Эмбриогенез Кур

MicroRNA Expression During Chick Embryo Development D.K.Darnell, S.Kaur, S.Stanislaw, J.K.Konnieczka, T.A.Yatskievych, P.B.Antin Dev.Dyn. - 2006. - V.235. No 11. P. 3158-3165
	miRNAs многочисленный класс не кодирующих РНК, которые регулируют уровни белков путем соединения с 3'UTRs мРНК мишеней, ингибируя трансляцию или индуцируя деградацию мРНК (He, Hannon, 2004; Pillai, 2005; Valencia-Sanches et al., 2006). miRNAs выявлены у организмов из всех доменов, а недавние сообщения показывают, что геномы позвоночных содержат, по крайней мере, сотни генов miRNAs, которые регулируют стабильность или трансляцию 20-30% всех мРНК (Иутецшср уе al., 2005; Berezikov, Plasterk, 2005; Legendre et al., 2005; Xie et al., 2005). miRNAs транскрибируются в виде 70-100 нт транскриптов pri-miRNAs, которые подвергаются процессингу в ядре, чтобы стать в 70 нт шпилечной структурой pre-miRNAs. Последняя транспортируется в цитоплазму и превращается в miRNA: miRNA дуплекс. Одна иногда обе нити miRNA дуплекса индивидуально собираются в RNA-induced silencing complex (RISC), состоящий из нескольких белков и зрелой однонитчатой в 21-22 нт miRNA. Хотя их малые размеры делают детекцию зрелых miRNAs довольно проблематичной. Northern блот (Срутб Okayama, 1987; Valoczi et al., 2004; Watanabe et al., 2005), микромассивы (Barad et al., 2004; Thomson et al., 2004) и гибридизация in situ всего количества (Aboobaker et al., 2005; Weinholds et al., 2005; Kloosterman et al., 2006) используются для мониторинга экспрессии miRNAs. В то время как гибридизация in situ всего генома с использованием антисмысловых РНК зондов не является достаточно чувствительной для действительного выявления коротких последовательностей РНК, Locked Nucleic Acid (LNAs), новый тип РНК аналогов, может гибридизироваться с последовательностями РНК мишеней с чрезвычайно высокой специфичностью и стабильностью (Wahlestedt et al., 2000; Elmen et al., 2005) и оказывается эффективным для гибридизации in situ в целом для детекции экспрессии miRNAs (Weinholds et al., 2005; Kloosterman et al., 2005b). Однако, даже используя LNAs, способность выявлять miRNAs in vivo очень изменчива. С помощью гибридизации in situ обзор экспрессии miRNAs у рыбок данио выявил большинство miRNAs и продемонстрировал динамику пространственных и временных паттернов экспрессии (Weinholds et al., 2005). Напротив скрининг с помощью гибридизации in situ у мышей выявил только небольшое количество наиболее высоко экспрессируемых miRNAs (Kloosterman et al., 2006a). Эмбрионы кур представляют собой удобную альтернативу мышам в отношении miRNAs. Онтогенетические процессы у кур довольно точно воспроизводят процессы у видов млекопитающих, включая мышей и человека. Протокол гибридизации in situ в целом оптимизирован для эмбрионов кур (Nieto et al., 1996; Bell et al., 2004). Мы осуществили гибридизацию in situ в целом для анализа экспрессии 111 зрелых последовательностей miRNA, которые кодируются 135 самостоятельными генами miRNAs (Griffith-Jones, 2004; Griffith-Jones et al., 2006). Результаты показали, что большинство известных miRNAs экспрессируется во время первыз 4-х дней эмбриогенеза в виде широкого разнообразия временных и пространственных паттернов, следовательно, miRNAs участвуют в важных онтогенетических процессах. 84 miRNAs были обнаружены во время изученных стадий развития (НН 3-26). 9 экспрессировались повсеместно, а 75 обнаруживали воспроизводимую дифференциальную экспрессию в одном или нескольких слоях клеток или областях эмбриона. Early Development, Ectoderm and Entoderm Немногие miRNAs были обнаружены на ранних эмбриональных стадиях (Табл. 1). На последующих более поздних стадиях количество выявляемых miRNAs быстро увеличивалось в тканях, производных всех трех первичных зародышевых листков. Эта тенденция согласуется с исследованиями у низших позвоночных и показывает, что miRNAs играют существенную роль в регуляции органогенеза, дифференцировке и пост-дифференцировочных событиях скорее, чем на ранних процессах формирования эмбрионального паттерна. На стадии первичной полоски let-7b, miR-130b и -367 экспрессируются в эпибласте, а miR-130b обнаруживается также в involuting (дегенерирующих) клетках полоски (Рис. 1А-С). У рыбок данио ранняя зиготическая экспрессия miR-430 затрагивает материнскую РНК (Giraldez et al., 2005)для удаления её из эмбриона. Хотя ортологи miR-430 не были идентифицированы у амниотических видов, похоже, что let-7b, miR130b и -367b могут выполнять сходную функцию. Транскрипты miR-30e были выявлены в большей части не-нейральной эктодермы на ст. 10 и на более поздних стадиях также были обнаружены в нефрических протоках. miR-200a и -200b локализованы 2.2 т.п.н. от межгенной области на хромосоме 21 и обнаруживают сходные паттерны экспрессии в эктодерме и энтодерме на ст. 12 и на более поздних стадиях в эктодерме, носу, кишечнике и мезонефрических протоках. miR-205a, которая находится в межгенной области, экспрессируется в каудальной не-нейрональной эктодерме и прогрессивно на более поздних стадиях в вентро-латералной не-нейрональной эктодерме. На ст. зачатков конечностей miR-205a становится преобладающей в эктодерме конечностей, включая апикальный эктодермальный гребень (АЭГ). miR-205b локализуется в интроне гена предшественника коллагеновой α цепи и обнаруживает сходны паттерн экспрессии с miR-205a. miR-21 ранее не была описана у кур, она экспрессируется в амнионе. miR-375? которая участвует в регуляции экзоцитоза инсулина (Poy et al. 2004), обнаружена в энтодермальном панкреатическом рудименте, а позднее в поджелудочной железе. miR-375 экспрессируется также в гипофи зарном рудименте. 