Посещений:
МикроРНК miR-15 и miR-16 контролируют передачу сигналов Nodal

Детерминация Клонов в Раннем Эмбриогенезе

MicroRNA control of Nodal signalling
G.Martello, L.Zacchigna, M.Inui, M.Montagner, M.Adorno, A.Mamidi, L.Moesut, S.Soligo, U.Tran, S.Dupont, M.Cordenonsi, O.Wessely, S.Piccolo
Nature V.449, No.7159,P.183-188; nature06100




Рис.1.  |  miR-15 and miR-16 control Nodal/activin responsiveness by acting as inhibitors of Acvr2a expression.


Рис.2.  |  miR-15 antagonizes Spemann's organizer development


Рис.3.  |  miR-15 and miR-16 are required to set the size of the organizer by limiting Nodal responsiveness.


Рис.4.  |  miR-15 and miR-16 and Acvr2a show complementary domains of expression.


Рис.5.  |  miR-15 and miR-16 are negatively regulated by Wnt/-catenin signalling.

MicroRNAs (miRNAs) представляют собой новый класс некодирующих регуляторных молекул, разнообразные функции которых начинают выясняться.1,2 Хотя компьютерные данные предполагают, что miRNAs могут регулировать существенную фракцию генома3,4, мало известно о их роли в качестве трансдукоторов или нижестоящих эффекторов передачи сигналов факторов роста.
Цитокины из семейства TGF-β являются важными сигналами, регулирующими поведение клеток в различных клеточных контекстах5. TGF-β лиганды способствуют олигомеризации родственных серин/треонин типа I и II рецепторов, приводящей внутриклеточно к активации трансдукторов Smad5. Dj время эмбрионального развития этот сигнальный каскад активируется с помощью Nodal, стобы обеспечить индукцию и формирование паттерна мезодермального зародышевого слоя6. Активность Nodal, однако, не обнаруживается даже вдоль дорсовентральной оси развивающегося эмбриона: Шпемаановский организатор индуцируется на дорсальной стороне за счет асимметричной волны передачи сигналов Nodal? которая может быть визуализована по пику в уровне фосфорилированной (р)-Smad2 на ст. поздней бластулы6-8.
Установление эмбриональной дорсовентральной полярности может быть в конечном итоге отслежено в обратном направлении до оплодотворения: проникновение спермия нарушает симметричность яйца, вызывая накопление передачи сигналов Wnt/β-catenin на будущей дорсальной стороне9,10. Сигнал, инициируемый с помощью β-catenin затем транслируется с помощью неизвестного механизма в градиент Nodal, так что эмбрионы с материнской Wnt/β-catenin недостаточностью не обнаруживают дорсального накопления p-Smad27 и не формируют ткани организатора11,12. Некоторые родственные Nodal лиганды экспрессируются в виде дорсально-вентрального градиента во время гаструляции13; однако, наиболее мощным механизмом для поддержания и позитивного контроля экспрессии Nodal является сама прередача сигналов Nodal посредством Smad2/FAST-1-зависимой петли ауторегуляции, которая поддерживает транскрипцию Nodal13-16. Др. словами, высокий уровень экспрессии Nodal на дорсальной стороне может рассматриваться как результат амплификации ранней регуляции передачи сигналов Nodal6, но нет информации о механизме, который инициирует асимметрию. Исследовали влияние miRNAs, влияющих на передачу сигналов Nodal и было установлено, что miR-15 и miR-16 являются молекулами, которые транслируют раннюю асимметрию Wnt/β-catenin в генерацию градиента чувствительности Nodal путем расщепления Nodal рецептора Acvr2a вдоль дорсовентральной оси.

