или координации всех реакций. Целью обзора является информирование о базовой организации и принципах обеспечиваемой сфинголипидами клеточной регуляции и предоставление современного понимания о сигнальных путях специфических сфинголипидов.

Introducing the sphingolipid family

Метаболизм сфинголипидов появляется в основном у эукариот, но обнаружен также род бактерий Sphingomonas. Пути метаболизма сфинголипидов обладают уникальной метаболической точкой вхождения (serine palmitoyl transferase; SPT), которая формирует сначала сфинголипид на de novo пути, и уникальной точкой выхода, S1P lyase, которая разрывает S1P на non-sphingolipid молекулы. Множественные метаболические ступени в промежутке составляют очень сложную сеть, которая связывает метаболизм многих сфинголипидов (Fig. 2). В этой сети ceramide (и в меньшей степени dihydroceramide) может рассматриваться как метаболический узел (hub), т.к. он занимает центральную позицию в биосинтезе и катаболизме сфинголипидов.

Короче, сфинголипиды синтезируются de novo из serine и palmitate, которые конденсируются, чтобы сформировать 3-keto-dihydrosphingosineблагодаря дей2ствию SPT^13,14.В свою очередь, 3-keto-dihydrosphingosine редуцируется до dihydrosphingosine, вследствие ацетилирования с помощью (dihydro)-ceramide synthase (известной также как Lass или CerS)¹⁵. Ceramide формируется с помощью десатурации dihydroceramide¹⁶ (Fig. 2).

На пути биосинтеза sphingolipid (Fig. 2), ceramide может быть фосфорилирован с помощью ceramide kinase¹⁷, гликозилирован с помощью glucosyl или galactosyl ceramide synthases¹⁸, или может захватывать головную группу phosphocholine от phosphatidylcholine (PC) при биосинтезе sphingomyelin (SM) благодаря действию SM synthases¹⁹, которая также служит для генерации DAG из PC.

Разрушение комплекса сфинголипидов (Fig. 2) происходит благодаря действию специфических hydrolases, приводя к образованию glucosylceramide и galactosylceramide. Затем специфические β-glucosidases и galactosidases гидролизуют эти липиды, чтобы регенерировать ceramide^{20, 21}. Разрушение SM катализируется с помощью одной из нескольких sphingomyelinases (SMases)²². Они включают acid SMase, neutral SMases and alkaline SMase.

Ceramide может быть разрушен с помощью одной из многих ceramidases^{23, 24}, приводя к образованию sphingosine, который. по-видимому, приобретает одну из двух судеб. Sphingosine может быть (спасен) 'salvaged' или подвергнут рециклингу на sphingolipid путях (Box 1), или он может быть фосфорилирован одной из двух sphingosine kinases²⁵, SK1 и SK2 (Fig. 2). Продукт S1P может быть дефосфорилирован, чтобы регенерировать sphingosine благодаря действию специфических внутриклеточных S1P phosphatases²⁶ и возможно благодаря действию не-специфических lipid phosphate phosphatases^{27, 28}. Альтернативно, S1P lyase может необратимо расщеплять S1P, чтобы генерировать ethanolamine phosphate и hexadecenal (который, в свою очередь, может редуцировать palmitate и впоследствии повторно инкорпорировать в пути метаболизма липидов)²⁹.

Complexities of sphingolipid signalling

В осмыслении передачи клеточных сигналов в основном преобладает каноническая парадигма cyclic АМФ, при этом существует путь линейной передачи сигналов, в котором участвуют рецепторы, циклаза, цАМФ и цАМФ-зависимая протеин киназа, и в которой цАМФ выполняет сигнальную функцию. Однако, передача сигналов sphingolipid проявляется дополнительными слоями сложности по сравнению с путем цАМФ. В отличие от относительной простоты биохимически изолированного цАМФ пути, энзимы липидного метаболизма интимно связаны др. с др., генерируя взаимосвязанную сеть (Fig. 2), которая служит для регуляции не только уровней индивидуальных биоактивных липидов, но и также их метаболического взаимопревращения. Более того, имеются множественные пути, которые могут оперировать параллельно (Fig. 3). Также в отличие от растворимых молекул цАМФ, биоактивные сфинголипиды обладают гидрофобными свойствами; следовательно, физиологическое окружение биоактивных липидов по большей части ограничено биологическими мембранами. Итак, критический и уникальный набор свойств действует в клетке, чтобы предопределить субклеточную локализацию sphingolipid-опосредуемых путей и и транспорта биоактивных липидов поперек и между мембранами.

