Посещений:
микроРНК

Эволюция Регуляции Транскрипции

The evolution of gene regulation by transcription factors and microRNAs
Kevin Chen and Nikolaus Rajewsky
Nature Reviews Genetics 8, 93-103 (February 2007) | doi:10.1038/nrg1990

Changes in the patterns of gene expression are widely believed to underlie many of the phenotypic differences within and between species. Although much emphasis has been placed on changes in transcriptional regulation, gene expression is regulated at many levels, all of which must ultimately be studied together to obtain a complete picture of the evolution of gene expression. Here we compare the evolution of transcriptional regulation and post-transcriptional regulation that is mediated by microRNAs, a large class of small, non-coding RNAs in plants and animals, focusing on the evolution of the individual regulators and their binding sites. As an initial step towards integrating these mechanisms into a unified framework, we propose a simple model that describes the transcriptional regulation of new microRNA genes.


Рис.1.  | Gene regulation by transcription factors and microRNAs.


Рис.2.  | A model of the acquisition of a new microRNA.


Box 1  | Transcription factors and microRNA genes — an overview


Box 2  | MicroRNA gene discovery: bioinformatics and experimental methods


Box 3  | MicroRNA target prediction: bioinformatics and experimental methods

FURTHER INFORMATION

The Rajewsky laboratory web site NYU Department of Biology and Center for Comparative Functional Genomics

DATABASES

Entrez-Gene

let-7 miR-1 Pax6 Nkx2-5 miR-7 miR-10 miR-100 UniProtKB dicer Pumilio
Появление сложных, многоклеточных организмов сопровождается и вообще облегчается драматическим увеличением сложности механизмов генной регуляции1,2. На уровне транскрипционной регуляции можно четко видеть массивную экспансию семейств транскрипционных факторов и всепроникающий комбинационный контроль генов с помощью множественных транскрипционных факторов у высших организмов1,3 (Box 1). На уровне посттранскрипционного контроля возникают полностью новые механизмы, характеризуемые крупным и всё увеличивающимся классом длиной в 22 нуклеотида некодирующих РНК, известных как microRNAs (miRNAs), которые действуют как репрессоры в геномах всех известных животных и растений 4,5 (Box 1). Хотя транскрипционные факторы и miRNAs являются двумя хорошо изученными механизмами регуляции генов, существует множество др. слоев генной регуляции, включая: передачу сигналов клетками; сплайсинг, полиаденилирование и локализация мРНК; модификации хроматина; и механизмы локализации, модификации и деградации белка (Fig. 1).
Но почему высшие растения и животные используют столь сложную, многослойную регуляторную систему? Является ли только комбинаторная транскрипционная регуляция достаточной, чтобы специфицировать онтогенетическую программу? Какрвы относительные вклады разных механизмов генной регуляции в изменения на фенотипическом уровне? Участвуют ли все разные способы генной регуляции одним и тем же способом и в той же доле? Хотя первенство транскрипции как необходмой первой ступени генной экспрессии бесспорно, это не означает, регуляция транскрипции оказывает наивыссший эффект на финальную концентрацию продуктов активных генов, что наиболее важно для фенотипического проявлениe.
Важной целью будущих исследований является выяснение, как сложные ген регуляторные сети участвуют и как их эволюция приводит к фенотипическим изменениям и видообразованию. Однако, необходимая первая ступень в направлении этой цели является понимание базовых принципов, лежащих в основе эволюции индивидуальных регуляторов и их регуляторных взаимодействий с их генами мишенями. Недавние компьютерные и экспериментальные исследования сделали возмножным начать исследование эволюциии транскрипционных факторов, miRNAs aи их сайтов связывания и сравнить долю и способ использования этих двух важных регуляторных механизмов.
В конце концов полная картина эволюции генной регуляции нуждается в синтезе информации обо всех различных компонентах геных регуляторных сетей. В качестве начальной ступени мы предлагаем простую модель, в которой эволюция транскрипционого контроля генов miRNA у животных сама по себе является важной ступенью в успехе приобретения новых miRNA. Естественным следствием этой модели является то, что имеются miRNAs , которые транскрибируются на низком уровне и в специфических типах клеток, которые могут обладать незначительной биологической функцией в регуляции генов мишеней в trans.