10 дополнительных miRNAs были обнаружены преимущественно экспрессирующимися в поверхностной эктодерме (Табл. 1). Central Nervous System По крайней мере, 30 miRNAs выявлено в развивающейся нервной системе, хотя ни одна из miRNA не экспрессировалась во всех нервных тканях. miRNAs, экспрессирующиеся в ЦНС обнаруживают дифференциальную экспрессию вдоль дорсо-вентрально, медиа-латеральной и передене-задней осей, в местах, которые предположительно участвуют в формировании региональных паттернов и внутри специфических групп нейрональных и не-нейрональных клеток. Ген miRNA let-7 кодирует, по крайней мере, 11 miRNAs, которые отличаются до 4-х нуклеотидов. let-7a-1, -7a-2, -7a3 и -7j имеют идентичные последовательности в зрелых miRNAs, а let-7a/j хонд выявляет экспрессию в дорсальной половине заднего мозга. let-7b и -7с экспрессируются в заднем мозге и спинном, тогда как транскрипты let-7f и -7k выявлены в заднем мозге, а let-7i и -7k обнаруживаются в переднем мозге. Зонд miR-9, распознающий идентичные miRNAs, транскрибируется с двух mir-9 генов, обнаруживающих самые сильные и наиболее отличающиеся паттерны экспрессии нейрально экспрессирующихся miRNAs, метят субнаборы клеток во всех сосудах головного мозга, а также в спинном мозге на стадии 19. Хотя mir-9* была описана у некоторых видов (Weinholds et al. 2005), мы не выявили экспрессии miR-9* miRNA у кур на изученных эмбриональных стадиях. Некоторые miRNAs обнаруживали ограниченную экспрессию как в нейральных, так и не-нейральных тканях. Современное исследование генома кур помещает miR-10b на смысловую нить в интроне 2 HoxD10 гена. Однако, геномный ансамбль имеет некоторую неясность в отношении Нох кластера. Транскрипты miR-10b выявлены вдоль всей длины спинного мозга и в мезенхиме передних конечностей. miR-17-5p выявлена в головной области и задних частях нервных складок на ст. 10 и на более поздних стадиях во многих тканях, но низка в сердце. miR-20a и -20b строго экспрессируются в пузырях среднего мозга, дорсальной части заднего мозга и спинном мозге, а также в лицевых структурах, но экспрессируется на низких уровнях по всему эмбриону с наинизшим уровнем экспрессии в сердце. miR-106 экспрессируется в спинном мозге, заднем мозге и гипофизарном рудименте, а также в некоторых мезодермальных структурах. miR-106 является полицистронной с -18b и -20b и возможно также с -363, и их экспрессия в на поверхности конечностей, ЦНС и глотке сходна. Зонды miR-124a и -124b lf.n идентичные паттерны мечения в заднем и среднем мозге, в латеральных областях спинного мозга и гипофизарном рудименте. miR-124a располагается в межгенной области на хромосоме 2, тогда как два гена miR-124b располагаются разделенные 2.3 т.п.н. на хромосоме 23. Последовательности зондов miR-124a и -124b отличаются по единственному внутреннему нуклеотиду и поэтому несоответствие по одиночному нуклеотиду не ограничивает гибридизации по mir-124 у рыбок данио (Kloosterman et al., 2006), каждый из зондов может распознавать оба транскрипта. Дополнительные данные по miRNAs, экспрессируемым в центральной и периферической нервной системе представлены на Рис. 2 и Табл. 1. Derivatives of the Mesoderm Некоторые miRNAs выявляются специфически в сердечной мышце и скелетно-мышечных клетках миотомов. miR-1 (транскрибируемая с двух генов, miR-1-1 и mir-1-2) отличается от miR-1b одним внутренним нуклеотидом и поэтому каждый из зондов может распознавать оба транскрипты (Kloosterman et al., 2006). Зонд miR-1 выявляет транскрипты в формирующейся сердечной трубке с началом дифференцировки кардиальных миоцитов на ст. 9-10 и экспрессия сохраняется в сердце, по крайней мере, в течение всей ст. 22. Зонд miR-1 выявляет также транскрипты в миотомах сомитов, начиная со стадии 14, что совпадает с началом дифференцировки мышечных клеток. Сходное, хотя и более слабое мечение наблюдается с зондом miR-1b. miR-1 является одной из наиболее изученных miRNAs (Zhao et al., 2005; Chen et al., 2006)? выявлены интересные вариации экспрессии в сердце у разных организмов. miR-1 выявляется в дорсальных сосудах у дрозофилы и не обнаруживается в сердце рыб и амфибий, но экспрессируется на высоком уровне в сердце эмбрионов кур, мышей и людей (Zhao et al., 2005; Kloosterman et al., 2006). Тщательное эволюционное сравнение проведено Ason et al. (2006). miR-1-1, -1-2, -1b и - 206 располагаются непосредственно 5' по отношению к miR-133a-2, -133a-1, -133a-3 и 133b, соответственно. Т.к. каждая пара выглядит как полицистрон (Chen et al., 2006), не удивительно, что зонд miR-133a (который отличается от miR-133b одиночным терминальным нуклеотидом) локализуется как в сердце, так и миотомных скелетных мышцах. Некоторые дополнительные miRNAs экспрессируются выше фона в предсердиях, включая miR-34a, хотя отлавливание и окрашивание фона осложняют интерпретацию настоящего сигнала в предсердиях. Хотя miR-206 и miR-1 эволюционно родственны, miR-206 экспрессируется в миотомных скелетно-мышечных клетках, но не в сердце. Zhao rt al. (2005) идентифицировали Mef2 cis элемент в 5' промоторной области мышиного гена miR-1-1, который необходим для специфической экспрессии в сердце . Идентичный Mef2 элемент (главная последовательность 5'-CTAAATATGG-3') присутствует в 5' фланкирующей области гена miR-1-1 кур. Анализ 5 т.п.н. 5' фланкирующей области у кур miR-206 выявил Mef2-подобный элемент, содержащий одиночную нуклеотидную замену (5'-CcAATATGG-3'), которая как было установлено устраняет связывание Mef2 (Andres et al., 1995). miRNAs, экспрессируемые в др. мезодермальных производных, включают miR-126 в кровяных островках и сосудистом эндотелии. miR-144 также ранее не была описана у кур, она выявляется временно в кровяных островках. let-7b и miR-140 и некоторые др. miRNAs (Табл. 1) выявляются в хорде. miR-30a и -30е локализуются в нефрических протоках на уровнях выше фона. Однако интерпретация метки в хорде и нефрических протоках осложнена. Nearly Ubiquitous Expression Новый класс паттернов экспрессии miRNAs обнаруживает от средних до высоких уровней экспрессию практически по всему эмбриону, но со значительно сниженным уровнем в одной или немногих тканей, включая сердце. Сюда входят miR-17-3p и -17-5р, -18а, -19а, 19b, -20a, 20b, -92, -106, -107 и 363ю miR-17, -18a, -19a, -20a, -19b и -92 являются частью miR-17-92 