Mechanotransduction in development: a growing role for contractility
Michele A. Wozniak & Christopher S. Chen Nature Reviews Molecular Cell Biology 10, 34-43 (January 2009) | doi:10.1038/nrm2592
Mechanotransduction research has focused historically on how externally applied forces can affect cell signalling and function. A growing body of evidence suggests that contractile forces that are generated internally by the actomyosin cytoskeleton are also important in regulating cell behaviour, and suggest a broader role for mechanotransduction in biology. Although the molecular basis for these cellular forces in mechanotransduction is being pursued in cell culture, researchers are also beginning to appreciate their contribution to in vivo developmental processes. Here, we examine the role for mechanical forces and contractility in regulating cell and tissue structure and function during development.
Рис.1. | Forces that regulate Drosophila melanogaster dorsal closure.
Рис.2. | Cell shape regulates proliferation through the small GTPase RhoA.
Рис.3. | Mechanical regulation of twist gene expression.
Рис.4. | Forces regulate the spatial organization of cells.
Стадии раннего развития от яйца до детального плана тела отличаются у разных видов, но в целом они часто характеризуются общими структурными перестройками (Box 1). На клеточном уровне большинство из этих стереотипических событий возникает благодаря скоординированной повторяющейся регуляции многих базовых клеточных процессов, включая пролиферацию, дифференцировку и пространственные перестройки (Box 1). В дополнение к обязательным функциям различных генетических программ и растворимых , эти клеточные процессы также регулируются с помощью механических сил. Установлено, как эти механические силы преобразуются в биохимические сигналы (механотрансдукция) и как механотрансдукция в свою очередь влияет на многочисленные функции клеток3.
Biomechanics during embryogenesis
Две основные силы вносят вклад в механические воздействия, которые воспринимаются клетками и влияют на поведение клеток в раннем развитии - механическая (жесткость) локальной тканевой среды и сократительная активность клеток, которая вызывает натяжение этой среды. Жесткость и вносят вклад в клеточные механические стрессы, которые существенны для механотрансдукции. Клетки обычно контрактируют, чтобы вызывать натяжение каркаса, к которому они прикреплены (extracellular matrix (ECM) или др. клетки), тем самым генерируется натяжение в клетке (внутренний механический стресс). Величина такого воздействия зависит как от силы сократительной активности в клетке, так и от жесткости субстрата. stress is affected both by the strength of contractile activity in the cell and the substrate stiffness. В развитии понимание взаимодействия между сократительной клеточной активностью , жесткостью окружающей ткани и возникающими в результате механическими деформациями и стрессами является критическим для уточнения нашей модели эмбриогенеза.
Stiffness of embryos. Имеются in vivo доказательства, что жесткость важна во время эмбриогенеза. Напр., во время гаструляции Xenopus laevis и расширяющие движения могут появиться только, если и остаются достаточно жесткими, чтобы противостоять перекашиванию4, 5. Во время того же самого процесса активно делается негибкой так, что эта ткань не спадается и не деформирутся во время гаструляции6. Являются ли эти изменения в тканевой жесткости на разных стадиях достаточно сильными, чтобы предоставить механическую силу для морфогенетических событий или присутствуют также mechanotransduction стимулы, чтобы контролировать др. клеточные процессы (такие как пролиферация или дифференцировка) остается неясным. Несмотря на это эти данные указывают на то, что существуют механизмы, чтобы модулировать тканевую жесткость и, более того, эти изменения в жесткости необходимы для хода развития. в
Из-за технических препятствий аккуратному измерению механических параметров in vivo (Box 2), лишь в немногих исследованиях непосредственно измеряли жесткость эмбрионов. Жесткость определяется эмпирически путем воздействия определенных сил на специфическую область (стресс), и последующего измерения возникших деформаций (strain). Наклон кривой stress-strain и есть жесткость, описываемая в единицах Pascals (Pa). Значения жесткости разных тканей во время гаструляции X. laevis колеблются в пределах от 3 до 14.2 Pa6. Сходным образом, вычисленная жесткость у эмброионов разных стадий Ambystoma mexicanum приблизительно равна 20 Pa7. Жесткость эмбриональных тканей низка по сравнению со взрослыми тканями6-8, которая колеблется от 17 Pa (человеческий жир) до 310 MPa (Ахилесово сухожилие крыс)9. Учитывая очевидную важность жесткости для функции клеток имеет особенно глубокий смысл разработка подходов для отслеживания, как значения жесткости изменяются в разных тканях во время многочисленных перемещений и тканевых перестроек, которые происходят во время эмбриогенеза.