Транскрипционные факторы и miRNAs в развитии


Обсуждение эволюции регуляции генов нельзя завершить без упоминания онтогенетической роли самих регуляторов, т.к. эти роли оказыают определенные воздействия на развитие регуляторных взаимоотношений6,7. Более того, если мы примем, что развитие является следствием разворачивания точных и мощных пространственно-временных паттернов генной экспрессии, тогда это будет находиться в контексте развития того, что эволюция генной регуляции наиболее тесно связана с эволюцией организмов3,7,8,9.
В сложных многоклеточных организмах транскрипционные факторы обычно не работают в изоляции, напротив вместе с ко-регуляторами, они формируют крупные сети кооперирующих и взаимодействующих транскрипционных факторовs3,8. Широко распространено мнение, что скорость эволюции регуляторных взаимоотношений не гомогенна по всей сети. Напр., в одной из моделей, предложенных Davidson с коллегами, онтогенетические сети у животных могут быть подразделены на субсети, ключая : высоко законсервированное 'ядро' , которое специфицирует пространственный домен, в котором будут развиваться определнные части тела; компоненты 'подключения', такие как сигнальные транскрипционные кассеты, которые используются повторно во множественных онтогенетических контекстах; батареи генов терминальной дифференцировки, которые состоят из всех генов, которые определяют определенный тип клеток; и 'переключатели вход-выход', такие как Hox гены, которые позволяют или не позволют действовать определенным онтогенетическим процессам в специфическом пространственно временном контексте3,7. Авт. полагают. что каждая из этих типов субсетей обладает своим собственным набором эволюционных ограничений и что изменения разных субсетей будут приводить к к качественно иным типам изменений на фенотипическом уровне. Напр., ядра по определению высоко консервативныи их сосуществоание в течение длительных периодов эволюционного времени может объяснить высокую степень консерватизма плана тела внутри филетических образрований животных. Напротив наборы генов дифференцировки, будучи, по крайней мере, плейотропными из всех регуляторных взаимоотношений, являются черезчур поддатливыми к изменениям и такие изменения могут приводить к фенотипичеким различиям на уровне вида (for details, see Refs 3, 7).
Различные исследования показали, что miRNAs выполняют важные роли в развитии животных и растений (see Refs 10- 14 for a consideration of the developmental roles of miRNAs). Некоторые хорошо известные примеры включают miRNAs с ролью, схожей с переключателями, такие как lin-4 и let-7 в предопределени времени развития у Caenorhabditis elegans15,16 или miRNAs , которые участвуют в развитии листьев или цветков у растений (reviewed in Ref. 13) и miRNAs , которые обеспечивают более общее тканевое и временное сходство, такие как miR-1 вDrosophila melanogasterразвитии мышц17 и miR-430 в материнско-зиготическом переходе у рыбок данио18.
Большинство современных доказательств роли miRNAs в раннем развитии дискуссионно или трудно для интерпретации11. Во-первых, эмбрионы рыбок данио, которые лишены материнского белка dicer, который необходим для биогенеза miRNA(Box 2), проходят процесс формирования оси и регионализации19, факт, который строго говорит против роли miRNAs в раннем развитии рыбок данио. Но нокаутные dicer мыши20 иArabidopsis thaliana , которая несет гипоморфные аллели гомолога dicer DCL-1 погибают в раннем эмбриогенезе21. Во-вторых, хотя miRNAs не были обнаружены у ранних эмбрионов рыбок данио и медака22,23, зрелые miRNAs были обнаружены у мышей24 и эмбрионов D. melanogaster 25. Первичные транскрипты miRNA пространственно регулируются рано у D. melanogaster embryogenesis26, с указанием на то, что процессинг первичных miRNAs в зрелые miRNAs (Box 2) может регулироваться24. В-третьих, на база нокдауна miRNA с использованием 2'-O-methyl антисмысловых олигорибонуклеопротеидов, было утановлено, что miRNAs участвуют в формировании паттерна эмбрионов D. melanogaster 27, хотя ряд из этих результатов не согласуется с экспериментальными данными генетических нокаутов28.
Превалирующим мнением (напр., Refs 3, 29 and the references therein) является то, что miRNAs как класс стремится действовать как механизмы нокдауна для уже дифференцированных состояний или обеспечивают дополнительный слой эксплуатационной надежности или снижения 'шумов' 30,31 на онтогенетический процесс скорее, чем играют фундаментальную роль в формировании плана тела. Однако, т.к. функции лишь немногих miRNAs были установлены в деталях, то мы полагаем, что эта точка зрения не является окончатеьно доказанной, по крайней мере, не как общий принцип.

trans-factor evolution


Независимая эволюция транскрипционных факторов и miRNAs в растительном и животном царствах. Широко распространена вера, что, по крайней мере, последний общий предшественник растений и животных был одноклеточным и поэтому развитие растений и живтоных осуществлялось независимо (for example, Ref. 32). Развитие и животных и растений зависит от 'master' регуляторов транскрипционных факторов, вообще-то известны MADS-box белки у растений и гомеодоменоые белки у живторныхs32. Оба эти семейства транскрипционных факторов и большинство др. семейств транскрипционных факторов, которые обнаружены у растений или животных, предшествуют дивергенции двух царств. Однако, на уровне последовательностей эти родоначальные семейства транскрипционных факторов обычно плохо законсервированы помимо ДНК-связывающих доменов, которые и определяют семейства. Более важно, что их онтогенетические функции, по-видимому, различны. Напр., MADS-box белки, по-видимому, не обладают той же самой фундаментальной ролью у животных, какую они играют у растений; верно и противоположное для гомеодоменовых белков. Более того, существенная пропорция семейств транскрипционных факторов фактически специфична для каждого царства (напр., >45% у C. elegans иA. thaliana)33. Итак, несмотря на то, что многие родоначальные семейства транскрипционных факторов предшествуют дивергенции растений и животных, общаяя картина эволюции транскрипционных факторов у растений и животных указывает на приобретение новых семейств транскрипционных факторов и диверсификацию существующих семейств.
Сходным образом общепринято, что miRNAs используются независимо у животных и растений, т.к. не известны гомологи miRNAs у животных и растений (but see Ref. 127 for some evidence to the contrary) и биогенез miRNA и механизм miRNA-обусловленной генной репрессии совершенно различны у растений и животныхs (Box 1). Дальнейшие доказательства тому получены из филогенетического распределения miRNAs, особенно впечат ляет отсутствие miRNAs у губок и грибов. В первом приближении, гены miRNA большинство семейств транскрипционных факторов зазвиваются независимо в царстве растений и животных.