полицистрона, а miR-106, -20b, -18b и -363 располагаются внутри паралогичного кластера на хромосоме 4 (Hayashita et al., 2005; He et al., 2005). Northern анализ подтвердил, что miR-15-5p и -20b экспрессируются широко в эмбрионе, но их уровни снижены в сердце. На более поздних стадиях экспрессия miR-17-92 полицистронных miRNAs также снижена в частях эктодермы, особенно в АЭГ конечностей. Повышенная экспрессия miR-17-92 кластера miRNAs ассоциирует с пролиферацией и прогрессом опухолей (Hayashita et al., 2005). Однако, кардиальные миоциты реплицируются в течение всей плодной жизни (Soonpaa, Field, 1997), так что пролиферативная способность миоцитов не коррелирует четко с экспрессией miR-17-92. Pharyngeal Arches and Facial Structures 13 miRNAs выявлено черепно-лицевой области. miR-10b, -19, -20a, -106, 125b, -128a/b, -130b, -135b, -184, -205a, -217, -218 и -222b обнаруживают экспрессию в одной или нескольких бранхиальных дугах. В то время как большинство из этих miRNAs выявляется в мезенхиме множественных дуг, miR-125b, -128a/b, -130b, -135b, -217, -218 и -222b обнаруживают также локальную экспрессию в каудальной части дуги II, гиоидной дуге. miR-106 выявлена во всех 4-х дугах в мезенхиме непосредственно по соседсту с эктодермой и в развивающихся мышцах дуг, в то время как miR-140 экспрессируется в мезенхиме фронтального возвышения, медиальном и латеральном носовом выпячивании и в верхнее-челючтном возвышении. miR-130b выявляется как в эктодерме, так и мезодерме фарингеальных дуг, но только в мезенхиме фарингеальных щелей. miR-184 экспрессируется в эктодерме фарингеальных дуг. Сходным образом ряд miRNAs выявлен в фарингеальных дугах у рыбок данио (Weinholds et al., 2005). Однако, из комбинации в 21 ген miRNAs, которые экспрессируются в фарингеальных дугах разных видов, только miR-30c, -140 и -205а экспрессируются у всех. 8 из оставшихся генов обнаруживаются только у одного вида, а оставшиеся 11 miRNAs экспрессируются в разных местах эмбриона. Эти результаты подкрепляют общую концепцию, что паттерны экспрессии miRNAs могут обнаруживать существенную дивергенцию в ходе эволюции. Следует упомянуть, что скрининг у рыбок данио (Weinholds et al., 2005) захватывает больший период по сравнению со временем развития в данном исследовании на эмбрионах кур, так что возможно, что дополнительные miRNAs обычно экспрессируются в фарингеальных дугах на более поздних стадиях (Ason et al., 2006). Limbs 21 miRNAs дифференциально экспрессируются в развивающихся конечностях в виде паттернов, которые указывают на участие из в росте и формировании паттерна. let-7a, miR-10b, -18b и -363 выявляются в зачатках конечностей начиная примерно со ст. 14. let-7a, miR-18b и -363 обнаруживают экспрессию сначала в зачатках крыльев и несколько позднее в зачатках крыльев и ног. miR-10b обнаруживает достоверно более высокий уровень экспрессии в зачатках крыльев, по сравнению с зачатками ног на ст. 18, это сохраняется по крайней мере до ст. 24. Напротив, miR-199a локализуется в интроне Dynamin-1 гена и экспрессируется строго в зачатках крыльев и ног и в др. местах мезодермы. Дополнительные miRNAs обнаружены в мезенхиме зачатков конечностей, включая miR-15a, -18b, -125b, -128a, -130b и 217. Некоторые из этих генов обнаруживают локальную или усиленную экспрессию в области зачатков задних конечностей близких к зоне поляризующей активности (ЗПА). miR-17-5p выявляется в большой области эмбриона, но отсутствует в некоторых регионах эктодермы и в частности в АЭГ. Напротив miR-200a и -200b экспрессируются по всей эктодерме, включая зачатки конечностей и АЭГ. Lancman et al. (2005) сообщи ли недавно, что куриный lin-41 ортолог (clin-41)экспрессируется в зачатках конечностей. У C.elegans lin-41, по-видимому, регулируется с помощью let-7 и lin-4, а их птичьи гомологи let-7a и miR-125b ко-экспрессируются в зачатках конечностей кур с clin-41 (Lancman et al. 2005). Регуляция с помощью miRNA lin-41 может быть высоко законсервированной от C. elegans до кур. 16 дополнительных miRNAs выявлено в развивающихся конечностях (Табл. 1). Эти находки представляют первый всесторонний скрининг miRNAs в развивающихся конечностях. Рассмотрев паттерны экспрессии miRNAs напрашиваются несколько тем. Экспрессия некоторых miRNAs ограничена или исключена из некоторых специфических зародышевых листков и их производных. Напр., miR-200a и -200b экспрессируются в эктодерме и энтодерме, но в основном исключены из мезодермы, тогда как miR-30e и -205ф широко экспрессируются только в эктодерме. miR-199a, по-видимому, экспрессируется почти во всех мезодермальных производных, хотя на самых ранних стадиях она не сопровождает появление мезодермы, в то время как др. miRNAs обнаруживают локальную экспрессию в специфических мезодермальных производных, включая хорду, сердечную и скелетные мышцы, сосудистые эндотелиальные клетки, мезонефрические протоки и мезенхиму конечностей, а также черепно-лицевые области. В целом многие miRNAs экспрессируются внутри формирующихся эмбриональных структур, таких как зачатки конечностей, фарингеальные дуги и ЦНС, в то время как только от одно до нескольких miRNAs выявлено в индивидуальных дифференцированных типах клеток, таких как миокард (miR-1, -1b, -134a, -367), клетках сосудистого эндотелия (-126) или специфических субнаборах нейронов (miR-218, -219). Идентифицировано 4 потенциально новых куриных miRNAs путем гомологичных сравнений с человеческими miRNAs. miR-21, -22, -144 и -363 ранее были описаны у птиц и выявлялись с помощью гибридизации in situ в целом. miR-21 выявлена в амнионе, miR-22 экспрессируется повсеместно, mir-144 экспрессируется в кровяных островках и miR-363 экспрессируется во множественных тканях, включая эктодерму, фарингеальные дуги, хорду и мезенхиму зачатков конечностей. Паттерны экспрессии miR-21 и miR-144 законсервированы у рыбок данио и кур, тогда как miR-21 экспрессируется в виде разных паттернов у этих видов. Безусловно предстоит идентифицировать еще многие miRNAs.