The interconnectivity of sphingolipid metabolism. Беспрецендентная сложность взаимных соединений сфинголипидов позволяет клеткам оркестрировать клеточные реакции путем регуляции взаимных превращений сфинголипидов. Напр., активация SMase генерирует ceramide в качестве непосредственного липидного продукта. Однако, последующее действие ceramidase, ceramide kinase, SM synthase или glucosylceramide synthase может в принципе превращать ceramide сигнал в один из тех, обеспечивается с помощью sphingosine (и следовательно, S1P), C1P, DAG или glucosylceramide, соотв.(Fig. 2).

Интересно, что клеточные уровни др. биоактивных сфинголипидов обнаруживают те же сценарии с высоким сходством³⁰. Напр., в большинстве типов клеток SM присутствует в концентрациях, которые на порядок величин выше, чем таковые для ceramide; следовательно, незначительные изменения в SM могут приводить к выраженным изменениям в ceramide. Кроме того, ceramide часто обнаруживается в концентрациях, которые больше чем на порядок величин выше концентраций sphingosine. Следовательно, непосредственный гидролиз лишь 3-10% вновь образованного ceramide может удваивать уровни sphingosine. Сходным образом фосфорилирование 1-3% sphingosine может удваивать уровни S1P (Fig. 1).

Учитывая эти метаболические данные, становится возможным, что когда энзимы сфинголипидов участвуют в процессе, то непосредственный продукт этого энзима может не быть фактическим сигнальным эффектором. Следовательно, важно определить, какой липидный продукт или субстрат в действительности обеспечивает сигнал. Напр., с помощью участия SMase или SKs в клеточно специфических реакциях нельзя непосредственно придти к выводу, что это является ceramide или S1P, который непосредственно обеспечивает такую функцию. К счастью, сегодня доступны инструменты и подходы к этим процессам. Это высоко чувствительная масс спектрометрия для анализа сфинголипидов^30,31, молекулярные инструменты, которые производят почти полную молекулярную идентификацию всех известных энзимов метаболизма сфинголипидов, и RNA interference, которая успешно используется в исследованиях клеточной биологии метаболизма и функции липидов.

Parallel networks of sphingolipid signalling. Множественность некоторых путей метаболизма сфинголипидов создает др. уровень сложности, который накладывается на основную кальку (blueprint) метаболизма сфинголипидов, обсужденного выше. Это лучше всего иллюстрируется на примере ceramide synthases¹⁵ (Fig. 3). Шесть индивидуальных ceramide synthases катализируют образование dihydroceramides или ceramides (в зависимости от того является ли субстратом dihydrosphingosine или sphingosine, соотв.). Важно, что эти ceramide synthases обнаруживают характерные предпочтения к различным fatty acyl-CoA субстратам и, следовательно, они генерируют разные ceramides с уникальными N-сцепленными жирными кислотами. Разные ceramides могут локализоваться в самостоятельных субкомпартментах и могут выполнять самостоятельные функции. В качестве др. примера , acid SMase и neutral SMase могут действовать на SM, чтобы генерировать ceramide. Однако, эти два энзима регулируются по-разному, локализуются в отдельных субклеточных компартментах (Box 1) м могут даже генерировать ceramides с разными молекулярными свойствами.

Subcellular localization of bioactive sphingolipids. Большинство энзимов метаболизма сфинголипидов обнаруживает специфическую субклеточную локализацию (Box 1), и это оказывает выраженные эффекты на передачу сигналов и регуляторные функции генерируемых сфинголипидов. Напр., acid SMase локализуется преимущественно в эндолизосомном пути, но при определенных условиях может также перемещаться на плазматическую мембрану, преимущественно на наружный листок³². Neutral SMase2, по-видимому, локализуется на внутреннем листке плазматической мембраны. SK1 и SK2 , по-видимому, действуют преимущественно на sphingosine субстрат, который располагается в мембранах, которые необходимы для транслокации SK энзимов из их цитозольного компартмента на плазматическую мембрану (и др. мембраны) и для соединения с анионными липидами³³. Поэтому очень возможно, что SK энзимы обладают множественными субклеточными локализациями, что и диктует разные функциональные реакции.

Эти характеристики в купе с плохой растворимостью липидов (Box 2) в клетках, накладывают определенные ограничения на субклеточную локализацию биоактивных липидов. В отсутствие специфических механизмов транспорта этих липидов, места генерации биоактивных липидов и диктуют их место действия, если не доказано иное.