Жесткость ткани может обеспечиваться несколькими разными факторами, включая жесткость клеток (которая обычно регулируется с помощью цитоскелета10), прочностью cell-ECM или межклеточных контактов, биохимические особенности ECM белков и организации и зрелости ECM. Предполагается, что во время конвергентных и расширяющих движений у X. laevis, жесткость возникает в первую очередь благодаря изменениям цитоскелета и ECM6. Принимая во внимание драматические изменения в межклеточной и клетка-матрикс адгезии, которые также происходят во время этих сложных перестроек клеток, вполне вероятно, что изменения в адгезии также вносят вклад в жесткость ткани. Однако из-за того. что манипуляции, направленные на одну из этих систем (цитоскелет, клеточную адгезию или ECM) часто в результате петли обратной связи затрагивают все три, трудно разработать соотв. in vivo модель для изучения того, как эти разные факторы вносят независимый вклад в жесткость ткани.
Жесткость ECM in vitro проявляется как важный регулятор клеточной функции. Уменьшение жесткости субстрата, по-видимому, изменяет клеточную структуру многих типов клеток: снижается распределение клеток по субстрату и образование фокальных адгезий и стрессовых волокон11. Изменения в жесткости также оказывают мощные эффекты на поведение. В прямом контрасте с традиционной культурой на пластиковых чашках, многие типы клеток сохраняют более дифференцированный фенотип, когда культивируются на менее твердом субстрате, это может отражать жесткость их тканевой среды in vivo9, 12-14. Спецификация (MSC) в разные клоны также строго зависит от влияния жесткости субстрата15. Когда MSCs культивируются на мягких субстратах, которые напоминают по жесткости ткань головного мозга, то генетическое профилирование указывает на то, что эти клетки подвергаются нейрональной дифференцировке. Однако на субстратах с промежуточной жесткостью, сходной с таковой поперечнополосатых мышц, MSCs дифференцируются в миобласты. На жестких субстратах, воспроизводящих жесткость кости, MSCs подвергаются остеогенезу15. Эти in vitro исследования подчеркивают важность влияния. которое жесткость может оказывать на клеточную функцию и подтверждает, что изменения в жесткости могут также регулировать клеточную функцию во время эмбриогенеза.
Cell-generated forces during embryogenesis. Помимо изменений в жесткости различные внутренние и внешние силы также вносят вклад в механические стрессы во время эмбриогенеза. Мы определяем эти силы на клеточном уровне: 'internal forces' означают контрактильные силы, которые генерируются внутри посредством актомиозинового цитоскелета, тогда как 'external forces' означают силы, которые генерируются вне клетки, которая реагирует на это силовое воздействие. Согласно этим определениям силы, генерируемые клеткой в одной части механически активной ткани (в которой сила является внутренней), могут вызывать пассивную деформацию соседней части ткани, так что ткань отвечает на внешнюю силу. Однако на тканевом уровне определение внешних сил означает силы, которые формируются вне системы (напр., внутрикардиальные силы жидкости, которые необходимы для эмбрионального кардиогенеза16). Хотя. эти типы внешних по отношению к ткани сил, также являются критическими во время эмбрионального развития16, но их анализ вне рамок данного обзора.
Примером клеточных внутренних сил (клетками генерируемых контрактильных сил), которые регулируют эмбриогенез, является случай X. laevis дорсальной involuting (уменьшающейся до нормальных размеров) и non-involuting маргинальных зон. Культивируемые экспланты этих тканей всё ещё конвергируют и расширяются, это указывает на то, что ткань сама - а не внешние силы, которые генерируются в разных местах эмбриона - активно регулируют эти движения при гаструляции17. Хотя имеется несколько методов, используемых для наблюдения и измерения генерируемых клетками сил in vitro на уровне одиночных клеток (Box 3), эти методы трудно переносить на эмбрионы (Box 2).