miRNAs многочисленный класс не кодирующих РНК, которые регулируют уровни белков путем соединения с 3'UTRs мРНК мишеней, ингибируя трансляцию или индуцируя деградацию мРНК (He, Hannon, 2004; Pillai, 2005; Valencia-Sanches et al., 2006). miRNAs выявлены у организмов из всех доменов, а недавние сообщения показывают, что геномы позвоночных содержат, по крайней мере, сотни генов miRNAs, которые регулируют стабильность или трансляцию 20-30% всех мРНК (Иутецшср уе al., 2005; Berezikov, Plasterk, 2005; Legendre et al., 2005; Xie et al., 2005).

miRNAs транскрибируются в виде 70-100 нт транскриптов pri-miRNAs, которые подвергаются процессингу в ядре, чтобы стать в 70 нт шпилечной структурой pre-miRNAs. Последняя транспортируется в цитоплазму и превращается в miRNA: miRNA дуплекс. Одна иногда обе нити miRNA дуплекса индивидуально собираются в RNA-induced silencing complex (RISC), состоящий из нескольких белков и зрелой однонитчатой в 21-22 нт miRNA. Хотя их малые размеры делают детекцию зрелых miRNAs довольно проблематичной. Northern блот (Срутб Okayama, 1987; Valoczi et al., 2004; Watanabe et al., 2005), микромассивы (Barad et al., 2004; Thomson et al., 2004) и гибридизация in situ всего количества (Aboobaker et al., 2005; Weinholds et al., 2005; Kloosterman et al., 2006) используются для мониторинга экспрессии miRNAs. В то время как гибридизация in situ всего генома с использованием антисмысловых РНК зондов не является достаточно чувствительной для действительного выявления коротких последовательностей РНК, Locked Nucleic Acid (LNAs), новый тип РНК аналогов, может гибридизироваться с последовательностями РНК мишеней с чрезвычайно высокой специфичностью и стабильностью (Wahlestedt et al., 2000; Elmen et al., 2005) и оказывается эффективным для гибридизации in situ в целом для детекции экспрессии miRNAs (Weinholds et al., 2005; Kloosterman et al., 2005b). Однако, даже используя LNAs, способность выявлять miRNAs in vivo очень изменчива. С помощью гибридизации in situ обзор экспрессии miRNAs у рыбок данио выявил большинство miRNAs и продемонстрировал динамику пространственных и временных паттернов экспрессии (Weinholds et al., 2005). Напротив скрининг с помощью гибридизации in situ у мышей выявил только небольшое количество наиболее высоко экспрессируемых miRNAs (Kloosterman et al., 2006a).