Deep conservation of transcription factors and miRNAs.


Хорошо известно, что многие транскрипционные факторы высоко консервативны на огромных эволюционных дистанциях и некоторые играют сходные онтогенетические роли у разных видов. Hox гены, которые регулируют развитие вдоль передене-задней оси у большинства животных, уже вошли в учебники. Др. примеры у позвоночных и многих беспозвоночных включают гены paired box 6 (Pax6) , которые управляют развитием глаз и передней части нервной системы, и Csx/Nkx2-5/Tinman гены, которые управляют развитием висцеральной мезодермы и сердца (reviewed in Ref. 8). Хотя такое широкое сыходство функций и интригует, ничего неизвестно, что они обладают полным функциональным перекрыванием в отношении удаленных гомологов или даже эволюционно законсервированной онтогенетической ролью34.
Скорее всего, многие miRNAs, по-видимому, чрезвычайно консервативны. Наиболее известный пример это let-7, который законсервирован филогенетически у всех bilaterians, которые были исследованы, за одним исключениемacoel flatworms35,36. Более того, точная последовательность зрелой формы let-7, паттерн его временной экспрессии и в некоторых случаях его syntenic позиция в геноме законсервированы35,36. Некоторыми др. хорошо известными примерами являются мышце-специфическая miR-1, которая законсервирована у нематод, млекопитающих и мух (Ref. 17 and the references therein) и miR-7, зрелая форма которой совершенно консервативна у млекопитающих и мух и которая расположена в интроне одного и того же гена обоих группах.
Некоторые группы используют сравнения биоинформационных последовательностей или исследования northern blots консервации miRNAs у разных видов животных37,38,39. Они установили, что 18-30 семейств miRNA, по-видимому, законсервированы у всех bilaterians, которые были изучены, в зависимости от точности использованных биоинформационных методов. Три из этих семейств miRNA были найдены у cnidarians, но не найдены у губок38,39. Как обсуждщалось ранее это подтверждает гипотезу независимой эволюции miRNAs у растений и животных. Одна из cnidarian miRNAs, miR-10, была обнаружена с помощью northern blots и особенно интересна, т.к. она присуствует в кластере Hox и регулирует Hox гены у Drosophila и позвоночных38,40. В целом уровень консервации последователностей большинства miRNAs в общем высокий, хотя консервация последовательностей не обязательно связана с консервацией функциональной 23.
Дальнейшие доказательства глубокой консервации генов miRNA у животных на уровне всего генома могут быть обнаружены при cross-clade сравнениях высоко законсервированных мотивов (highly conserved motifs (HCMs)) в 3' UTRs. Xie et al. показали. что HCMs у позвоночных сильно обогащены сайтами, связывающими miRNA41. Мы и др. раширили эти результаты на нематод и мух42,43, и было показано, что HCMs высоко консервативны у позвоночных, нематод и мух (Supplementary information S1 (figure)). Т.к. многие HCMs, как ожидается, представлены мотивами распознавания miRNA, то эти анализы дают непрямые доказательства глубокой консервации генов miRNA.
Выборки miRNAs у растений менее обширны, чем у животных, с большинством растительных miRNAs, которые известны, как открытые у A. thaliana (напр., Ref. 44). Несмотря на это некоторые примеры глубокой консервации растительных miRNAs известны благодаря секвенированию miRNAs у мхов45,46,47. Некоторые из этих примеров особенно впечатляющие, благодаря их регуляторным взаимоотношениям с их мишенями, также, по-видимому, законсервированными.

Lineage-specific expansions of transcription factors and miRNAs.


