MicroRNAs (miRNAs) являются малыми, не кодирующими РНК, которые регулируют экспрессию генов на пост-транскрипционном уровне за счет спаривания оснований с частично комплементарными последовательностями в 3' untranslated regions (3' UTRs) мРНК мишеней. В точности, как miRNAs репрессируют трансляцию неясно, хотя считается, что они осуществляют свои эффекты посредством разнообразных механизмов. Двумя группами исследователей было продемонстрировано, что мРНК, подвергающиеся действию miRNA, присутствуют на транслирующих полисомах даже, когда ингибирована продукция белков.

Nilsen с коллегами анализировали субклеточное распределение трех встречающихся в большом количестве miRNAs - miR-21, miR-16 и let-7a - в экспоненциально растущих клетках HeLa. Они установили, что огромное большинство из всех трех miRNAs седиментируется с активно транслирующими фракциями полисом в градиенте сахарозы. Интересно, что трансфекция клеток с помощью олигонуклеотида, комплементарного let-7a ведет к сдвигу в седиментации let-7a. Также в цитоплазматических экстрактах, обработанных с помощью micrococcal nuclease, которая расщепляет экспозируемые регионы мРНК, miR-21 оказалась значительно более резистентной к перевариванию, чем активновая мРНК и её профиль седиментации отличался от профиля рибосом или фрагментов актиновой мРНК, защищенной рибосомами. Всё это указывает на то, что miRNAs ассоциируют с полисомами путем взаимодействия с мРНК мишенями.

Когда авт. обрабатывали клетки puromycin, агентом, который прекращает удлинение полипептидной цепи, то фракция полисом оказалась редуцированной, а седиментация и мРНК и miRNAs сдвигалась параллельно в более легкую, не транслирующую фракцию рибосом. Группа Nilsen также показала, что известная мишень miRNA, KRAS мРНК, седиментируется с полисомами и сдвигается в более легкую фракцию в градиенте сахарозы после обработки puromycin. Это указывает на то, что miRNAs ассоциируют с активно транслируемыми мРНК, которые включают мРНК мишени.

Вторая группа, руководимая Richter, трансфицировала HeLa клетки репортерной мРНК конструкцией, которая была сцеплена с lin-41 3' UTR, которая содержит два сайта мишени для let-7a miRNA. Присутствие let-7a miRNA вызывало ~3.5-кратное снижение экспрессии репортерной мРНК. Большинство репортерных мРНК седиментировалось во фракцию. содержащую полисомы, в сахарозном градиенте, а обработки puromycin приводила к сдвигу в седиментации к фракции более легких рибосом. Всё это указывает на то. что репортерная мРНК ассоциирует с активно транслирующими рибосомами.

Авт. сконструировали lin-41-содержащую репортерную мРНК с элементом. чувствительным к железу в 5' UTR, что вызывает ингибирование трансляции в отсутствие железа. В самом деле, в присутствие железа большинство репортерных мРНК седиментируется с полисомами, в то время как в отсутствие железа, in vivo рибосомы 'run-off' ведут себя как репортерные мРНК, седиментируемые с нетранслируемыми рибонуклео-частицами.

Итак, если мРНК мишени судя по всему транслируются нормально с помощью активно транслирующих полисом, то почему почти не продуцируется белка? Группа Richter получила ключ к разгадке, когда они попытались иммунопреципитировать рибосомы, ассоциированные с репортерной мРНК, которая содержала несколько Myc меток на N конце кодируемого белка и или содержала или нет lin-41 3' UTR. Рибосомы, ассоциированные с репрессированными мРНК, но не с нормально транслируемыми мРНК, не иммунопреципитировались с anti-Myc антителами. Это указывает на то, что зарождающаяся полипептидная цепь, происходящая с мРНК мишени под контролем let-7a или разрушается немедленно, замаскированная с помощью ассоциированных факторов, которые метят белок для деструкции, или каким-то др. способом она прекращает трансляцию. Выявление механизма деструкции синтезируемого полипептида несомненно является следующей целью.

Baek et al. The impact of microRNAs on protein output. Nature 30 July 2008 (doi: 10.1038/nature07242) Article # Selbach et al. Widespread changes in protein synthesis induced by microRNAs. Nature 30 July 2008 (doi: 10.1038/nature07228) Article

Группы Baek et al. и Selbach et al., наблюдали, что индивидуальные miRNAs вызывали репрессию сотен белков. Они также идентифицировали специфическое свойство мРНК как имеющее значительную причинную роль в подавлении белков с помощью miRNAs - последовательность в 7-8-нуклеотидов в 3' не транслируемой области, которая комплементарна запальной области (seed region) соотв. miRNA. Эта seed-комплементарная последовательность была существенно обогащенной последовательностью только в репрессируемых белках, хотя некоторые белки без этой последовательности в своих транскриптах также

Изучение miRNAs, которые обычно не присутствуют в клетках HeLa, не обязательно выявляло эндогенные miRNA мишени. Обе группы исследовали этот вопрос с помощью knocking out экспрессии

Baek et al. вызывали нокаут экспрессии miR-223 в мышиных нейтрофилах и наблюдали реакцию у 3,819 белков. Среди тех, которые оказались де-репрессированными, seed-комплементраная последовательность была опять же обогащенной. Они анализировали также изменения в экспрессии мРНК , используя микромассивы. Сравнение экспрессии белков и мРНК показало, что репрессия трансляции с помощью miR-223 была довольно умеренной и происходила реже, чем репрессия транскрипции с помощью той же самой miRNA. Авт. пришли к выводу, что широко распространенный, но низкий уровень обусловленной miR-223 трансляционной репрессии указывает на то, что она функционирует как реостат, чтобы высококачественно приводить в порядок

Selbach et al. вызывали нокаут экспрессии let-7b в HeLa клетках. Известная let-7b мишень оказывалась дерепрессированной и неудивительно, т.к. эта мишень содержит seed-комплементраный сайт. Дальнейший анализ этой группой показал тот же самый набор белков, которые были репрессированы в экспериментах по избыточной экспрессии let7b, т.к. seed-комплементраный сайт был дерепрессирован в let-7b нокаутных клетках. Эта анти-корреляция также оказалась верной для большинства из приблизительно 2,700 белков оцененных количественно в экспериментах, но не для непосредственных let-7b мишеней с seed-комплементраными сайтами. Они пришли к выводу, что когда let-7b позитивно или негативно регулируется, тот тоже самое и в протеоме, это заставляет думать, что let-7b может тонко настраивать продукцию белков с

Обе работы показали, что индивидуальные miRNAs могут оказывать влияние на глобальную экспрессию белков и что репрессия белков скорее всего обеспечивается за счет seed-complementary области в соотв. мРНК. Возникает следующая картина, что miRNAs обладают не столь уж малым количеством мРНК мишеней - они действуют на транскрипционном и трансляционном уровне, чтобы деликатно модулировать протеом.

FURTHER READING Filipowicz, W., Bhattacharyya, S. N. & Sonenburg, N. Mechanisms of post-transcriptional regulation by microRNAs: are the answers in sight? Nature Rev. Genet. 9, 102–114 (2008) Article