Эмбрионы кур представляют собой удобную альтернативу мышам в отношении miRNAs. Онтогенетические процессы у кур довольно точно воспроизводят процессы у видов млекопитающих, включая мышей и человека. Протокол гибридизации in situ в целом оптимизирован для эмбрионов кур (Nieto et al., 1996; Bell et al., 2004). Мы осуществили гибридизацию in situ в целом для анализа экспрессии 111 зрелых последовательностей miRNA, которые кодируются 135 самостоятельными генами miRNAs (Griffith-Jones, 2004; Griffith-Jones et al., 2006). Результаты показали, что большинство известных miRNAs экспрессируется во время первыз 4-х дней эмбриогенеза в виде широкого разнообразия временных и пространственных паттернов, следовательно, miRNAs участвуют в важных онтогенетических процессах.

84 miRNAs были обнаружены во время изученных стадий развития (НН 3-26). 9 экспрессировались повсеместно, а 75 обнаруживали воспроизводимую дифференциальную экспрессию в одном или нескольких слоях клеток или областях эмбриона.

Early Development, Ectoderm and Entoderm

Немногие miRNAs были обнаружены на ранних эмбриональных стадиях (Табл. 1). На последующих более поздних стадиях количество выявляемых miRNAs быстро увеличивалось в тканях, производных всех трех первичных зародышевых листков. Эта тенденция согласуется с исследованиями у низших позвоночных и показывает, что miRNAs играют существенную роль в регуляции органогенеза, дифференцировке и пост-дифференцировочных событиях скорее, чем на ранних процессах формирования эмбрионального паттерна. На стадии первичной полоски let-7b, miR-130b и -367 экспрессируются в эпибласте, а miR-130b обнаруживается также в involuting (дегенерирующих) клетках полоски (Рис. 1А-С). У рыбок данио ранняя зиготическая экспрессия miR-430 затрагивает материнскую РНК (Giraldez et al., 2005)для удаления её из эмбриона. Хотя ортологи miR-430 не были идентифицированы у амниотических видов, похоже, что let-7b, miR130b и -367b могут выполнять сходную функцию.