Клон-специфические экспансии семейств транскрипционных факторов широко распространены и считается играют важную роль в диверсификации и усложнении растений и животных1,3,9. Интересно, что имеющиеся доказательства этой экспансии семейств транскрипционных факторов более значительны у растений, чем животных48,49,50. В принципе, это д. отражать фундаментальные отличия между биологие2й растений и животных. Однако, альтернативное объяснение заключается в том, что A. thaliana подверглась недавно удвоению всего генома, в то время как предполагаемые удвоения всего генома в ветви животных являются более древними: непосредственно после события широкомасштабного удвоения потеря транскрипционных факторов может быть неблагоприятной, если она изменяет относительные концент рации набора транскрипционных факторов, которые экспрессируются в клетке51, приводя к повышению доли сохранения транскрипционных факторов у растений по сравнению с животными.
Некоторые детальные исследования на растениях52 и животных53,54 показали, что семейства miRNA могут увеличиваться с помощью того же самого процесса удвоений тандемных, сегментных или целого генома, как и в случае белок-кодирующих генов. Семецйства miRNA у растений обнаруживают тенденцию быть больше и их члены более сходны др. с др. чем семейства miRNA у животных (reviewed in Ref. 55). Это указывает на то, что экспансия семейств у растений более недавняя и что основным эффектом существования множественных копий паралогов одной и той же miRNA у растений является увеличение дозы. Напротив, члены семейств животныхl miRNAs могут стремиться к синергичным, но функционально самостоятельным ролям, как показано для let-7 семейства у C. elegans56,57.

cis-element evolution


Шмроко-масштабная перестройка miRNA-обусловленных регуляторных взаимоотношений на крупных эволюционных расстояниях у животных, но глубокая консервация у растений. Хотя miRNAs сами по себе, по-видимому, очень консервативны, имеется лишь несколько miRNA-мишень регуляторных взаимоотношений, которые как известно законсервированы на огромных эволюционных расстояниях у животных (напр., между позвоночными и Drosophila видами). Известны два случая, а именно let-7:lin-41 и let-7:let-60–RAS, в которых взаимоотношения с мишенью были экспериментально установлены у C. elegans и для которых были получены доказательства консервации у млекопитающих благодаря компьютерным предсказанием мишеней и реципрокным паттернам экспрессии miRNA и мРНК в клеточных линиях58,59. Др. взаимоотношение miRNA-мишень, lin-4:lin-28, было выявлено экспериментально у C. elegans, и имеются компьютерные и по генной экспрессии доказательства, что оно законсервировано у ряда др. видов животных, включая млекопитающих60,61. Однако, даже в этих случаях необходимо с осторожностью его интерпретировать, т.к. существование тех же самых регуляторных взаимоотношений у сильно разошедшихся видов не всегда подразумевает, что оно эволюционо законсервировано в противовес независимой эволюции. Напр., хорошоизвестный транскрипционный фактор Pax6 участвует у млекопитающих и у Drosophila в развитии глаз, а эктопическая экспрессия мышиного гомолога у Drosophila может индуцировать развитие эктопических глаз у Drosophila, но неясно представляет ли это регуляторное взаимоотношение консервацию или конвергентную эволюцию3.
Эти изолированные примеры казусы, а консервация предсказаннная с помощью вычислений мишеней miRNA между позвоночными, Drosophila и нематодами, по-видимому, близка к шансам случайного возникновения28,42,43,62. Эти результаты, по-видимому, сильны, даже если учтены алгоритмы ложно-позитивных и ложно-негативных величин предсказаний мишеней и возможные ошибки вовлечения гомологичных генов и miRNAs42. Вместе с высоким уовнем консервации, которая наблюдается для самих генов miRNA, это указывает на то, что регуляторные сети miRNA подвергаются обширной перестройке во время эволюции животных.
У растений известен ряд miRNA регуляторных взаимоотношений, законсервированных у A. thaliana и мхов46,47, которые разошлись более 400 миллионов лет тому назад. Эти взаимоотношения подтверждены строгими экспериментальными доказательствами, с верификацией с помощью 5'-RACE (rapid amplification of cloned ends) продуктов расщепления мРНК мишени (Box 2). Т.к. многие из этих регуляторных взаимоотношений участвуют в критических биологических процессах (напр., передача сигналов auxin), то это указывает на то, что, по крайней мере, некоторые miRNAs занимают центральные позициив развитии регуляторных сетей в течение длительного времени у растений.
Т.к. сайты, связывающие транскрипционные факторы, трудно предсказать с помощью вычислений, то ещё тяжелее расшифровать глобальную динамику оброта сайтов связывания транскрипционных факторов на больших эволюционных расстояниях, используя вычислительным методы. Однако, недавно появились широко-масштабные экспериментально подтвержденные данные по сайтам связывания транскрипционных факторов (reviewed in Ref. 63), в частности в результате ChIP-chip анализа, которые могут сделать эту проблему решаемой в ближайшее будущее. Кстати, интересное исследование, которое сравнивает мишени РНК-связывающего белка Pumilio in D. melanogaster и дрожжей64 показало, что хотя сродство связывания регулятора сохраняется действительно тем же самым у этих двух видов, их мишени дивергировали практически полностью. Следовательно, высокая консервация trans-действующих факторов и низкая в целом консервация cis-регуляторных сайтов может быть общей для многих регуляторных механизмов.

High turnover of binding sites even over short evolutionary distances.


