Наружная мембрана митохондрий содержит канальные белки со структурой β-barrel. Предшественники β-barrel белков синтезируются в цитозоле и импортируются в митохондрии с помощью генеральной транслоказы TOM и sorting and assembly machinery (SAM) комплекса. Но как β-barrel белки отсортировываются и интегрируются в наружную мембрану неясно. Kutik et al. предложили двух-ступенчатый механизм, согласно которому сигнальная последовательность управляет ассоциацией β-barrel белка с SAM, и затем β-barrel белок интегрируется в липидную фазу наружной мембраны.

Производили скрининг на потенциальный сортирующий сигнал у β-barrel предшественников с помощью делеций N- и C-терминальных частей важного β-barrel белка Tom40 и с помощью мониторинга важных меченных конструкций в изолированных митохондриях. Tom40 конструкции с С-терминальными укорочениями оказались дефектными по ассоцииации с комплексом SAM, а законсервированная сигнальная последовательность, состоящая из крупного полярного остатка, неизменного Gly и двух крупных гидрофобных остатков, была идентифицирована в наиболее С-терминальной прогнозируемой трансмембранной β-нити.

За счет мутирования каждого из 4-х законсервированных сигнальных остатков, Kutik et al. установили, что полярный и дидрофобные остатки являются важными для отсортировки Tom40 на SAM. Напротив, мутирование неизменного Gly остатка не влияло на образование комплекса Tom40 с SAM, но вместо этого предупреждало инсерцию в мембрану. Итак, четыре законсервированных остатка сигнальной последовательности участвуют в разных функциях, которые мб. частью двухступенчатого механизма.

Эти находки подтверждены и на др. β-barrel белках, демонстрируя всеобщность сигнальной последовательности. Это также продемонстрировано созданием гибридных β-barrel белков с заменой сигнала и тестированием их функциональности и с помощью экспериментов по конкуренции с синтетическими пептидами с сигнальой последовательностью. Линия дрожжей, которая лишена эндогенного Tom40 была жизнеспособной в присутствие экспрессируемого с плазмиды дикого типа Tom40, но не в случае экспрессии мутантной сигнальной последовательности Tom40. Сигнальная последовательность Tom40, следовательно, существенна для клеточной жизнеспособности.

Воссоздание SAM комплекса в липосомах ведет к образованию канала, с пропускными свойствами, регулируемыми присутствием пептида с сигнальной последовательностью. Напротив, активность канала, который формируется с помощью Sam50 оказываетя незатронутой пептидом с сигнальй последовательностью. Авт. полагают, что др. важнаяSAM субъединица, Sam35, может быть необходима для распознавания сигнальной последовательности.

Однако, эта возможность создает топологическую проблему: Sam35, как известно, располагается на цитозольной поверхности наружной мембраны. тогад как β-barrel предшественники вставляются в наружную мембрану из межмембранного пространства. Авт. приходят к выводу, что Sam35 внедряется в наружную мембрану за счет своей тесной ассоциации с мембранными доменами Sam50, и т.о. β-barrel предшественники могут непосредственно достигать Sam35. Более того, связывание SAM комплекса в изолированных митохондриях с помощью пептида с сигнальной последовательностью блокируется в Sam35-дефицитных мутантных органеллах, указывая тем самым. что Sam35 в самом деле необходим для распознавания сигнальной последовательности. Эта находка подтвержден in vitro с очищенным Sam35 и пептидом с сигнальной последовательностью.

На основании эти х находок авт. предположили, что транслокация β-barrel предшественников на SAM инициируется благодаря связыванию наиболее С-терминальной β-нити— которая содержит сигнальную последовательность — с Sam35. Сигнальное связывание ведет к открытию SAM канала и инсерции β-barrel предшественника в канал. Предшественник затем вбок высвобождается из SAM комплекса в наружную мембрану, а инсерция в мембрану связана с законсервированным Gly остатком в сигнальной последовательности и на др. β-barrel нити.