Один из методов, который используется, чтобы пролить свет на силы, которые необходимы для эмбриогенеза это лазерное устранение18-24 (Box 2). Laser-ablation исследования на Caenorhabditis elegans и Drosophila melanogaster выявили изменения в глобальных движениях, которые слишком быстры, чтобы их можно было бы объяснить каскадами сигнальных трансдукций, это указывает на то, что такие движения являются механическими по природе20, 23, 25. В согласии с laser-ablation исследованиями и количественное механическое моделирование, используемое для выдвижения гипотез относительно того, как эти силы регулируют движения в эмбрионе21, 23. Базируясь на laser-ablation исследованиях для проверки того, как разные ткани механически вносят вклад в D. melanogaster 21, 22, было предположено, что четыре силы вносят вклад в замыкание нервной трубки: во-первых, ведущий край латерального эпидермиса находится под натяжением и ведет себя подобно 'supracellular purse string'; во-вторых, амниосероза находится под натяжением; в-третьих, амниосероза контрактирует; и в-четвертых, натяжение в вентральном латеральном эпидермисе противодействует дорсально расположенным контракциям22, 23 (Fig. 1). Эти силы возможно возникают благодаря сокращениям, зависящим от не мышечного миозина II21, 22, т.к. восстановление моторной активности миозина в любой одной из трех областей, которые генерируют натяжение, может восстанавливать dorsal closure у мутантных по миозину эмбрионов26. в
Недавняя работа с использованием лазерного микроиссечения у эмбрионов D. melanogaster выявила апоптоз как др. неожиданный источник для генерации сил. Хотя апоптоз, как известно, происходит во время дорсального смыкания нервной трубки для удаления излишних клеток, он также вносит вклад от половины до трети сил, необходимых для дорсального смыкания27. In vitro исследования на эпителиальных монослоях показали, что соседние клетки увеличивают контрактильность. чтобы активно вытолкнуть апоптические клетки28 из монослоя. Следовательно, эти апоптические события у эмбрионов D. melanogaster могут действовать как пусковые механизмы локальных сокращений, которые могут распространяться по всей амниосероза, чтобы умножить генерацию сил, которые необходимы для осуществления dorsal closure27, 29.
Proliferation and mechanical stress
Пролиферация абсолютно необходима для развития, т.к. она создает необходимую клеточную массу для развивающейся ткани. Пролиферация д. тонко регулироваться во время эмбриогенеза, чтобы клетки не росли бесконтрольно, т.к. это может помимо прочих последствий нарушать форму эмбриона и его развивающихся тканей.
Mechanical feedback regulates proliferation. Wang and Riechmann недавно описали механизм, объясняющий как локальная пролиферация контролируется механическими стрессами во время морфогенеза у D. melanogaster30. По мере роста эпителиальных кист эпителиальные клетки пролиферируют и увеличивают область поверхности эпителия30. Локальная активность миозина на апикальной стороне эпителия ведет к увеличению натяжения в растущих эпителиальных кистах, это ведет к локальной пролиферации, чтобы регулировать тканевой рост во время оогенеза30. Более того, кисты деформируются, если активность миозина снижается или отсутствует, но блокада роста кист супрессирует подобны деформации, это указывает на то, что имеется связь между ростом кистозной ткани и клеточной пролиферацией30. Эти данные указывают на то, что тензионный стресс увеличивает пролиферацию, тогда как компрессия ослабляет рост30, 31. Недавние математические модели подтвердили, что такого типа механическая обратная связь может стабилизировать рост для поддержания очертания и формы ткани D. melanogaster32, 33.
Эта модель механической обратной связи в действительности была предположена 25 лет тому назад Ingber с сотр., которые предположили, что csks растяжения и сдавливания, которые передаются через ткань могут постоянно создавать обратную связь, чтобы регулировать очертания и форму ткани34. В нашей лаб. получены экспериментальные доказательства в подтверждение этой модели, показывающие, что регионы с высоким тензионным воздействием в эпителиальных монослоях коррелируют с повышенной пролиферацией in vitro35. Ингибирование натяжения, генерируемого миозином, или нарушение межклеточных контактов расслабляет эти регионы стрессов, это ведет к ингибированию пролиферации. Итак, форма и силы в ткани могут фактически давать обратную связь, чтобы регулировать рост35. Более того, не контрактильность per se, которая непосредственно регулирует пролиферацию, а скорее возникающие в результате механические стрессы, которые ассоциируют с контрактильностью, и могут передаваться через ткань. В этом отношении важно отметить. что механической обратной связью регулируемая пролиферация возможно используется в эмбриогенезе только после самых ранних стадий формирования . Хотя клеточные деления необходимы для формирования бластоциста из зиготы, но укороченный клеточный цикл, который контролирует пролиферацию на этой стадии, регулируется независимо от межклеточных взаимодействий36, 37.