Ряд групп исследовали оборот экспериментально верифицированных сайтов связывания транскрипционных факторов между людьми и мышами65, and between various Drosophila species66,67,68,69. Общий вывод заключается в том, что консервация последовательностей для известных сайтов связывания неожиданно низка (напр., ~50% для D. melanogaster and Drosophila pseudoobscura67), хотя эта картина осложнена тем фактом, что отбор скорее всего работает на уровне всего cis-регуляторного модуля скорее, чем на уровне индивидуальных сайтов связывания (Box 1). В частности, cis-регуляторые модули часто содержат перекрывающиеся сайты связывания и как было продемонстрироано Ludwig et al.70,71, могут существовать компенсаторные мутации, которые поддерживают функцию энхансера, несмотря на потерю индивидуальных сайтов связывания.
Сходные исследования не были проведены для miRNAs из-за малого количества экспериментально проверенных сайтов связывания miRNA. Однако, некоторые недавние исследования микромассивов показали, что величина консервации сайтов связывания также около 50% (между людьми и мышами или между рыбками данио, Tetraodon и Fugu)18,72,73. Более того, подсчеты по предсказанию мишеней для miRNA показали существование многих линейно-специфическихсайтов связывания miRNA у Drosophila и позвоночных (N.R., unpublished observations). Наконец, мы использовали данные по SNP человека и и популяционно-генетическую технику, чтобы показать, что 30–50% не законсервированных сайтов связывания miRNA в геноме человека мб. функциональными, если мРНК и миРНК экспрессируются в одной и той же ткани74. Необходимо отметить, что термины, такие как 'non-conserved binding sites' обычно обозначают случаи, при которых сайт связывания не может соответствовать её гомологичным последовательностям. Т.к. эти соотвествия часто страдают от технических проблем ( напр., почти все алгоритмы соответствия не способны иметь дело с геномными перестройками на разных уровнях) , 'non-conserved' сайты могут в действительности оказаться законсервированными в строго эволюционном смысле. Тем не менее эти исследования в целом показали, что сайты связывания и miRNA и транскрипционных факторов быстро возникают и теряются на коротких эволюционных дистанциях.
Итак, эти наблюдения на уровне видов показали. что промоторные области людей обладают неожиданно высоким уровнем изменчивости, который существенно влияет на уровни экспрессии, преимущественно путем вмешательства в контроль транскрипции (reviewed in Ref. 75). Примеры функционального полиморфизма также были идентифицированы недавно для сайтов связывания miRNA у людей76 and sheep77 и наборы SNPs в предполагаемых сайтах связывания miRNA в геномах людей и мышей были собраны несколькими группами 74,77. Напротив, повторное секвенирование генов miRNA у людей показало практичекое отсутствие полиморфизма в последовательностях генов зрелых miRNA78, это согласуется с высокими уровнями ограничений trans-действующих регуляторов по сравнению с cis-регуляторными сайтами.

Rates of evolution


Было предположено, что репрессоры д. эволюционировать быстрее, чем активаторы, т.к. имеется множество путей репрессии генов, но относительно мало путей их активации79. Т.к. транскрипционные факторы могут действовать как активаторы или репрессоры, но все известные miRNAs дейстсвуют как репрессоры, поэтому можно ожидать, что сайты связывания miRNA эволюционируют быстрее сайтов связывания транскрипционных факторов.
Однако, более фундламентальным различием между транскрипционными факторами и miRNAs является то, что сайты связывания транскрипционных факторов обычно 'fuzzy' (т.е. один и тот же транскрипционный фактор может соединяться со многими сходными последовательностями ДНК, возможно с разным сродством связывания), тогда как большинство сайтов связывания miRNA обладает почти точной Watson–Crick комплементарностью, или к первым 6–8 основаниям с 5' конца зрелой miRNA у животных, или целых miRNA у растений (Box 3). Следовательно, в условиях нейтральной эволюции можно ожидать, что труднее разрушить функциональные сайты связывания транскрипционных факторов, чем создать новые, в то время как противоположное следует ожидать для сайтов связывания miRNA.
Сайты связывания miRNA у растений и живтоных могут эволюционировать с разными скоростями. Сайты связывания miRNA растений обычно обнаруживаются в кодирующих областях и если мы предположим, что non-synonymous сайты являются высоко прнужденными, а synonymous сайты эволюционируют нейтрально, то приблизительно треть от 22 оснований в сайте связывания miRNA у растений может приспосабливать замены без существенных вредных последствий для организма. Следовательно, размеры мутационных мишеней для сайтов связывания miRNA у растений и животных сравнимы, учитывая, что вероятность потери сайтов связывания miRNA у растений и животных сходна в простой нейтральной эволюционной модели. С др. стороны, длина сайтов связывания miRNA растений означает, что теоретически было бы невозможно для генов растений заполучать новые сайты связывания miRNA за счет точковых мутаций, тогда как то же самое неверно для живтоных.

Quantitative models of transcription-factor and miRNA binding-site evolution.