Биоактивные сфинголипиды (и липиды в целом) могут быть подразделены на отдельные классы, которые могут отличаться по своим биофизическим свойствам (Box 2). Некоторые биоактивные липиды, такие как C1P и phosphatidylinositol-3-phosphate, несут ионные заряды при нейтральном pH и содержат две гидрофобные цепочки. Эти липиды скорее всего располагаются в компартменте своего возникновения и вряд ли проникают спонтанно через бислой. Вторая группа, которая включает ceramide и DAG, представлена нейтральными гидрофобными молекулами, которые также ограничены компартментами своего формирования, но они могут легко проникать (flip-flop) через мембраны³⁴.

Третья группа представлена одноцепочечными липидами и она включает sphingosine, S1P, lyso-sphingomyelin и lyso-phosphatidic acid. Эти молекулы обладают достаточной растворимостью в жидкости, чтобы перемещаться между мембранами. Напр., было подсчитано, что ~70% остатков sphingosine располагается в мембранах при физиологических условиях pH, а остальные 30% растворимы³⁵. Эти молекулы могут, следовательно, быстро уравновешиваться в мембранах. Более важно, учитывая их amphipathic природу (т.е. растворимость как в воде, так и органических растворителях), что эти молекулы могут обладать surfactant активностью. Следовательно, не является сюрпризом, что их клеточные уровни обнаруживают тенденцию находиться среди наинизших из всех биоактивных липидов.

Transport and flipping of bioactive sphingolipids. Для биоактивных сфинголипидов, чтобы вызвать функциональные реакции, они д. быть доступны для взаимодействия с соотв. непосредственными медиаторами. Субклеточное ограничение биоактивных сфинголипидов и некоторых их мишеней ставят некоторые вопросы, как взаимодействующие партнеры способны встречаться (Fig. 4). Напр., S1P возможно генерируется на внутреннем листке плазматической мембраны в ответ на действие tumour necrosis factor-a (TNFa) и др. агонистов^{36, 37}. Всё же очевидно, что он достигает наружного листка плазматической мембраны, чтобы взаимодействовать с S1P рецепторами (S1PRs)³⁸. Соответственно, два члена сверхсемейства ABC транспортеров , как было предположено, регулируют транспорт S1P (Fig. 4). Cystic fibrosis transmembrane regulator (CFTR) участвует в интернализации S1P из плазматической мембраны³⁹, тогда как ABCтранспортер ABCC1 , как было недавно установлено, облегчает утечку S1P⁴⁰.

Ceramide transfer protein CERT , как было установлено, влияет на транспорт ceramide с места его синтеза в эндоплазматическом ретикулеме (ER) в аппарат Golgi и необходим для синтеза SM (но не для синтеза glucosylceramide)⁴¹ (Box 1). Учитывая взаимодействие CERT с phosphatidylinositol phosphates и его потенциал регуляции с помощью фосфорилирования, эта ступень метаболизма ceramide может регулироваться с помощью путей метаболизма inositol липида и с помощью протеин киназ⁴² и фосфатаз.

Как нейтральный липид, ceramide, по-видимому, может flip-flop через мембраны с непринужденностью, и в самом деле, исследования на модельных мембранах и мембранах эритроцитов подтверждают это предположение³⁴ (Fig. 4). Однако, неясно может ли ceramide, который формируется на более сложных биологических мембранах проникать с такой же эффективностью или организация ceramide в микродомены (существуют специализированные липидные домены в плазматической мембране; see the review by van Meer and colleagues in this issue) может ограничивать перемещение ceramide с наружного листка на внутренний листок. Ограничение flipping (или flopping со внутреннего на наружный листок) д. оказывать значительные эффекты на сигнальные функции ceramide. Напр., ceramide, который генерируется с помощью acid SMase в наружном листке, может осуществлять иные функции по сравнению с ceramide, который генерируется на внутреннем листке с помощью neutral SMase2 (Ref. 22).

Итак, биофизические и метаболические характеристики, рассмотренные выше, вносят уровень сложности, который отсутствует в др. сигнальных путях. Имеется, по крайней мере, 26 самостоятельных энзимов. которые действуют на ceramide как их субстрат или продукт и которые, следовательно, обладают потенциалом регулировать уровни ceramide. Эти энзимы обнаруживают специфические и варьирующие субклеточные локализации. Более того, ceramide сам является семейством тесно родственных молекул с, по крайней мере, 50 самостоятельными молекулярными разновидностями, которые могут быть различены с помощью их acyl цепочек, hydroxylations и desaturation (Fig. 3). Следовательно, уровни ceramide могут регулироваться в разных компартментах с помощью самостоятельных механизмов в разные времена.