Транскрипты miR-30e были выявлены в большей части не-нейральной эктодермы на ст. 10 и на более поздних стадиях также были обнаружены в нефрических протоках. miR-200a и -200b локализованы 2.2 т.п.н. от межгенной области на хромосоме 21 и обнаруживают сходные паттерны экспрессии в эктодерме и энтодерме на ст. 12 и на более поздних стадиях в эктодерме, носу, кишечнике и мезонефрических протоках. miR-205a, которая находится в межгенной области, экспрессируется в каудальной не-нейрональной эктодерме и прогрессивно на более поздних стадиях в вентро-латералной не-нейрональной эктодерме. На ст. зачатков конечностей miR-205a становится преобладающей в эктодерме конечностей, включая апикальный эктодермальный гребень (АЭГ). miR-205b локализуется в интроне гена предшественника коллагеновой α цепи и обнаруживает сходны паттерн экспрессии с miR-205a. miR-21 ранее не была описана у кур, она экспрессируется в амнионе. miR-375? которая участвует в регуляции экзоцитоза инсулина (Poy et al. 2004), обнаружена в энтодермальном панкреатическом рудименте, а позднее в поджелудочной железе. miR-375 экспрессируется также в гипофи зарном рудименте. 10 дополнительных miRNAs были обнаружены преимущественно экспрессирующимися в поверхностной эктодерме (Табл. 1).

Central Nervous System

По крайней мере, 30 miRNAs выявлено в развивающейся нервной системе, хотя ни одна из miRNA не экспрессировалась во всех нервных тканях. miRNAs, экспрессирующиеся в ЦНС обнаруживают дифференциальную экспрессию вдоль дорсо-вентрально, медиа-латеральной и передене-задней осей, в местах, которые предположительно участвуют в формировании региональных паттернов и внутри специфических групп нейрональных и не-нейрональных клеток. Ген miRNA let-7 кодирует, по крайней мере, 11 miRNAs, которые отличаются до 4-х нуклеотидов. let-7a-1, -7a-2, -7a3 и -7j имеют идентичные последовательности в зрелых miRNAs, а let-7a/j хонд выявляет экспрессию в дорсальной половине заднего мозга. let-7b и -7с экспрессируются в заднем мозге и спинном, тогда как транскрипты let-7f и -7k выявлены в заднем мозге, а let-7i и -7k обнаруживаются в переднем мозге.

Зонд miR-9, распознающий идентичные miRNAs, транскрибируется с двух mir-9 генов, обнаруживающих самые сильные и наиболее отличающиеся паттерны экспрессии нейрально экспрессирующихся miRNAs, метят субнаборы клеток во всех сосудах головного мозга, а также в спинном мозге на стадии 19. Хотя mir-9* была описана у некоторых видов (Weinholds et al. 2005), мы не выявили экспрессии miR-9* miRNA у кур на изученных эмбриональных стадиях. Некоторые miRNAs обнаруживали ограниченную экспрессию как в нейральных, так и не-нейральных тканях. Современное исследование генома кур помещает miR-10b на смысловую нить в интроне 2 HoxD10 гена. Однако, геномный ансамбль имеет некоторую неясность в отношении Нох кластера. Транскрипты miR-10b выявлены вдоль всей длины спинного мозга и в мезенхиме передних конечностей. miR-17-5p выявлена в головной области и задних частях нервных складок на ст. 10 и на более поздних стадиях во многих тканях, но низка в сердце. miR-20a и -20b строго экспрессируются в пузырях среднего мозга, дорсальной части заднего мозга и спинном мозге, а также в лицевых структурах, но экспрессируется на низких уровнях по всему эмбриону с наинизшим уровнем экспрессии в сердце. miR-106 экспрессируется в спинном мозге, заднем мозге и гипофизарном рудименте, а также в некоторых мезодермальных структурах. miR-106 является полицистронной с -18b и -20b и возможно также с -363, и их экспрессия в на поверхности конечностей, ЦНС и глотке сходна.

Зонды miR-124a и -124b lf.n идентичные паттерны мечения в заднем и среднем мозге, в латеральных областях спинного мозга и гипофизарном рудименте. miR-124a располагается в межгенной области на хромосоме 2, тогда как два гена miR-124b располагаются разделенные 2.3 т.п.н. на хромосоме 23. Последовательности зондов miR-124a и -124b отличаются по единственному внутреннему нуклеотиду и поэтому несоответствие по одиночному нуклеотиду не ограничивает гибридизации по mir-124 у рыбок данио (Kloosterman et al., 2006), каждый из зондов может распознавать оба транскрипта. Дополнительные данные по miRNAs, экспрессируемым в центральной и периферической нервной системе представлены на Рис. 2 и Табл. 1.

Derivatives of the Mesoderm

Некоторые miRNAs выявляются специфически в сердечной мышце и скелетно-мышечных клетках миотомов. miR-1 (транскрибируемая с двух генов, miR-1-1 и mir-1-2) отличается от miR-1b одним внутренним нуклеотидом и поэтому каждый из зондов может распознавать оба транскрипты (Kloosterman et al., 2006). Зонд miR-1 выявляет транскрипты в формирующейся сердечной трубке с началом дифференцировки кардиальных миоцитов на ст. 9-10 и экспрессия сохраняется в сердце, по крайней мере, в течение всей ст. 22. Зонд miR-1 выявляет также транскрипты в миотомах сомитов, начиная со стадии 14, что совпадает с началом дифференцировки мышечных клеток. Сходное, хотя и более слабое мечение наблюдается с зондом miR-1b. miR-1 является одной из наиболее изученных miRNAs (Zhao et al., 2005; Chen et al., 2006)? выявлены интересные вариации экспрессии в сердце у разных организмов. miR-1 выявляется в дорсальных сосудах у дрозофилы и не обнаруживается в сердце рыб и амфибий, но экспрессируется на высоком уровне в сердце эмбрионов кур, мышей и людей (Zhao et al., 2005; Kloosterman et al., 2006). Тщательное эволюционное сравнение проведено Ason et al. (2006).