Одним из приемлемых путей создания качественных аргументов для предыдущего раздела было бы более количественное использование разрабатываемых моделей эволюции сайтов связывания на базе точковых замен. Отметим, что такой подход не приспособлен к приобретению новых сайтов связывания с помощью широко-масштабных перестроек, таких как транспозиции (напр., Ref. 80), или малого масштаба перестроек, таких как тандемные двупликации81.
Stone and Wray82 подсчитали ожидаемое время для появления новых сайтов ствязывания для транскрипционных факторов за счет нейтральных точковых замен и пришили к выводу, что это время невелико (напр., 55,000 лет для двух 6-bp сайтов, чтобы эволюционировать внутри области в 200-bp у D. melanogaster82), исходя из того, что все члены популяции эволюционируют независимо. Проблема была рассмотрена еще раз, исходя из более реалистичных предположений, что члены популяции связаны по происхождению83,84,85. Хотя методы и модели отличаются, три исследования пришли к сходным заключениям. Во-первых, нейтральные мутации слишком медленны, чтобы эффективно давать новые сайты связывания за счет точковых замен. Во-вторых, позитивный отбор на частичные сайты связывания может эффективно ускорять скорость эволюции, делая вполне осуществимым появление новых сайтов связывания. В третьих, время, необходимое для создания новых сайтов, увеличивается линейно с длиной регуляторной области (напр., области промоторов и энхансеров для сайтов связывания транскрипционных факторов или 3' UTR для сайтов связывания miRNA ) , но экспоненциально с длиной сайта связывания. В-четвертых, состав оснований бласти важен, особенно присутствие 'pre-sites', которые являются одиночными точковыми мутациями вне функционального сайта связыванияe.
В качества специфического примера, рассмотрим области в 1-kb некодирующей ДНК с одинаковым составом оснований в геноме человека. Предположим, что сайты свфзывания для miRNA и для транскрипционных факторов каждый длиной в 8 bp, но miRNA нуждается точном совпадении 8, тогда как транскрипционный фактор нуждщается только в 7 соответствиях из 8. Durrett and Schmidt подсчитали, что данные нейтральные точковые замещения нуждаются в 650 миллионах лет для сайта связывания miRNA и происходят в отсутствие pre-site и 375,000 лет в присутсвии pre-site. Напротив сайт, находимый транскрипционным фактором происходит в течение 60,000 лет85.

The rate of acquisition of miRNA genes versus transcription factors.


Так как многие геномные последовательности оказываются завершенными, это указывает на то, что немногие новые семейства транскрипционных факторов возникают, с момента дивергенции животных и растений3,79 (хотя количество транскрипционных факторов в каждом семействе могут быть отличиными в индвидуальных геномах). Ситуация, по-видимому, другая для miRNAs. Как результат комбинации биоинформатики и успехов в секвенировании сегодня стало очевидным, что процесс создания miRNA является активным и постоянным (напр., Refs 37, 38, 86, 87) (Box 2). Так, очевидно, что только геном человека может содержать более 1,000 miRNAs86, из которых многие, как полагают, являются специфичными для приматов или длаже специфичными для человека 87. Необходимо отметить, что эта глобальная картина приобретения генов транскрипционных факторов в противовес генам для miRNA, игнорирует важные вопросы, такие как комбинаторный транскрипционный контроль, кофакторы и мутации вне ДНК-связывающего домена, которые влияют на специфичность связывания транскрипционных факторов, а также затрудняют вычислительную идентификацию гомологичных miRNAs в разных геномах. Несмотря на это, даже принимая во внимания эти точки, различия в скорости создания семейств транскрипционных факторов и семейств miRNA остаются удивительными и, по-видимому, разумно предположить, что скорость создания новых семейств miRNA выше в эволюции животных, чем создание новых семейств транскрипционных факторов.
Необходимо ли животным столь много miRNAs, и если этот так, то почему? Кроме тоого, учитывая, что miRNA животных могут служить мишенями без труда сотням генов (Box 3) (reviewed in Ref. 88), то как могут приобретаться новые miRNAs с такой очевидной непринужденностью без серьёзного нарушения существующей регуляторной сети организма? Жаже у растений, у которых специфиченость связывания miRNA–mRNA более высокая, чем у животных, достоверные off-target эффекты могут возникать и следовательно, возникает сходный вопрос89. Чтобы ответить на эти вопросы, рассмотр им следующую модель того, как эволюционируют новые транскрипционные факторы и miRNAs .