Mechanisms of action: ceramide and S1P

Понимание, как биоактивные липиды действуют и как они передают сигналы, требует выяснения механизмов, с помощью которых эти липиды действуют. Можно представить себе два общих механизма действия липидов: межлипидные взаимодействия, с помощью которых кандидаты биоактивных липидов влияют на структуру мембраны и/или взаимодействие мембранных белков внутри мембранного бислоя (see the review by van Meer and colleagues in this issue); или взаимодействия между липидом и белком, с помощью которых изменения в липидах модулирую функцию белков мишеней, которые взаимодействуют специфически с кандидатами биоактивных липидов.

Физиологические уровни биоактивных липидов четко влияют (или даже диктуют) механизмы их действия. Следы липидов, таких как S1P, взаимодействуют с рецепторами высокого сродства, которые способны чувствовать их низкие уровни. Липиды, которые обнаруживают промежуточные мембранные концентрации, такие как ceramide или DAG (которые часто составляют 0.1-1.0% от общих мембранных липидов), действуют на мишени с промежуточным сродством. Напротив, очень трудно предвидеть, сколько обильные липиды, такие как SM, могут иметь специфических мишеней, т.к. сродство взаимодействий должно быть низким. Это не исключает белки, которые могут соединяться с этими липидами с высоким сродством, но в таком случае такие белки не должны быть способны ощущать изменения в уровнях этих липидов. Наивысшие уровни таких липидов, однако, придают им способность изменять общие свойства и субструктуру мембран, если и когда их уровни меняются. Для ceramide и S1P, внимание сфокусировано на определении действия непосредственных белковых мишеней. Некоторые белки кандидаты, как было показано. взаимодействуют с ceramide in vitro и в клетках (Fig. 5). Сюда входят ceramide-activated Ser-Thr phosphatases (CAPPs), такие как PP1 и PP2A, которые связывают ceramide in vitro⁴³. Они умеренно активируются с помощью ceramide и обнаруживают предпочтение к естественным стереоизомерам. Исследования на клетках связаны с действием ceramide на CAPPs и индукцией дефосфорилирования белка. Напр., ceramide-индуцируемые агенты (такие как TNFa или загрузка клеток palmitate) индуцируют дефосфорилирование продукта гена retinoblastoma RB44, PKCalpha45, protein kinase B (PKB or AKT⁾⁴⁶ и др. белков зависимым от ceramide способом. Однако, чтобы продемонстрировать прямую клеточную активацию фосфатаз с помощью ceramide, необходимы экспериментальные доказательства (напр., наблюдение транслокации). Определение специфических сайтов связывания этого процесса активации может привести к улучшению понимания того, как эти взаимодействия происходят и могут также предоставить специфические инструменты для изучения этих путей.

Кроме того, как было показано, ceramide активируют PKCζ^{47, 48}, киназу KSR49 и cathepsin D50. Последний, как полагают, является специфической мишенью для лизосомно генерированных ceramide и может связывать действие лизосомной acid SMase с митохондриальным путем апоптоза⁵⁰. Активация PKCζ с помощью ceramide участвует в регуляции мембранного потенциала, ингибировании AKT и про-апоптических функциях^{48, 51}.

S1P является одним из наиболее растворимых сфинголипидов и присутствует в низких наномолярных концентрациях в клетках (но в высокой наномолекулярной концентрации в сыворотке, где он ассоциирует с липопротеинами и альбумином⁵²). Он взаимодействует с S1PRs⁵³, который является G protein-coupled receptors (GPCRs) высокого сродства и и является единственным из известных рецепторов для S1P , которые были идентифицированы. Пять S1PRs (S1PR1-5) обнаруживают избирательную тканевую экспрессию, это является критическим для их биологических функций и используют хорошо-известные пути GPCR внутриклеточной передачи сигналов, чтобы обеспечить свои специфические эффекты (Fig. 6). S1P кроме того осуществляет S1PR-независимые действия внутриклеточно, такие как индукция высвобождения кальция⁸, хотя их механизмы остаются неизвестными. Т.к. внутриклеточная молекулярная мишень для S1P не идентифицирована, то его внутриклеточная роль остается предметом спекуляций и неослабного интереса.

Sphingolipid-mediated cell regulation

Основное внимание будет уделено трем специфическим путям передачи сигналов ceramide и пути SK1-S1P в воспалении и ангиогенезе в порядке внесения ключевых игроков и предоставления некоторого представления о наших знаниях сфинголипидами обусловленной клеточной регуляции.

