Контроль Транскрипции

The nuclear envelope and transcriptional control Asifa Akhtar & Susan M. Gasser Nature Reviews Genetics 8,No.7, 507-517 (July 2007) \| doi:10.1038/nrg2122
Cells have evolved sophisticated multi-protein complexes that can regulate gene activity at various steps of the transcription process. Recent advances highlight the role of nuclear positioning in the control of gene expression and have put nuclear envelope components at centre stage. On the inner face of the nuclear envelope, active genes localize to nuclear-pore structures whereas silent chromatin localizes to non-pore sites. Nuclear-pore components seem to not only recruit the RNA-processing and RNA-export machinery, but contribute a level of regulation that might enhance gene expression in a heritable manner. Рис.1. \| Heterochromatin in mammalian and yeast cells is distinct from nuclear pores. Рис.2. \| The nuclear periphery in metazoans and yeast. Рис.3. \| Telomere position through Sir4–Esc1 is independent of nuclear-pore positioning. Рис.4. \| A model for the role of the NPC in coupling transcription and mRNA processing by gene looping in yeast. Рис.5. \| The dosage-compensated male X chromosome in Drosophila melanogaster. Box 1 \| Chromatin mobility FURTHER INFORMATION Akhtar homepage Gasser homepage DATABASES Entrez-Gene Abd-B INO1 HXK1 GAL1 GAL2 HSP104 UniProtKB Polycomb Su(Hw) CTCF Nup2 Sir2 Sir3 Sir4 Esc1 Ulp1 Mms21 Ctf18 Rap1 Nup49 Nic96 Nup116 Nup60 Mlp1 Mlp2 Xpo1 Cse1 Nsp1 Nup84 Nup100 Gcr1 Gcr2 Gal4 Ada2 Sus1 Sac3 Thp1 Cdc31 Mex67 Med8 Scs2 MSL1 MSL2 MSL3 MOF Rrp6	Взгляд на электронную микрофотографию ядра клетки млекопитающих обнаруживает специальное взаимоотношение между ядерной оболочкой и хроматином. В дифференцированных ядрах плотно окрашенный, транскрипционно неактинвый 'гетерохроматин' обычно образует слой напротив внутренней поверхности ядерной мембраны. Эти участки гетерохроматина прерываются ядерными порами, которые содержат светло-окрашенную нуклеоплазму из 'открытых' или активных доменов (Fig. 1a,b). Сходным образом, у почкующихся дрожжей флюоресцентные маркеры для репрессивного хроматина иядерные поры могут быть леко различимы как самостоятельные не перекрывающиеся серии фокусов (Fig. 1c). Эвляется ли эта субъядерная компартментализация побочным эффектом дифференциальной упаковки хроматина, или позиционная информация действительно вносит вклад в регуляцию генов? Исследования на почкующихся дрожжах и Drosophila melanogaster подтверждают, что околоядерные компартменты влияют на различные ядерные активности от транскрипции и экспорта мРНК до репарации ДНК и стабильной передачи наследуемого состояния репрессии. Предполагается, что эквивалентные функциональные эффекты существуют и в системах млекопитающих. Хорошо изученным примером функциональные окоядерных микроусловий является то, которое создается с помощью образования кластеров теломер на ядерной оболочке дрожжей¹. Эти фокусы секвестрируют факторы молчания, которые способствуют и стабилизируют гетерохроматин. Недавние данные подтвердили, что ассоциация активных, индуцированных генов с ядерными порами создает второй функциональный компартмент на периферии ядра. Гены могут перемещаться к порам зависимым от транскрипции способом и уровни экспресии могут снижаться, если эта релокализация нарушена. Исследования dosage compensation у мух также показало, что связанные с порами факторы могут помогать позитивной регуляции экспрессии генов у самцов. Epigenetic specification of cell identity Транскрипционная регуляция является критической для предопределения качественных особенностей клеток. Это не может быть достигнуто исключительно за счет организованного появления и исчезновения транскрипционных факторов, а в результате сложного взаимодействия сиквенс-специфических ДНК-связывающих факторов и эпигенетического статуса последовательностей мишеней, которое ограничивает фракцию генома, которя является предметом сиквенс-специфического регулятьорного контроля (rev. 2). В комбинации с пост-транскрипционными ступенями, которые регулируют эффективность процессинга мРНК, экспорт и трансляция, являются механизмами, которые ведут к воспроизводимым специфичным для типов клеток паттернам генной экспрессии. Эукариотические геномы содержат три класса хроматина2, 3. Первый является открытым или активно транскрибируемым хроматином, который содержит гены с ангажированными РНК полимеразами. Второй является потенциально активным хроматином, который содержит промоторы, которые позиционированы, чтобы отвечать на активирующие сигналы, но с которых стабильные транскрипты редки или не существуют. Эти два состояния объясняют огромное большинство хроматина у дрожжей, но до сих пор представлены лишь небольшой фракцией в геноме млекопитающих. Третий тип хроматина представлен транскрипционно молчащих гетерохроматином, составляет большинство ДНК в дифференциированных соматических клетках. Здесь гены в основном репрессированы наследуемым способом и промоторы генов стремятся быть недоступными для транскрипционных факторов (rev. 3). Хотя существование эти х характерных хроматиновых доменов хорошо известно, факторы, которые создают и регулируют их охарактеризованы плохо. Один элемент, который вносит вклед как в становление, так и поддержание состояний хроматина, связан с их пространственным распределением внутри интерфазного ядра (rev. 1,4–7). Insulator function and nuclear pores Элементы некодирующих ДНК, называемые пограничными элементами, вносят вклад в хроматиновые домены двумя способами8. Во-первых, они защищают регионы открытого хроматина от