Creating new trans-factors


Транскрипционные факторы обычно содержат множественные функциональные домены, которые обеспечивают связывание с ДНК, взаимодействия с др. белками и субклеточную локализацию транскрипционных факторов. Транскрипционный фактор с новой связывающей специфичностью может быть создан за счет дупликации существующего транскрипционного фактора, сопровождаемой мутациями, часто, нотя и не всегда, в ДНК-связывающем домене. Транскрипционные факторы могут также возникать за счет приобретения или потери одного из функциональных доменов. Напр., потеря домена транскрипционной активации д. превращать активатор в репрессор, в то время как приобретение новых доменов межбелковых взаимодействий, которые облегчают гетеродимеризацию с новым партнером по связыванию могут существенно изменить мишени транскрипционного фактора. Часто предполагается, что мутации в кодирующих последовательностях транскрипционного фактора сами по себеthat скорее всего очень вредны, т.к. они потенциально нарушают экспрессию многих нижестоящих генов. Однако, недавние примеры показывают, что транскрипционные факторы важные для развития Drosophila , обнаруживают существенную дивергенцию последовательностей и функции, указывая тем самым, что это предположение заслуживает пересмотра (reviewed in Ref. 34).
Модель мутаций удвоений объясняет также эволюцию, по крайней мере, некоторых генов miRNA. Напр., человеческой miR-10a и miR-100 являющихся гомологами, но отличающихся по единственной инсерции-делеции в предсказуемой области распознавания мишени соотв. зрелых miRNAs. Если это было предпочтительным способом создания семейств miRNA, то можно ожидать, что мотивы распознавания мишеней у miRNA д. быть неслучайно распределены в пространстве последовательностей, а д. обнаруживать склонность к образованию кластеров в группах сходных последовательностей. Хотя эта проблема ещё не была послностью изучена, но предварительный б иоинформационный анализ показал, что распределение этих последовательностей, по-видимому, близко к случайному (K.C. and N.R., unpublished observations). Если это верно, то это д. указывать на то, что процесс мутационных дупликаций объясняет относительно небольшую фракцию miRNAs и что вместо этого большинство новых семейств miRNA возникает de novo.
Одна из моделей de novo возникновения miRNA является модель инвертированных дупликаций, согласно которой новые miRNAs появляются в результате инвертированных дупликаций участков кодирующей последовательности, сопровождаемой последующей erosion последовательности в несовершенную структуру шпильки90. В некоторых случаях часть кодирующих последовательностей сама по себе может быть удвоена до создания miRNA, тогда miRNA обнаруживает гомологию к двум регионам гена мишени128. Эта модель привлекательна для растительных miRNAs т.к. она объясняет длинные участки сходных последовательностей, которые необходимы между miRNA и её мишенью.
Модель инвертированных дупликаций, по-видимому, менее подходящая для miRNAs животных, т.к. длина комплементарных последовательностей в сайтах связывания у miRNA значительно меньше у животных, чем у растений и не известны примеры вновь сформированных miRNAs, возникших таким способом у животных. Вторая модель, модель случайного создания, предполагает, что новые miRNAs просто возникают случайно из существующих шпилечных структур в геноме54,91. Шпилечные структуры обычно многочислены в геномах эукариот, напр., Bentwich et al.92 идентифицировал 11 миллионов шпилек в геноме человека с помощью биоинформационного скрининга. Следовательно, проблема создания новых miRNA у животных может быть меньше всего связана с созданием новых шпилечных структур, а скорее с соответственно транскрибированием существующих шпилечных структур в геноме и предоставлением необходимых сигналов для биогенеза новых miRNA (напр., сигналов для процессинга с помощью RNase III Drosha) (Box 1).

A model of transcriptional control of new miRNAs.


