Предыдущие экспериментальные находки, включали перевязку двухклеточных эмбрионов тритона (Spemann and Falkenberg, 1919) и трансплантацию PCMs эмбрионам кур (Hoyle et al., 1992), подтвердившими, что любые внутренне присущие различия в петлеобразовании между правой и левой PCMs происходили от правой и левой сторон эмбриона, соотв. Эксперименты с половинками с использованием перевязки и разделения ранних эмбрионов тритонов в данном исследовании строго подтвердили, эту возможность. Было четко продемонстрировано, что сердечная трубка, происходящая из правой PCM, образует петлю влево, в то время как сердечная трубка, происходящая из левой PCM образует петлю вправо. В наших разделенных эмбрионах правая и левая сердечные трубки формировались из правой и левой PCMs, соотв. Петли этих сердечных трубок были нормально ориентированы вправо у эмбрионов из левых половин независимо от стадии развития, на которой проводилась операция, но была обратной у эмбрионов из правой стороны разделенного исходного эмбриона на ст. 11-18. Эти результаты были идентичны тем, что были получены в более ранних экспериментах по-видимому, перевязке двухклеточных эмбрионов, они подтвердили, что PCMs происходящие из правой и левой половин эмбриона формируют петли сердечной трубки в зеркальной ориентации. Однако, во время последних стадий (18-21), правосторонняя PCM д. воспринимать сигнал, чтобы изменить направление петлеобразования сердечной трубки с левосторонней на правостороннюю, т.к. и правая и левая PCMs обладают способностью формировать петлю в правую сторону до слияния PCM. Организация цитоскелета (Latacha et al., 2005; Taber, 2006) и адгезивные свойства клеток сердечной трубки (Garcia-Castro et al., 2000) играют важные роли в петлеобразовании развивающейся сердечной трубки и скрорее всего такие факторы не могут собственно функционировать, пока и правая и левая PCMs не смогут сформировать правостороннюю петлю при их слиянии.

Мы также нарушали взаимодействия между левой и правой частями каудальных областей (эквивалентных nodal области эмбрионов млекопитающих и птиц), чтобы выяснить участие этой области в инверсии направления петлеобразования сердечной трубки, наблюдаемой у эмбрионов из правых половин. В этих экспериментах петли сердечной трубки формировались в случайном направлении, если каудальная область отделялась приблизительно на ст.18. Это возможно из-за нарушенных взаимодействий между правой и левой каудальными областями, нарушающих инверсию направления петлеобразования (с левонаправленного на правонаправленное) сердечной трубки, формируемой из правой PCM. У эмбрионов млекопитающих и птиц передача сигналов внутри nodal области такова из-за nodal тока, осуществляемого monocilia (Nonaka et al., 2002; McGrath et al., 2003; Tanaka et al., 2005) и передачей сигнала Ca²⁺ (McGrath et al., 2003; Raya et al., 2004), она важна для детерминации лево-правосторонней асимметрии разных органов, включая и сердце. Имеющиеся результаты указывают таким образом, что взаимодействия между правой и левой сторонами каудальной области являются важными для детерминации правонаправленного петлеобразования сердечной трубки ву эмбрионов амфибий, как это предполагается для эмбрионов млекопитающих (Nonaka et al., 2002; McGrath et al., 2003; Tanaka et al., 2005) и птиц (Raya et al., 2004).