miR-1-1, -1-2, -1b и - 206 располагаются непосредственно 5' по отношению к miR-133a-2, -133a-1, -133a-3 и 133b, соответственно. Т.к. каждая пара выглядит как полицистрон (Chen et al., 2006), не удивительно, что зонд miR-133a (который отличается от miR-133b одиночным терминальным нуклеотидом) локализуется как в сердце, так и миотомных скелетных мышцах. Некоторые дополнительные miRNAs экспрессируются выше фона в предсердиях, включая miR-34a, хотя отлавливание и окрашивание фона осложняют интерпретацию настоящего сигнала в предсердиях.

Хотя miR-206 и miR-1 эволюционно родственны, miR-206 экспрессируется в миотомных скелетно-мышечных клетках, но не в сердце. Zhao rt al. (2005) идентифицировали Mef2 cis элемент в 5' промоторной области мышиного гена miR-1-1, который необходим для специфической экспрессии в сердце . Идентичный Mef2 элемент (главная последовательность 5'-CTAAATATGG-3') присутствует в 5' фланкирующей области гена miR-1-1 кур. Анализ 5 т.п.н. 5' фланкирующей области у кур miR-206 выявил Mef2-подобный элемент, содержащий одиночную нуклеотидную замену (5'-CcAATATGG-3'), которая как было установлено устраняет связывание Mef2 (Andres et al., 1995).

miRNAs, экспрессируемые в др. мезодермальных производных, включают miR-126 в кровяных островках и сосудистом эндотелии. miR-144 также ранее не была описана у кур, она выявляется временно в кровяных островках. let-7b и miR-140 и некоторые др. miRNAs (Табл. 1) выявляются в хорде. miR-30a и -30е локализуются в нефрических протоках на уровнях выше фона. Однако интерпретация метки в хорде и нефрических протоках осложнена.

Nearly Ubiquitous Expression

Новый класс паттернов экспрессии miRNAs обнаруживает от средних до высоких уровней экспрессию практически по всему эмбриону, но со значительно сниженным уровнем в одной или немногих тканей, включая сердце. Сюда входят miR-17-3p и -17-5р, -18а, -19а, 19b, -20a, 20b, -92, -106, -107 и 363ю miR-17, -18a, -19a, -20a, -19b и -92 являются частью miR-17-92 полицистрона, а miR-106, -20b, -18b и -363 располагаются внутри паралогичного кластера на хромосоме 4 (Hayashita et al., 2005; He et al., 2005). Northern анализ подтвердил, что miR-15-5p и -20b экспрессируются широко в эмбрионе, но их уровни снижены в сердце. На более поздних стадиях экспрессия miR-17-92 полицистронных miRNAs также снижена в частях эктодермы, особенно в АЭГ конечностей. Повышенная экспрессия miR-17-92 кластера miRNAs ассоциирует с пролиферацией и прогрессом опухолей (Hayashita et al., 2005). Однако, кардиальные миоциты реплицируются в течение всей плодной жизни (Soonpaa, Field, 1997), так что пролиферативная способность миоцитов не коррелирует четко с экспрессией miR-17-92.

Pharyngeal Arches and Facial Structures

13 miRNAs выявлено черепно-лицевой области. miR-10b, -19, -20a, -106, 125b, -128a/b, -130b, -135b, -184, -205a, -217, -218 и -222b обнаруживают экспрессию в одной или нескольких бранхиальных дугах. В то время как большинство из этих miRNAs выявляется в мезенхиме множественных дуг, miR-125b, -128a/b, -130b, -135b, -217, -218 и -222b обнаруживают также локальную экспрессию в каудальной части дуги II, гиоидной дуге. miR-106 выявлена во всех 4-х дугах в мезенхиме непосредственно по соседсту с эктодермой и в развивающихся мышцах дуг, в то время как miR-140 экспрессируется в мезенхиме фронтального возвышения, медиальном и латеральном носовом выпячивании и в верхнее-челючтном возвышении. miR-130b выявляется как в эктодерме, так и мезодерме фарингеальных дуг, но только в мезенхиме фарингеальных щелей. miR-184 экспрессируется в эктодерме фарингеальных дуг. Сходным образом ряд miRNAs выявлен в фарингеальных дугах у рыбок данио (Weinholds et al., 2005). Однако, из комбинации в 21 ген miRNAs, которые экспрессируются в фарингеальных дугах разных видов, только miR-30c, -140 и -205а экспрессируются у всех. 8 из оставшихся генов обнаруживаются только у одного вида, а оставшиеся 11 miRNAs экспрессируются в разных местах эмбриона. Эти результаты подкрепляют общую концепцию, что паттерны экспрессии miRNAs могут обнаруживать существенную дивергенцию в ходе эволюции. Следует упомянуть, что скрининг у рыбок данио (Weinholds et al., 2005) захватывает больший период по сравнению со временем развития в данном исследовании на эмбрионах кур, так что возможно, что дополнительные miRNAs обычно экспрессируются в фарингеальных дугах на более поздних стадиях (Ason et al., 2006).