Т.к. минимальный сайт связывания miRNA животных короток, то новая miRNA д. быть способна находить многие мРНК просто случайно и многие из этих взаимодействий скорее всего избирательно вредны, как в случае всех типов мутаций. В самом деле, было предположено существование многих генов для которых присутствие сайта связывания miRNA является вредным ('anti-targets') 93 и это было продемонстрировано несколькими группами на разных видах с использованием данных вычислительных исследований72,73,89,94,95.
Эти наблюдения ставят вопрос, как новые miRNA д. приобретаться без серьёзного нарушения приспособленности организма. Мы полагаем, что это происходит одним путем, когда miRNA первоначально транскрибируется очень слабо и в специфической ткани или на специфической стадии развития. Современные исследования показали, что множественные сайты для одной и той же miRNA для одной и той же мРНК мишени (Ref. 88 and references therein). Если это верно, то естественный отбор может элиминировать слегка вредоносные сайты miRNA со временем — считается, что легче для мРНК потерять сайт miRNA, чем приобрести таковой — также как и поддержание или создание благоприятных сайтов связывания для новых miRNA. Как только такой процесс элиминации завершается, то уровень экспрессии miRNA может быть увеличен и его ткане-специфичность стать не такой строгой (Fig. 2).
Хотя эта модель безусловно является упрощенной картиной сложного процесса, она позволяет тестировать предсказание, что более недавно эволюционированышие miRNAs д. экспрессироваться слабее в специфических простраственно-временных доменах. В самом деле, это предсказание в целом подкрепляется данными по экспрессии miRNA (напр., Refs 87, 96), которые указывают на то, что недавно приобретенные miRNAs человека экспрессируются слабее, чем старейшие законсервированные miRNAs. Недавнее исследование Berezikov et al.87, в котором определяли экспрессию miRNA в головном мозге шимпанзе и человека, используя deep sequencing (Box 2), также получно подтверждение этому предположению.
Модель помещает громадные количества транскриптов предполагаемых малых РНК, которые были выявлены с помощью глубокого секвенирования , в качестве перспективных: она предполагает, что ряд из них являются случано транскрибируемыми шпильками, которые могут не играть существенной биологической роли в качестве trans-действующих регуляторов, хотя это не устраняет возможности, что они могут приобретать такую функцию в будущем. Модель согла суется с гипотезой, предложенной Sempere et al.38 и Prochnik et al.39 , что приобретение новых miRNAs участвует в приобретении новых типов тканей и органов в развитии животных. Это согласуется с интргующей идеей, предложенной Davidson7, что относительно легко развиваются новые гены miRNA, которые нацелены на специфические мотивы последовательностей, но то же самое неверно для транскрипционных факторов, т.к. специфичность последовательностей белка является сложной функцией его аминокислот. Итак, если транскрипиционный фактор приобретает новый домен экспрессии (напр., в новой ткани), то следует ожидать, что он будет регулировать гены, которые уже регулирует в оригинальном домене экспрессии, и будет возможно приводить к вредным эффектам. Однако, исходя из того, что miRNA с произвольной последовательностью мишенью может легко возникать, то такие осложнения будут отсутствовать и, следовательно, более легко может внедряться miRNA в онтогенетическую сеть, чем транскрипционный фактор.
Экспрессия и консервация miRNAs недостаочно изучены у растений по сравнению с животными. Корреляция между возрастом miRNA и уровнем её экспрессии, как ожидается, д. быть слабее у растений по сравнению с животными по двум причинам. Во-первых, вновь возникающие растительные miRNA, как ожидаетс. д. иметь относительно меньше мишеней по сравнению с животными miRNA, и если возникают или высоко благоприятные или высоко вредные, то отбор может усиливать или снижать уровень экспрессии miRNA значительно быстрее. Во-вторых, одиночная молекула растительной miRNA может находить и расщеплять множество мРНК, в то время как очевидно, что животные miRNAs д. быть связаны со своими мишенями, чтобы обеспечить репрессию, процесс, который является обратимым при специфических условиях 97,98. Несмотря на это вполне возможно, что некоторые растительные miRNAs, которые слабо экспрессируются или тканеспецифичны обладают незначительной функцией или она отсутствует вовсе в качестве trans-acting regulators128.

Conclusion


With our rapidly advancing knowledge of the different mechanisms of gene regulation in higher eukaryotes, we can begin to consider the evolutionary implications of these different mechanisms within a unified framework. In the past, much work focused on a synthesis between transcriptional regulation and cell signalling mechanisms3,99; here we have concentrated on the evolution of transcription factors and miRNAs. Ultimately, all other mechanisms of gene regulation should be brought into the discussion in order to form a holistic picture of the evolution of gene regulation.
Many open questions and directions for future research remain. This Review gives a local view of the evolution of individual regulators and binding sites as a necessary first step to understanding the evolution of gene regulation as a whole. In the future, it will be necessary to move towards the broader view of the evolution of developmental regulatory networks, and from there, towards the even bigger picture of changes in organismal form. The model of Davidson and colleagues that is discussed above is one promising way of thinking about the evolution of network structure and body plans on a global scale. Our current knowledge of how transcription factors, miRNAs, signalling pathways and other regulators are wired together into developmental networks is much too rudimentary to make any sensible statements about the effect of different regulatory mechanisms on global network evolution. However, as our knowledge of the developmental roles of these regulatory mechanisms increases, it should be possible to extend the model to account for these different components. For example, if it indeed turns out that miRNAs tend to work at the periphery of developmental networks to confer additional layers of robustness, and not as the primary agents of developmental patterning, then this might lead us to postulate a certain amount of evolutionary pliability for miRNA-mediated regulation. It will also be interesting to investigate whether different eukaryotic lineages, particularly plants and animals, use different regulatory mechanisms in similar ways or not.
Such global trends in network evolution have a natural counterpart in local subnetwork motifs that exist within the overall network. One particularly interesting example of such a motif is a feedback loop that involves multiple transcription factors and miRNAs. Examples of this motif have been identified in recent work on neuron cell-fate determination100 and vulval development101 in C. elegans, and granulocytic differentiation in humans102. Whether multicomponent feedback loops and other complex subnetwork motifs are common features of developmental networks, and whether they have any significance for organismal traits and evolution, are intriguing questions for future research. Within the Davidson model, signalling cassettes function as plug-in components that are re-used repeatedly in regulatory networks. Likewise, certain subnetwork motifs could also potentially form reusable plug-in components.
Since the work of Mary-Claire King and Allan Wilson three decades ago103, scientists have asked whether changes in gene regulation or protein sequence have made bigger contributions to phenotypic differences between species. Today, we are well positioned to broaden the question to ask about the relative contributions of the evolution of different mechanisms of gene regulation to the evolution of phenotypic diversity in animals and plants. The long journey towards a comprehensive understanding of the evolution of gene regulation is only beginning.
Сайт создан в системе uCoz