De novo synthesis of sphingolipids and stress responses. Путь синтеза de novo биосинтеза сфинголипидов, который находится в ER, проявился в качестве ключевого механизма в клетках эукариот для регуляции уровней ceramide и др. сфинголипидов. В клетках млекопитающих синтез de novo ceramide усиливается в ответ на некоторые хемотерапевтические агенты, такие как etoposide и daunorubicin^{54, 55}, и др. индукторы апоптоза, такие как стимуляция B-клеточных рецепторов⁵⁶. Про-апоптический FAS путь стимулирует синтез de novo , который, как было установлено, активирует PP1. Это приводит к дефосфорилированию SR белков, которые являются регуляторами сплайсинга РНК, функция которого регулируется с помощью фосфорилирования⁵⁷. Это склоняет баланс про- и анти-апоптических мРНК в пользу про-апоптических caspase-9 и BCL-X⁵⁷.

Интересно, что путь de novo метаболически приводится в движение в ответ на изменения в концентрациях serine и palmitate, т.к. SPT обладает значением K_m к двум субстратам, которые находятся в пределах их обычных внутриклеточных концентраций⁵⁸ (Fig. 1). В самом деле. недавнее исследование на дрожжах продемонстрировало, что тепловой стресс индуцирует острый приток serine в ER, который управляет синтезом de novo ⁵⁹. Активация этого пути у дрожжей приводит к временному накоплению sphingoid bases, сопровождаемому накоплением sphingoid base phosphates, а затем и ceramide. Многочисленные исследования показали, что sphingoid bases, которые генерируются на этом пути, обеспечивают специфические реакции на тепловой стресс⁶⁰, включая регуляцию пищевой permeases⁶¹, цитоскелетных изменений⁶², ареста клеточного цикла⁵⁹ и трансляции РНК⁶³.

Регуляция синтеза ^{de novo} с помощью palmitate может играть ключевую роль в диабете и метаболическом синдроме (Fig. 5a). Появившиеся доказательтсва указывают на то, что нагрузка palmitate ведет к накоплению ceramide, который активирует PP2A и приводит в результате к дефосфорилированию и инактивации AKT⁴⁶, ключевого медиатора в передаче сигналов инсулина и метаболического контроля. Ceramide могут оказывать дополнительные эффекты на AKT и на др. мишени, которые совместно вызывают ухудшение чувствительности к инсулину и гибель клеток островков^{64, 65} (процесс наз. lipoptosis) и может вносить вклад в др. диабетические осложнения. Недавнее исследование на мышах показало, что ингибирование синтеза ceramide, или с помощью фармакологического воздействия или генетических манипуляций, предупреждает резистентность к инсулину, индуцируемую жирными кислотами, ожирением или глюкокортикоидами⁶⁵.

Хотя значение этого пути сегодня оценено по достоинству, некоторые ключевые вопросы ещё необходимо решить. Повышенный отток через de novo путь не обязательно ведет к накоплению ceramide, независимо от того, будет ли в дальнейшем метаболическая трансформация (напр.. в SM, C1P или glucosylceramide) ограничена или лимитирована (как это было продемонстрировано в некоторых случаях апоптоза, при которых SM synthase и glucosylceramide synthase (GCS) супрессируются). Также неясно, если путь de novo действует исключительно в ER или также на др. ассоциированных с ER мембранах (таких как, ассоциированные с митохондриями мембраны или ядерные мембраны), то локализация пути de novo возможно должна быть связана с регуляцией ER стрессов, но это ещё следует оценить.

Acid SMase and the salvage pathway in stress signalling. Множественные стрессовые стимулы, такие как УФЛ и ионизирубющая радиация, связывание death рецепторов и химиотерапевтические агенты (включая platinum, paclitaxel и histone deacetylase ингибиторы) как было установлено, активируют acid SMase, обычно в течение нескольких минут клеточной стимуляции (Fig. 5b). Это было продемонстрировано прежде всего с помощью обнаружения повышенной активности in vitro энзима и это явилось указанием на некоторые пост-трансляционные модификации acid SMase. В немногих исследованиях активация SMase, как было установлено, сопровождается транслокацией на плазматическую мембрану и одновременной генерацией ceramide⁶⁶.