mir15 and mir16 limit Nodal and activin responses


Чтобы протестировать, действительно ли miRNAs контролируют передачу сигналов Nodal/TGF-β во время развития мезодремы, осуществляли мониторинг того, как увеличивающийся уровень эндогенного пула miRNAs, экспрессируемой в ранних эмбрионах Xenopus влияет на активность Nodal. Для этого мы очищали всю miRNA из эмбрионов на ст. гаструлы и микроинъецировали 3 ng этого препарата вместе с мРНК Nodal (Xnr-1, наз. также nr1-A) в жмбрионы Xenopus двухклеточной стадии. Реакция гена Nodal отслежиали с помощью ко-инъецированного mix.2-lux репортера, чувствительного и хорошо установленого считывателя Nodal/TGF-β-зависимой активации Smad17,18. Как показано на Рис. 1а эмбрионы с повышенными уровнями miRNA обнаруживают заметное ингибирование активности Nodal. Этот эффект, по-видимому, специфичен, т.к. контрольна смесь не вызывала индукции Mix.2-lux.
МикроРНК негативно регулируют экспрессию генов за счет annealing (отжига, денатурации) 3' untranslated region (UTR) мРНК мишени посредством её 'seed' последовательности (5' нуклеотидов 2-8)1. Затем использовали Pictar19 и miRanda20 компью.терные программы для поиска miRNA-связывающих сайтов в 3' UTR стержневых компонентов пути передачи сигналов Nodal (лиганды. рецепторы, ко-рецепторы, Smads и ядерные кофакторы5). Благодаря этому анализу семейство miR-15 и 3' UTR в Acvr2a (ActRIIa), типа II рецептора для Nodal и activin лиганды21 (supp; Fig.1) привлекли наше внимание: (1)сайт связывания эволюционно законсервирован от от амфибий до человека, (2) зрелая miR-16 является многочисленной miRNA, экспрессируемой у ранних эмбрионов Xenopus22 и (3) имеются два предсказанных сайта связыванимя для mir-15 и miR-16 в Acvr2a мРНК, указывающие на кооперативное связывание и т.о. на биологически эффективное взаимодействие1.
Проведено несколько экспериментов, чтобы оценить гипотезу, что miR-15 семейство нацелено на Acvr2a. Во-первых, сконструированы две репортерные конструкции, содержащие или дикого типа или мутантный сайт связывания miR-15 в Acvr2a 3' UTR (Acvr2a-WT и Acvr2a-mut) (Suppl. Fig. 2a). Затем сравнивали активность двух этих репортеров у эмбрионов Xenopus v в клетках человека HepG2 и установили, что Acvr2a-WT обладает существенно пониженной экспрессией по сравнению с Acvr2-mut, как и ожидалось в случае если эндогенные mir-15 и miR-16 спариваются с соотв. сайтом мишенью (Рис. 1b Suppl. Fig 2b). Избыточная экспрессия зрелой miR-15 или её непосредственный предшественник (pri-miR-15/16) еще больше ингибировали активность Acvr2a-WT, но не оказывали эффекта на мутантный репортер. Напротив мутантная mir-15 (содержащая 3 мутации в seed последовательности) или неродственная pri-miRNA не оказывали эффекта. Отметим. что miR-15 подавляет экспрессию эндогенного белка Acvr2a, не оказывая влияния на уровни Acvr2a мРНК...

miR-15 and miR-16 set the size of organizer




miR-15 and miR-16 are ventrally enriched




Wnt signal inhibits miR-15 and miR-16 expression


Discussion


Показано, что передача сигналов Nodal/activin контролируется семейством miR-15, это первая идентификация эндогенных miRNAs, нацеленных на TGF-β сигнальный каскад. В противоположность известным регуляторам передачи сигналов Nodal miR-15 и miR-16 концентрируются на вентральной стороне эмбриона Xenopus, тем самым генерируется дорсальное предпочтение экспрессии Acvr2a. Такая регуляция необходима для собственно образования Шпемановского организатора. Избыточность функции miR-15 ограничивает размер организатора, эффект, который согласуется с фенотипом эмбрионов Xenopus с пониженной функцией Nodal6 и с мышами, несущими генетически инактивирующие Acvr2a21 или гипоморфные Nodal мутации6ю Напротив, ингибирование miR-15 и miR-16 ведет к латеральной экспансии и усилению маркеров организатора, эффект мимикрирующий избыточную экспрессию Acvr2a; сходный фенотип ранее был описан у эмбрионов позвоночных, лишенных Nodal антагонистов Lefty1 и Lefty2 или со стабилизированными Nodal рецепторами15,27-29.
Интересно, что взаимодействие между miR-15 и Acvr2a законсервировано от амфибий до человека; однако, это взаимодействие не законсервировано у teleost. Это может объяснить отсутствие очевидных дефектов в спецификации раннего плана тела у эмбрионов рыбок данио рерио, лишенных Dicer30 в противоположность очень ранней потребности в Dicer у млекопитающих31,32.
Было предположено, что одной из ролей miRNAs является предупреждение нелегитимной трансляции мРНК в доменах, где эти гены уже транскрипционно репрессированы, тем самым поддерживаются качественные особенности ткани1. Однако, этот принцип может быть неприложим к эмбриональной ткани, которая содержит популяцию плюрипотентных клеток и где многие решения клеточных судеб всё ещёпластичны и обратимы. Полученные результаты открывают новый механизм, с помощью которого miRNA могут специфицировать клеточные клоны, т.е. с помощью расщепления рецепторов факторов роста. Кроме того, предоставлены биологические и биохимические доказательства, что экспрессия членов семейства miR-15 находится под негативным контролем передачи сигналов Wnt/β-catenin. Это может помочь решить вопрос, как у эмбрионов инициальная асимметрия по β-catenin, которая гарантируется после оплодотворения, транслируется в градированную активность Nodal6,9, важную для формирования собственно Шпемановского организатора. Можно предположить, что это является примером более генерального принципа и что др. miRNAs могут служить, чтобы нарушать эквивалентность др. гомогенных популцzий клеток в многочисленных точках во время развития.
Сайт создан в системе uCoz