Cytoskeletal tension regulates cell proliferation. Несколько линий доказательств указывают на натяжение цитоскелета как сильный регулятор пролиферации. Напр., снижение пролиферации наблюдается в гладкомышечных клетках на субстратах с низкой жесткостью или у тех. у которых ингибирована контрактильность38, 39. Малая GTPase регулирует сократимость40 и также необходима для пролиферации41. RhoA эффектор, Rho kinase (), индуцирует контрактильность посредством фосфорилирования легкой цепи миозина (MLC; известной также как MYL), а phosphatase увеличивает активность миозиновой ATPase42-44. In vitro, ингибирование ROCK во многих разных типах клеток ингибирует пролиферацию39, 45, 46, тогда как активация ROCK необходима и достаточна для индукции прохождения G1-S-фазы клеточного цикла47. Путь RhoA-ROCK, по-видимому, регулирует пролиферацию, по крайней мере, частично благодаря их эффектам на контрактильность и генерацию сил, и ингибирование миозина также блокирует пролиферацию in vitro35, 48. Контрактильная регуляция пролиферации наблюдалась также в моделях механотрансдукции кровеносных сосудов. In vivo, кровеносные сосуды являются предметом различных воздействий, которые создаются пульсовыми давлениями. In vitro модели, которые воспроизводят эти силы, показывают, что растягивание является мощным активатором передачи сигналов RhoA и пролиферации эндотелиальных и гладкомышечных клеток49, 50. Ингибирование RhoA или ROCK блокирует зависимую от растяжения пролиферацию49, это еще раз подчеркивает потребность в силах и контрактильности для пролиферации.
Linking proliferation and cell shape changes. Изменения в форме и морфологии клеток необходимы для большинства ступеней эмбриогенеза31. Хотя эти изменения обычно описываются как результат управляемых миозином клеточных движений или активация специфических генов51, форма клеток также играет важную роль. Folkman и Moscona впервые показали, что клеточная пролиферация может регулироваться изменениями в форме клеток52. Используя ), чтобы модулировать форму клеток, они установили, что синтез ДНК усиливается по мере распространения и распластывания клеток на субстрате, это указывает на то, что форма клеток играет ключевую - хотя и не дооцененую - роль в регуляции роста52. Ранние исследования, которые использовали изменения в плотности ECM, чтобы контролировать клеточную форму, также описывают регулируемую формой пролиферацию53. Усложненные printing технологии позднее были использованы, чтобы оценить степень клеточного распространения без изменения плотности ECM, чтобы подтвердить, что форма клеток per se передает пролиферативные сигналы54. Механистически кажется, что клеточная форма регулирует пролиферацию в поздней G1 фазе путем регуляции RhoA и его эффектора diaphanous (DIA) млекопитающих. Ограниченное распространение клеток блокирует RhoA и DIA-зависимую экспрессию SKP2 - если экспрессируемая эта ubiquitin ligase убиквитилирует cyclin-dependent kinase (CDK) ингибитор p27KIP и регулирует его деградацию55, 56. p27KIP (известен также как CDKN1B) является ингибитором комплекса cyclin D1-CDK4; p27 деградация устраняет это ингибирование комплекса, который фосфорилирует retinoblastoma (RB) и делает возможным ход клеточного цикла в распространяющихся клетках55, 56 (Fig. 2).
Регуляция пролиферации клеточной формой также, по-видимому, обеспечивается посредством эффектов формы клеток на ROCK-обусловленную контрактильность. Ограничение распространения клеток супрессирует активность RhoA, а генерация клеточных сил и постоянно активный RhoA восстанавливают пролиферацию в не распространяющихся клетках57, 58. Это подтверждает модель, в которой клеточная форма регулирует уровни RhoA-GTP, чтобы контролировать активность DIA и ROCK, оба из которых вносят вклад в клеточную пролиферацию (Fig. 2). в
Регуляция пролиферации с помощью клеточной формы и сил особенно интересна, т.к. имеется множество событий во время эмбриогенеза, которые используют драматические изменения в форме, структуре и механике клеток (see above). У взрослых, считается, что мышцы, кожа и др. мягкие ткани в конечности реагируют (увеличением пролиферации) не только на растворимые сигналы, но и также на силы натяжения, генерируемые растущими длинными костями. Эта модель рождена в ортопедических условиях, когда удлинение кости конечности приводи к скоординированному росту всех окружающих мягких тканей59. Поэтому как и во взрослых тканях мы постулируем что локальные стрессы и изменения формы, генерируемые во время позднего эмбриогенеза могут осуществлять локальный контроль пролиферации, который может поддерживать гомеостаз тканевой массы.