Помимо этих корреляций проведено несколько исследований, чтобы получить прямые указания участия acid SMase в генерации ceramide и нижестоящих реакциях или благодаря использованию генетический мутаций энзима (полученных от пациентов с Niemann-Pick disease)⁶⁷, нокаутных мышей, которые лишены acid SMase⁶⁸, small interfering (si)RNA-обусловленного нокдауна⁶⁹ или фармакологических ингибиторов⁷⁰, таких как один из tricyclic amines, desipramine или imipramine. Однако, такие фармакологические исследования необходимо интерпретировать с осторожностью, т.к. эти ингибиторы имеют и др. мишени, включая acid ceramidase⁷¹. Нокаут или нокдаун гена четко показали участие acid SMase в обеспечении апоптической и стрессовой реакций на ионизирующую радиацию и УФЛ^68,72, и на низкие концентрации FAS лигандов⁷³. Однако, др. исследования демонстрируют повышенную чувствительность к FAS, но пониженную митотическую стимуляцию Т клеток у нокаутных мышей⁷⁴.

Механизмы, которые участвуют в активации acid SMase в ответ на стрессовые агенты, определены плохо. Недавние результаты показали, что энзим активируется с помощью реактивных видов кислорода и в частности, с помощью nitrosative стресса⁷⁵. Др. недавние исследования предоставили доказательства регуляции acid SMase с помощью фосфорилирования в ответ на активацию PKCδ, и это участвует в обеспечении эффектов УФЛ на активацию acid SMase⁷². Эти исследования только начинают предоставлять информацию о важной механистической связи между путями стрессовых реакций, которые прежде рассматривались как самостоятельные (acid SMase, nitrosative stress иPKCδ).

Ceramide, которые генерируются с помощью acid SMase, как полагают, располагаются или в лизосомах или на плазматической мембране (Box 1). Оба места правдоподобны, т.к. acid SMase, как убедительно было показано, существует в обоих субклеточных сайтах. В лизосомах ceramide, как было установлено, взаимодействуют непосредственно с protease cathepsin D и чтобы активировать её, возможно вызывают расщепление и активацию про-апоптического белка BID⁵⁰ (Fig. 5b). На плазматической мембране действие ceramide менее определено, но предполагается, что они обеспечивают capping рецепторов (образование микроскопических кластеров) и/или образование микродоменов⁷⁰.

В качестве иллюстрации сложной природы метаболизма ceramide, недавно было показано, что активация acid SMase в ответ на форболовые эфиры также ведет к сопутствующему увеличению формирования ceramide за счет пути переработки (или рециклинга) ⁷⁶. На этом пути sphingosine превращается в ceramide благодаря действию ceramide synthases (Box 1). Это может объяснить некоторые кажущиеся расхождения в литературе, где как acid SMase, так и de novo путь (базируясь на ингибировании ceramide synthase с помощью fumonisin B1) участвуют в некоторых клеточных реакциях (напр., to doxorubicin). Важно, что fumonisin B1 ингибирует ceramide synthases и невозможно отличить de novo синтез от рециклинга (Box 1). Следовательно, можно предположить в этих случаях, что acid SMase связана с рециклингом.

Neutral SMase2 in cytokine action. Многие исследования связаны с активацией neutral SMase на действие некоторых внеклеточных цитокинов и стрессовые реакции⁷⁷, а список индукторов обнаруживает значительное перекрывание с активаторами acid SMase. Однако, прогресс в молекулярном вычленении путей, обеспечиваемых neutral SMase, только начат вследствие недавней идентификации neutral SMase-2 (nSMase2) в качестве настоящей sphingomyelinase^{78, 79}. Важно. что нокаут энзима, как было установлено, ведет к низкому росту, а естественные мутации у nSMase2 (fro/fro мышей) приводят к ломкости костей^{80, 81}.

nSMase2 has been implicated in several cell responses. Она остро активируется с помощью цитокинов TNFa и interleukin (IL)-1 и, как было показано, обеспечивает эффекты IL-1 на передачу сигналов (фосфорилированием c-Jun N-terminal kinase (JNK))⁸², и эффекты TNFa на индукцию генов (в том числе и endothelial nitric oxide synthase (eNOS))⁸³. Энзим, как было установлено, индуцируется во время старения гепатоцитов мышей и обусловливает снижение чувствительности гепатоцитов на передачу сигналов IL-1⁸⁴. nSMase2, как было установлено, обеспечивает, по крайней мере частично, эффекты TNFa на клеточную адгезию и миграцию⁸⁵.

Несколько исследований выявили участие nSMase2 в цитотоксическом действии amyloid peptide-β, демонстрируя ослабление этих реакций в клетках, в которых nSMase2 послана в нокдаун с помощью siRNA^{86, 87}. Долговременная индукция энзима наблюдается после слияния (confluence) клеток (энзим и был первоначально клонирован как cell confluence-associated (CCA) ген⁸⁸) и участвует в обеспечении ареста клеточного цикла, который индуцируется при клеточном контакте⁸⁹.