Limbs

21 miRNAs дифференциально экспрессируются в развивающихся конечностях в виде паттернов, которые указывают на участие из в росте и формировании паттерна. let-7a, miR-10b, -18b и -363 выявляются в зачатках конечностей начиная примерно со ст. 14. let-7a, miR-18b и -363 обнаруживают экспрессию сначала в зачатках крыльев и несколько позднее в зачатках крыльев и ног. miR-10b обнаруживает достоверно более высокий уровень экспрессии в зачатках крыльев, по сравнению с зачатками ног на ст. 18, это сохраняется по крайней мере до ст. 24. Напротив, miR-199a локализуется в интроне Dynamin-1 гена и экспрессируется строго в зачатках крыльев и ног и в др. местах мезодермы. Дополнительные miRNAs обнаружены в мезенхиме зачатков конечностей, включая miR-15a, -18b, -125b, -128a, -130b и 217. Некоторые из этих генов обнаруживают локальную или усиленную экспрессию в области зачатков задних конечностей близких к зоне поляризующей активности (ЗПА). miR-17-5p выявляется в большой области эмбриона, но отсутствует в некоторых регионах эктодермы и в частности в АЭГ. Напротив miR-200a и -200b экспрессируются по всей эктодерме, включая зачатки конечностей и АЭГ. Lancman et al. (2005) сообщи ли недавно, что куриный lin-41 ортолог (clin-41)экспрессируется в зачатках конечностей. У C.elegans lin-41, по-видимому, регулируется с помощью let-7 и lin-4, а их птичьи гомологи let-7a и miR-125b ко-экспрессируются в зачатках конечностей кур с clin-41 (Lancman et al. 2005). Регуляция с помощью miRNA lin-41 может быть высоко законсервированной от C. elegans до кур. 16 дополнительных miRNAs выявлено в развивающихся конечностях (Табл. 1). Эти находки представляют первый всесторонний скрининг miRNAs в развивающихся конечностях.

Рассмотрев паттерны экспрессии miRNAs напрашиваются несколько тем. Экспрессия некоторых miRNAs ограничена или исключена из некоторых специфических зародышевых листков и их производных. Напр., miR-200a и -200b экспрессируются в эктодерме и энтодерме, но в основном исключены из мезодермы, тогда как miR-30e и -205ф широко экспрессируются только в эктодерме. miR-199a, по-видимому, экспрессируется почти во всех мезодермальных производных, хотя на самых ранних стадиях она не сопровождает появление мезодермы, в то время как др. miRNAs обнаруживают локальную экспрессию в специфических мезодермальных производных, включая хорду, сердечную и скелетные мышцы, сосудистые эндотелиальные клетки, мезонефрические протоки и мезенхиму конечностей, а также черепно-лицевые области. В целом многие miRNAs экспрессируются внутри формирующихся эмбриональных структур, таких как зачатки конечностей, фарингеальные дуги и ЦНС, в то время как только от одно до нескольких miRNAs выявлено в индивидуальных дифференцированных типах клеток, таких как миокард (miR-1, -1b, -134a, -367), клетках сосудистого эндотелия (-126) или специфических субнаборах нейронов (miR-218, -219).

Идентифицировано 4 потенциально новых куриных miRNAs путем гомологичных сравнений с человеческими miRNAs. miR-21, -22, -144 и -363 ранее были описаны у птиц и выявлялись с помощью гибридизации in situ в целом. miR-21 выявлена в амнионе, miR-22 экспрессируется повсеместно, mir-144 экспрессируется в кровяных островках и miR-363 экспрессируется во множественных тканях, включая эктодерму, фарингеальные дуги, хорду и мезенхиму зачатков конечностей. Паттерны экспрессии miR-21 и miR-144 законсервированы у рыбок данио и кур, тогда как miR-21 экспрессируется в виде разных паттернов у этих видов. Безусловно предстоит идентифицировать еще многие miRNAs.

MicroRNA Expression During Chick Embryo DevelopmentD.K.Darnell, S.Kaur, S.Stanislaw, J.K.Konnieczka, T.A.Yatskievych, P.B.Antin Dev.Dyn. - 2006. - V.235. No 11. P. 3158-3165

MicroRNA Expression During Chick Embryo Development
D.K.Darnell, S.Kaur, S.Stanislaw, J.K.Konnieczka, T.A.Yatskievych, P.B.Antin
Dev.Dyn. - 2006. - V.235. No 11. P. 3158-3165