Mechanotransduction and differentiation
Дифференцировка необходима во время многих стадий развития, т.к. только дифференцированные клетки могут осуществлять свои специфические функции. Как механические силы, так и генерируемая клетками контрактильность регулируют дифференцировку in vitro и in vivo.
Twist is mechanically regulated in vivo. Интригующие доказательства на D. melanogaster подтверждают, что механотрансдукция может регулировать дифференцировку in vivo. Во время гаструляции, (GBE) вызывает эндогенное сдавливание stomodeal клеток, это коррелирует с увеличением экспрессии 60, 61. Это один из генов, который контролирует образование пищеварительного тракта62 и регулирует во время инвагинации мезодермы или средней кишки63. Растягивание в направлении одной оси эмбрионов D. melanogaster позитивно регулирует экспрессию twist , это указывает на то, что Twist чувствителен к механическим пертурбациям во время GBE61 (Fig. 3).
Чтобы протестировать роль механических сил на экспрессию twist лазером удаляли у D. melanogaster дорсальный эпителий, чтобы предупредить деформацию клеток переднего полюса будущего пищеварительного тракта эмбриона, которая обычно происходит во время гаструляции. Устранение лазером ингибирует как экспрессию twist в этих клетках и последующую инвагинацию ткани61. Нормальные уровни экспрессии stomodeal twist у laser-ablated эмбрионов ммогут быть восстановлены путем воспроизведения запускаемых GBE эндогенных трансформаций, используя или микроманипуляционную иглу или магнитный пинцет для сдавливания соседней ткани, в которую ввели ferrofluid60. Более того, femtosecond laser-pulse-induced ablation и third-harmonic generation microscopy (чтобы визуализовать как поля скоростей, так и клеточные движения во время D. melanogaster GBE) были использованы для подтверждения, что активные тканевые движения на вентральной стороне эмбриона коррелируют с механочувствительной экспрессией гена twist25. Механистически такое сжатие ведет к зависимой от силы транслокации в ядро (мышиный гомолог β-catenin), чтобы увеличить экспрессию twist -зависимым образом60, 61 (Fig. 3). Итак, эти данные указывают на то, что относительное сжатие или уменьшение размеров, которые вызываются с помощью GBE-индуцированных тканевых деформаций, распространяются посредством дорсальной ткани, чтобы контролировать экспрессию twist во время ранней гаструляции D. melanogaster60, 61.
Twist регуляция инвагинации мезодермы у D. melanogaster указывает на то, что активность Twist может иметь обратную связь, чтобы регулировать контрактильность во время апикального сужения. Как можно механически активировать экспрессию twist, чтобы в свою очередь регулировать клеточные контракции? Twist является мастером регулятором изменений клеточной формы во время инвагинации мезодермы. Twist активирует транскрипцию (fog), апикально секретируемого белка, который регулирует изменения клеточной формы во время гаструляции64. Эти мезодермальные клетки воспринимают этот FOG сигнал на своей апикальной стороне и это вызывает активацию RhoA exchange фактора, Rho guanine nucleotide-exchange factor 2 (RhoGEF2)51, посредством двух кооперативных механизмов. RhoGEF2 высвобождается из микротрубочек и локализуется на апикальной стороне клеток65. В то же самое время Twist-зависимая позитивная регуляция трансмембранного белка T48 доставляется в апикальную мембрану, где он соединяется с RhoGEF2 (посредством своего PDZ домена)66. Такая апикальная локализация приводит к усилению активности Rho эффектора ROCK. Асимметричная активность ROCK ведет к поляризованному накоплению актина и миозина; поэтому поляризованный актомиозин сокращается на апикальной стороне, это приводит к сужению 51. Т.к. актин прикреплен к слипчивым соединениям, то такие контракции, как полагают, вызывают апикальное расположение этих межклеточных контактов у D. melanogaster51. Важно, что контракция соотв. образом регулируется во время апикального сжатия. Это может завершаться, если движения, создаваемые с помощью сужения активируют Twist, приводя к петле позитивной обратной связи67.