Механизмы. участвующие в активации nSMase2 выяснены недостаточно. TNFa , как было показано, индуцирует транслокацию энзима на плазматическую мембрану с помощью механизма, зависящего от активации p38 mitogen-activated protein kinase (MAPK)⁸⁵. В сливающихся клетках и клетках ткани (гепатоцитах), nSMase2 располагается базально на плазматической мембране. Важно, что она, по-видимому, располагается на внутреннем листке плазматической мембраны, где может располагаться преимущественно минорный пул SM⁹⁰.

SK1-S1P in inflammation and angiogenesis. Твердо установлено участие SK1-S1P-S1PR оси во множественных сигнальных путях^{38, 91}. Многие факторы роста, такие как epidermal growth factor и platelet-derived growth factor, а также цитокины TNFa и IL-1, остро активируют SK1, приводя к временным повышениям уровней S1P (обычно в 2-3 раза)²⁵. Эта стимуляция нуждается в PKC⁹², phospholipase D (PLD)⁹³ и/ или в extracellular signal-regulated kinase (ERK) MAPKs, которая действует выше SK1 (Ref. 94). PKC может действовать непосредственно или косвенно посредством PLD и ERK, в то же время предполагается, что ERK непосредственно фосфорилирует SK1 по остатку Ser225 (Ref. 94), это необходимо для её транслокации на плазматическую мембрану. PLD генерирует phosphatidic кислоту, которая может непосредственно связывать SK1 и приводить к её ассоциации с мембраной³³.

S1P, которая генерируется с помощью этого процесса, обнаруживается преимущественно во внеклеточном пространстве и, учитывая её zwitterionic характер, эти результаты подтверждают необходимость в механизмах активного транспорта. В самом деле, как было недавно предположено, ABC транспортер ABCC1 необходим для транспортировки S1P с внутреннего листка плазматической мембраны на внешнюю сторону клетки⁴⁰. Альтернативно, SK1 сама также обнаруживается вне клеток. Оказавшись вне клетки, S1P соединяется с S1PRs с высоким сродством и запускает типичные GPCR сигнальные пути⁹⁵ (Fig. 6).

На клеточном уровне путь SK1-S1P изучался в связи с действием цитокинов, с множественными функциями, связанными с про-воспалительным действием TNFa (and IL-1). После 10 мин стимуляции TNFa, активируется SK1 с помощью механизма, который зависит от TRAF (TNFa receptor-associated factor) и ERK⁹⁶. Исследования нокдауна выявили участие SK1 в обеспечении эффектов TNFa на индукцию cyclooxygenase-2 (COX2), продукцию prostaglandins^{37, 97}, индукцию адгезивных молекул⁹⁸ и активацию eNOS⁸³. Интересно, что нокдаун S1P phosphatase или S1P lyase (ключевых энзимов, метаболизирующих S1P) увеличивает продукцию prostaglandin, одновременно с увеличением уровней S1P³⁷. Это указывает на то, что S1P является медиатором действия SK1, а не последующих метаболитов.

На уровне организма путь SK1-S1P-S1P1R без сомнения участвует в регуляции ангиогенеза, т.к. S1P1R присутствуют на высоких уровнях в эндотелиальных клетках и. как известно, выполняют важную роль в ангиогенезе; кроме того, нокаут S1P1R ведет к эмбриональной летальности из-за плохого развития сосудистой сети⁹⁹. Комбинированный нокаут SK1 и SK2 также воспроизводитт этот фенотип¹⁰⁰. Исследования эндотелиальных и гладкомышечных клеток подтверждают ключевую роль S1P в регуляции пролиферации, миграции эндотелиальных клеток и образовании ими трубок и в активации миграции и пролиферации гладкомышечных клеток¹⁰¹.

Более того, S1P1R вместе с S1P3R и S1P4R концентрируются в лимфатических органах и играют ключевые роли в регуляции лимфоидной секвестрации и/или в выходе из лимфатических узлов¹⁰². Недавно, FTY270, аналог sphingosine, как было установлено, фосфорилируется с помощью SK2 и действует как мощный агонист S1P рецепторов. FTY720 теперь находится на клинических испытаниях его роли в иммунной модуляции (напр., множественном склерозе¹⁰³), тем самым подчеркивается важность S1P в регуляции функции лимфоцитов и иммунитета. l

Важно также вспомнить, что SK1 и SK2 выполняют ключевую метаболическую функцию в предпоследнем разрушении всех сфинголипидов, причем необратимые разрушения продукта S1P ведут к метаболическому выходу из sphingolipid пути. Т.о., изменения в активности SK могут оказывать долговременные эффекты не только на уровни S1P, но и также ceramide, сложные sphingolipids и sphingoid bases. Это прекрасно демонстрируется с помощью siRNA исследований, которые показывают достоверное накопление ceramide в ответ на нокдаун SK1 (Ref. 104).