Механизм детерминации лево-правосторонней асимметрии у позвоночных, заключается в том, что возникают различные сигналы от правой и левой сторон узелка или эквивалентных ему областей, к передней части эмбриона, чтобы вызывать индукцию экспрессии Nodal на левой стороне с одновременной супрессией экспрессии Nodal на правой стороне (Levin et al., 1995; Collignon et al., 1996; Lowe et al., 1996; Lohr et al., 1997). Это сопровождается ограниченной экспрессией транскрипционных факторов, таких как Pitx2 только на левой стороне эмбриона (Campione et al., 1999; Patel et al., 1999; Campione et al., 2001; Yu et al., 2001; Mogi et al., 2003; Toyoizumi et al., 2005), и только на правой стороне BMP (Ramsdell et al., 1999; Branford et al., 2000; Monsoro-Burq and Le Douarin,2000; Monsoro-Burq and Le Douarin, 2001) и SnR (Issac et al., 1997; Patel et al., 1999). Было предположено, что эти факторы также важны для детерминации правостороннего направления петлеобразования сердечной трубки у эмбрионов млекопитающих, птиц и амфибий. Базируясь на предыдущих сообщениях, мы оценивали роли каудальной области в такой детерминации путем у эмбрионов из правой и левой половин. Каудальная область была обязательной вплоть до приблизительно 23 стадии для инвертирования направления петли сердечной трубки у разделенных эмбрионов из правых половин, указывая на участие правой каудальной области, возможно благодаря сигнальным взаимодействиям, оказываемыми на переднюю часть правой PCM вплоть до приблизительно ст. 23, в детерминации направления петлеобразования сердечной трубки (Fig. 5).

Мы дополнительно исследовали участие Nodal-родственной передачи сигналов в инверсии петли сердечной трубки у разделенных из правых половин эмбрионов, используя эксперименты по бисекции. У нормальных эмбрионов CyNodal (nodal-related ген тритона) экспрессия выявлялась со ст. 21 до 25 только на левой стороне эмбриона и не наблюдалась на правой стороне (Ito et al., 2006). Однако, эмбрионов ст. 23-25 разделенных на ст. 15 или 21, CyNodal экспрессировался у 41% и 38% эмбрионов из правых половин, соотв. Структуры срединной линии, такие как хорда и донная пластинки нервной трубки супрессируют экспрессию Nodal на правой стороне эмбрионов (Danos and Yost, 1996; Lohr et al., 1997; Meno et al., 1998). Чтобы оценить образование хорды у разделенных эмбрионов, мы инкубировали эмбрионы из правых половин (разделенные на ст. 21) вплоть до ст. 36, когда структуры срединной линии становятся очевидными и готовили гистологические препараты. Хорда и нервная трубка были четко сформированными у 55% эмбрионов из правых половин (n=20, data not shown). Т.о., величина экспрессии CyNodal (38%) у эмбрионов из правых половин (разделенных на ст. 21) была приблизительно равной проценту эмбрионов из правых половин, которые не формировали хорду (45%). Этот результат сходен с тем, что был описан Lohr et al. (1997), когда экспрессия Xnr-1 (Xenopus nodal-related 1) также наблюдалась в правой латеральной пластинке мезодермы эмбрионов, из которых были удалены структуры срединной линии (включая хорду). Хотя экспрессия CyNodal отмечалась у 41% и 38% из наших эмбрионов из правых половин, разделенных на ст. 15 и 21, соотв., инверсия направления петлеобразования сердечной трубки составляла 13% и 80% у эмбрионов из правых половин, разделенных на ст. 15 и 21, соотв. Более того, величина экспрессии CyNodal составляла 0% и 100% в эмбрионах из левых половин, разделенных на ст. 11 и 21, соотв. и почти все петли сердечной трубки направлены вправо (100% и 96%, соотв.). Т.о., экспрессия CyNodal в эмбрионах из половин не коррелирует с процентом направления петлеобразования сердечной трубки.

Итак, наше исследование выявило, что (1) PCMs у эмбрионов из правых и левых половин независимо формируют петли сердечных трубок, (2) направление петлеобразования сердечных трубок из двух половин были обратными, когда эмбрионы разделялись на ранних стадиях и (3) правая PCM и левая PCM сливались после того как обе PCMs приобретали способность формировать петлю сердечной трубки в одном и том же направлении (правонаправленное петлеобразование). Однако, имеются несколько вопросов, которые остались без ответа. Как каждая PCM образует петлю в противоположном направлении (правонаправленное петлеобразование левой PCM, левонаправленное петлеобразование правой PCM) на ранних стадиях и как слияние левой PCM, дающей петлю вправо и правой PCM, дающей петлю влево, приводит в результате к случайному направлению петлеобразования.