Contractility regulates differentiation. Дальнейшими подтверждениями, что контрактильные силы необходимы в развитии, получены в исследованиях детерминации и дифференцировки MSC клона. Генетический нокаут у мышей p190B Rho GTPase-activating protein (RhoGAP), который является негативным регулятором активности RhoA, вызывает дефекты адипогенеза68. p190B RhoGAP-нокаутные фибробласты обнаруживают дефектный адипогенз и усиленный миогенез, это указывает на то, что усиление активности RhoA ингибирует дифференцировку в адипогенный клон68. При изучении роли RhoA-обусловленной контрактильности в детерминации и дифференцировке клонов in vitro человеческих MSCs, было установлено, что RhoA и ROCK-генерируемые контракции необходимы для детерминации MSC в клеточную судьбу остеобластов. Этот путь ингибирует MSC адипогенез48. Более того, адипогенез ингибируется в распространяющихся клетках69. Мы подтвердили, что клеточная форма действует как мастер регулятор в выборе этого клона48. Эти исследования выявили участие RhoA и ROCK-генерируемой контрактильности в качестве медиатора формой регулируемой детерминации клона, при этом хорошо распространяющиеся клетки увеличивают контрактильность и остеогенез, а не распластывающиеся клетки супрессировали контрактильность, что способствовало адипогенезу48. Эффект жесткости субстрата на дифференцировку MSC клонов (see above) также зависит от контрактильности, т.к. подавление не мышечного миозина II блокирует дифференцировку в любой из изученных клонов: нервный, миогенный или остеогенный15. Итак, эти исследования подтверждают центральную роль контрактильных сил для дифференцировки во время развития.
Контрактильность также регулирует in vitro дифференцировку во взрослых тканях. Известно, что эпителиальные клетки молочных желез формируют дифференцированные структуры только, если культивируются на плавающем (floating) коллагеновом геле, но не на более ригидных субстратах, такх как двумерные стекла, чашки петри или даже голлагеновый гель, который остаются прикрепленным к чашке70, 71. Эта находка важна, т.к. культура клеток молочных желез на ригидных двумерных субстратах отличается от условий in vivo с которыми обычно встречаются клетки13. Для дифференцировки молочного эпителия необходима контракция плавающего коллагенового геля72. Это было важным наблюдением, т.к. позднее было показано, что многие типы клеток вызывают сокращение своего окружающего матрикса во время дифференцировки in vitro и морфогенеза73-76. Ингибирование миозином обусловленной контрактильности блокирует контракцию матрикса и дифференцировку, подтверждая тем самым, что сократительные силы необходимы для дифференцировки многих разных типов клеток и контекстов in vitro13, 15, 76, 77.
Т.о., хотя GBE-индуцированная регуляция Twist у D. melanogaster обнаруживает сложные взаимодействия между механическими силами, генной экспрессией и дифференцировкой в контексте развития, исследования in vitro подтверждают, что многие др. факторы д. присутствовать, чтобы руководить многими сложными движениями, которые потребны для раннего эмбриогенеза. Присутствие таких механизмов механотрансдукции в стволовых клетках взрослых и в дифференцированных клетках подчеркивает очевидный пробел в нашем понимании их значения для биологии развития.
Spatial organization of cells
Пространственная организация клеток регулируется с помощью морфогенетических движений и является критической для структуры и функции ткани. Имеется несколько примеров того, как механотрансдукция и контрактильные силы могут регулировать движения эмбриональных клеток, в результате чего и возникает клеточная и тканевая организация.
Cell-generated force in border-cell migration. Механические силы, как полагают, важны для миграции пограничных клеток (border-cell) - при которой кластеры фолликулярных клеток D. melanogaster мигрируют к центру развивающихся яйцевых камер в направлении границы питающие клетки-ооцит во время оогенеза78 (Fig. 4a). Динамика цитоскелетного filamentous (F)-actin контролирует критический пропускной пункт (checkpoint) этой миграции, т.к. мутации по actin-regulatory белкам нарушают миграцию пограничных клеток79. Динамика F-actin регулирует активность транскрипционного фактора serum response factor () и его кофактора (также известного как MKL1)80. В свою очередь SRF-обусловленная транскрипция регулирует экспрессию многих белков, включая actin-регулирующие белки81. В самом деле, пограничные клетки, экспрессирующие мутантный MAL, обнаруживают измененные цитоскелетные перестройки и динамику F-actin, это ведет к фрагментации клетки; такая фрагментация предупреждает продуктивную миграцию пограничных клеток79, 82.