Conclusions and future directions

The above examples focus on specific, regulated sphingolipid pathways and enzymes that have been more extensively studied than other enzymes and pathways, such as SM synthases, ceramidases, ceramide synthases, GCS, CERT, S1P phosphatase and S1P lyase, which are currently subject to intensive investigation. Sphingolipids other than ceramide and S1P are emerging as candidate bioeffector molecules. These include C1P, which has roles in activation of phospholipase A2 (Refs 105,106), regulation of vesicular trafficking, phagocytosis10, macrophage degranulation9 and in mitogenesis¹⁰⁷. Glucosylceramide has been implicated in resistance to chemotherapeutic agents12, and may serve as the endogenous cargo for the P-glycoprotein transporter MDR1 (Ref. 108). Dihydroceramide, which had been shown to be inactive in apoptosis, has been implicated in mediating the growth inhibitory actions of fenretinide (a retinoid analogue used in the treatment of neuroblastoma), which has been shown to inhibit the activity of the desaturase^109-111. Lyso-sphingomyelin has been shown to induce multiple cellular effects, possibly mediated by binding to specific GPCRs¹¹². These additional pathways and bioactive metabolites clearly represent areas of future investigation.

The examples described here highlight important roles for sphingoid bases, ceramide and S1P in regulation of the cell cycle, stress responses, pro-inflammatory pathways and cell migration, with key roles in apoptosis, inflammation and angiogenesis. These cellular roles extend to organismal function and pathobiology and have implications for the understanding of cancer biology, arthritis and inflammation, diabetes, immune function and neurodegenerative disorders^113-115. Notwithstanding the many difficulties and complexities in studying bioactive lipids, these examples demonstrate the power of modern cell biology and biochemistry in elucidating these pathways through the use of knockout mice, siRNA technology, liquid chromatography–mass spectrometry-based 'lipidomic' analysis, confocal microscopy, chemical biology, mathematical modelling and systems biology approaches.

There are several take-home messages. First, this ever-enlarging spectrum of bioactive lipids has, in effect, reversed our assumptions about the putative functions of lipid metabolism and the roles of minor lipids. Past generations of investigators may have been sceptical of the significance of lipids in cell biology, but we are now at a point where one can almost assume that lipids, which have regulated levels, are 'bioactive until proven otherwise'. Second, it is clear that these pathways are now accessible to the cell biologist, provided that due attention is given to the peculiarities of bioactive lipids and their pathways, as discussed in this review. Third, sphingolipid-mediated pathways operate at the level of individual organelles, and thus should be studied as such. Functions of ceramide in the ER are clearly different from those at the plasma membrane; even in the membrane, ceramide seems to regulate different functions depending on whether it is formed at the inner or outer leaflet. Similar considerations may apply to SK1 and SK2 (Ref. 116). Fourth, the complexity of sphingolipid metabolism and the metabolic interconversion of bioactive sphingolipids provide the cell with an extremely rich repertoire for not only generating multiple signals, but also for fine-tuning specific responses. Therefore, the field of bioactive sphingolipids constitutes its own area of biological '-omics', the 'sphingolipidome'. This generates the anticipation that many modern analytical techniques and the mathematical approaches of systems biology will be brought to bear on this field, as has been trialled with modelling of the sphingolipid metabolic pathways of yeast¹¹⁷.

The study of bioactive lipids is only now coming to the forefront of cell biology, representing possibly one of the last frontiers in molecular cell biology. Clearly, more work is required to dissect each of the many regulated pathways of bioactive sphingolipids and define the mechanisms of regulation of enzymes, roles of the pathways in specific cell responses, and mechanisms by which individual bioactive sphingolipids, which act in specific subcellular compartments, mediate those actions.

Principles of bioactive lipid signalling: lessons from sphingolipidsYusuf A. Hannun & Lina M. Obeid Nature Reviews Molecular Cell Biology 9, 139-150 (February 2008) | doi:10.1038/nrm2329

DATABASES

UniProtKB

FURTHER INFORMATION

Principles of bioactive lipid signalling: lessons from sphingolipids
Yusuf A. Hannun & Lina M. Obeid
Nature Reviews Molecular Cell Biology 9, 139-150 (February 2008) | doi:10.1038/nrm2329