Механическое натяжение, как полагают, регулирует экспрессию SRF-зависимых генов у D. melanogaster. Анализ ядерной локализации MAL (который является показателем активности) показал, что ядерная локализация MAL наиболее очевидна в клетках, которые, по-видимому, вытянуты82. Чтобы определить, может ли растягивание непосредственно влиять на транслокацию в ядро MAL, анализировали (slbo) мутантов в отношении локализации MAL. Эти мутантны не могут мигрировать. Однако т.к. клетки движутся в виде кластера во время миграции пограничных клеток, а не как индивидуальные клетки, то их могут тянуть др. клетки дикого типа, возможно благодаря адгезивным комплексам82. Поэтому было предположено, что индуцируемое натяжением накопление в ядре MAL позволяет MAL и SRF поддерживать генную экспрессию, которая необходима для крепкого цитоскелета, который необходим для эффективной миграции и клеточной дифференцировки82 (Fig. 4a). Растяжением индуцируемая регуляция SRF также увеличивает маркеры дифференцировки in vitro в сосудистых гладкомышечных клетках84, это подтверждает, что локальное растяжение, генерируемое др. клетками, может быть общим механизмом, который участвует в непосредственной дифференцировке и морфогенезе ряда тканей.
Wnt regulates contractility in embryogenesis. - секретируемые белки, которые являются важными регуляторами развития. Они соединяются с Frizzled (FZ) семейством рецепторов и членами семейства low-density-lipoprotein receptor-related protein (LRP), чтобы активировать несколько внутриклеточных сигнальных каскадов, которые регулируют поведение разных клеток85. Передача сигналов Wnt необходима для установления и поддержания клеточной полярности во время гаструляции C. elegans86-88. Помимо регуляции полярности передача сигналов Wnt модулирует также организацию актинового цитоскелета и контрактильных сил87. В начале гаструляции разные типы клеточных предшественников д. разделиться и индивидуальные типы клеток затем подвергаются апикальным сужениям, что позволяет им проникать внутрь, это приводит к разделению формирующихся зародышевых слоёв. Передача сигналов Wnt ведет к фосфорилированию MLC в апикальном кортексе, это генерирует апикальные контракции во время этого процесса87.
Передача сигналов Wnt регулирует также конвергентные и расширяющиеся движения у X. laevis и рыбок данио89-91 (Fig. 4b). Во время элонгации X. laevis передача сигналов Wnt-FZ активирует цитоплазматический каркасный белок Dishevelled и Dishevelled-associated activator of morphogenesis 1 (DAAM1)90, это ведет к активации малой GTPase Rho90, 92. Активация Rho регулирует цитоскелетные изменения. которые вносят вклад в передачу сигналов planar cell polarity (PCP)90 (известен также как неканонический Wnt путь; Fig. 4b). В противоположность каноническому Wnt пути, путь PCP является транскрипционно независимым и содержит разных молекулярных игроков93. приводит ли передача сигналов Wnt-Rho к изменениям в контракции. остается неясным. Однако путь PCP передает сигналы Rho и ROCK (Ref. 93). ROCK является мощным регулятором контрактильности и, следовательно, возможно, что путь PCP также регулирует клеточную сократимость. в
Wnt регуляция Rho и контракции актомиозина имеет важное значение для механотрансдукции во время эмбриогенеза. In vitro исследования показали, что передача сигналов Wnt может играть роль в механотрансдукции. Во-первых, в остеобластах, сдирающее действие жидкости активирует Wnt пути ниже ранних механочувствительных генов beta1 integrin (IGTB1) и cyclooxygenase 2 (; также известно как PTGS2), которые обеспечивают передачу сигналов ниже shear-регулируемой пролиферации остеобластов94. Во-вторых, Wnt ко-рецептор LRP5 необходим для индуцируемой натяжением механотрансдукции в остеобластах95. Растяжение также снижает экспрессию Wnt-LRP5 ингибитора (который кодируется SOST), это указывает на то. что существуют механизмы, чтобы регулировать активность Wnt ниже механических сигналов. Время предположить, что различные механические движения в эмбриогенезе могут локально активировать или модулировать передачу сигналов Wnt способом, сходным с механической индукцией экспрессии twist60, 61. Механическая регуляция передачи сигнлов Wnt может оказаться высоко эффективной для создания механических 'checkpoints' , контролирующих активацию и продолжительность сигнала Wnt во время эмбриогенеза, гарантируя тем самым, что определенные структурные критерии будут встречаться прежде, чем будет запущена следующая стадия развития.
Diverse roles for contractility. Контрактильные силы необходимы для многочисленных процессов во время движений, которые регулируют пространственную организацию клеток в эмбриогенезе. Миозин участвует и в некоторых др. процессах, которые показывают, что генерируемые клетками силы неожиданно обладают разнообразными существенными ролями в эмбриогенезе. Напр., миозин участвует в клеточной сортировке в начале гаструляции. Одна из моделей того, как разделяются типы клеток предшественников, является гипотеза дифференциальной адгезии, которая утверждает, что сортировка клеток является следствием разных адгезивных свойств, которые наследуются клетками96. Krieg недавно перепроверил этот феномен на рыбках данио и установил, что различия в натяжении клеточного кортекса, зависимого от актомиозина, необходимо и достаточно для сортировки предшественников97. Это исследование показало, что помимо дифференциальной адгезии локальная регуляция цитоскелетного натяжения предоставляет др. способ изменения энергии на поверхности раздела фаз, который управляет клеточной сортировкой. в
Др. неожиданная роль миозина была продемонстрирована во время D. melanogaster GBE, т.к. клетки меняют позицию, чтобы физически расширять и удлинять ткани во время гаструляции. Ни изменения клеточной формы, ни регулируемая клеточная пролиферация, по-видимому, не способны регулировать GBE98. Скорее клеточные перестройки регулируются за счет контролируемого глобального ремоделирования слипчивых соединений, которое возникает в результате обеспечиваемой myosin II разборки соединений99. Присутствие myosin II в слипчивых соединениях и потребность в нем для клеточных движений во время GBE указывает на то, что локальные контрактильные силы между клетками (а не внешние силы) управляют D. melanogaster 99. Хотя др. механизмы также могут контролировать клеточные перестройки в др. тканях и организмах31, 100, но эти данные указывают на то, что локальные генерируемые клетками контрактильные силы являются важными регуляторами клеточных функций во время эмбриогенеза.
Conclusions and future perspectives
Although mechanotransduction classically refers to the response of cells to applied forces, we have come to appreciate the importance of the forces that cells exert through regulated actomyosin contractility. These contractile forces allow cells to sense and respond to various different mechanical and structural contexts, and seem to be required for many steps in embryogenesis. Because the characterization of forces in vivo is a complicated and daunting task, it is important for the field to be able to draw from in vitro mechanotransduction studies to help explain complex developmental behaviours in vivo. Furthermore, understanding how cells sense and respond to mechanical cues is important not only for our understanding of embryogenesis but also for diseases, such as cancer, in which the mechanical properties of the microenvironment are postulated to regulate tumorigenesis13 (see the Review by Jaalouk and Lammerding111 in this issue).
To continue this type of comparative analysis, three main areas warrant further study in vitro. First, much of our understanding of cellular forces is based on measurements of those forces when cells are in isolation. Given that embryonic cells are almost always in contact with other cells, it is important that forces are also examined in multicellular contexts and that the forces between cells are characterized, as well as the forces that are exerted on matrices. Second, the role of key developmental patterning genes (such as the Wnts, BMPs and transcriptional regulators) in mechanotransduction should be further defined given their essential role in development. Finally, because we do not understand the constitutive behaviour of embryonic tissues, the field is in dire need of sophisticated in vitro three-dimensional experimental and conceptual models that will allow the detailed analysis of single cells embedded in tissues. These models should recapitulate specific aspects of embryogenesis, including physiological ranges of stiffness, to study how both forces and genetics cooperate to regulate cell rearrangements and tissue movements.
In parallel, to better understand how biomechanics controls development, we must have a more complete appreciation of the forces that are generated during embryogenesis. These forces, whether generated by the cell or external to the tissue, should be capable of both mechanically deforming the embryo and causing changes in signal transduction and downstream cellular processes that are required for development. Once these forces are characterized, forces (of physiological magnitude and duration) can then be reapplied to the embryo to determine the physical and biochemical responses60. In cases for which contractile forces are distributed throughout the embryo21, 22, this analysis will be crucial to understand how cells locally and globally respond to force. A detailed characterization of these forces, combined with quantitative modelling, will be necessary for the field to determine how mechanotransduction cooperates with other known pathways to regulate development. Therefore, to have a more complete understanding of development, our future challenge is to develop advanced in vitro and in vivo models to link the biochemical and biomechanical events of embryogenesis.
Note added in proof
During the final preparation of this article, some important findings were published that corroborate the crucial role of myosin-mediated contractility during embryogenesis. Although it has been accepted that a continuous 'purse-string' contraction drives apical constriction, recent work has revealed that apical constriction in D. melanogaster embryos is pulsed112. Continuous pulses of contractions, followed by the stabilization of those contractions, lead to apical constriction during gastrulation112. Interestingly, in later embryogenesis, contractility during D. melanogaster elongation also has a key morphogenetic role. Differential myosin distribution generates anisotropic cortical forces that can drive junctional remodelling and intercalation during elongation113. Together, these findings support the key role of mechanical force during development and further our understanding of how these contractile forces are locally controlled.