посягательств репрессии, которая вызывается гетерохроматином. Во-вторых, они ограничивают взаимодействие энхансеров с промоторами. Оба события, как полагают, используют элементы ядерной организации или посредством формирования хроматиновых петель или путем привязки к топологически определенным доменам ядерных структур8, 9, 10, 11. Важным аспектом разграничивающей функции является способность обеспечивать дально-действующие взаимодействия ДНК. Напр., D. melanogaster insulator элемент Fab-7 (также известный как Abd-B) , как было показано, физически ассоциирует со второй, случайно вставленной копией Fab-7 независимо от её позиции на хромосомном плече. Эта ассоциация в транс-положении нарушается с потерей белка Polycomb12, который также обладает изолирующей функцией. Др. элемент D. melanogaster gypsy insulator, который связывает фактор, наз. Suppressor of hairy wing (Su(Hw)), может обладать сходной функцией. Элемент gypsy сам по себе часто ассоциирует с ядерной периферией и если он оказывается вставленным в геном, то вызывает в окружающей ДНК сдвиг к месту инсерции Su(Hw)-зависимым способом11. Более того, подобно Polycomb-связывающим сайтам, два gypsy элемента, которые вставлены в удаленные сайты одной и той же или разных хромосом обнаруживают само-ассоциацию. Хотя околоядерное закрепление gypsy коррелирует с его разграничивающей функцией, Xu с коллегами позднее идентифицировали стержневой элемент в 340-bp, который поддерживает разграничивающую активность без закрепления ДНК на периферии ядра13. Этот минимальный стержневой элемент может связывать Su(Hw) и сохранять способность к взаимодействию в транс-положении13. Т.о., периферическое положение может быть побочным эффектом избирательных дально-действующих взаимодействий, которые генерируют петли хроматина, которые необходиы для insulator функции8. Зависят ли др. инсуляторы от прикрепления к ядерным структурам? В клетках человека conserved sequence-specific factor, CTCF, участвует в функции широкого набора инсуляторов и, как было продемонстрировано, привязывает ассоциированный с инсулятором трансген с ядрышком14. Было предположено, что разграничивающая активность CTCF может быть необходима для этой локализации. Сходным образом скрининг почкующихся дрожжей, которые оценивались в отношении insulator активности в библиотеке целенаправленно слитых белков9 предоставил множество кандидатов, которые действуют как барьеры распространению гетерохроматина. Некоторые, по-видимому, действуют путем создания петель ДНК, которые соответствуют 'защищаемым' генам и привязывают их к Nup2 (nucleoporin 2), динамическому компоненту ядерных пор9. Сходные модели привязывания были предложены для транскрипционного фактора TFIIIC делящихся дрожжей, который блокирует распространение гетерохроматина очевидно путем прикрепления рядом с ядерной оболочкой10. Связывание фактора TFIIIC у почкующихся дрожжей с геном tRNA вблизи локуса silent mating type HMR также необходимо для пограничнрой функции15. В дальнейшем исследовании дрожжевые tRNAгены, как было установлено, доступны для расщепления с помощью Nup2–micrococcal-nuclease fusion16. Предполагая, что функциональный Nup2 связан с порами, эти результаты доказывают, что порой-обеспечиваемое прикрепление может блокировать распространение гетерохроматина у дрожжей. Остается протестировать, является ли TFIIIC или прикрепление к ядерной поре универсальным механизмом инсуляторной и пограничной функции. The nuclear envelope harbours repressive zones Telomeric silencing in yeast. Наблюдение, что закрепление на периферии ядра д. защищать промотор от репрессии, явилось сюрпризом, т.к. у всех организмов от дрожжей до человека, ядерная оболочка известна как приют репрессированных доменов (Fig. 2). Однако, было показано у почкующихся дрожжей, что места, которые закрепляют молчащий хроматин, механистически отличны от тех, что предназхначены для активных генов^17,18. Гетерохроматин дрожжей формирует субтеломерные домены и в основном состоит из недостаточно ацетилированных нуклеосом, которые связаны с комплексом молчащих информационных регуляторов, Sir2, Sir3 и Sir4 (rev. Ref. 19). Sir-связанный хроматин локализуется почти исключительно в фокусах на ядерной оболочке²⁰, расположенных между, но не совпадающими с ядерными порами^18,21,22 (Fig. 1c). Хотя гетерохроматин в клетках млекопитающих также обнаруживается на ядерной оболочке между порами, но механизмы закрепления отличны у дрожжей и многоклеточных эукариот^1,6. У почкующихся дрожжей молчащие теломеры закреплены на местах, лишенных пор, с помощью двух частично перекрывающихся путей^18,23,24. Один из них четко коррелирует с репрессией и обеспечивается за счет связывания Sir4 с кислым, ассоциированным с мембраной белком, наз. Esc1 (enhancer of silent chromatin 1)^18,22. Взаимодействие Sir4–Esc1 необходимо и достаточно для закрепления молчащего хроматина на ядерной оболочке¹⁸, даже молчащего хроматина на эписоме²³. Иммуно-электронная микроскопия подтверждает, что Esc1 является периферическим, в основном исключенным из ядерных пор (Fig. 2). Было продемонстрировано, что это разделение, Esc1 и молчащих теломерных фокусов, сохраняется в виде распределения дикого типа в присутствии мутации nup133Delta, которая позволяет порам формировать кластеры на одной стороне ядра¹⁸ (Fig. 3). Второй путь закрепления теломер нуждается в консервативном гетеродимерном белке yKu^24,25. Этот фактор, связывающий концы ДНК, может закреплять хромосомы независимо от Sir-обусловленного молчания, возможно помогая теломерам формировать кластеры вместе прежде, чем будет достигнуто состояние молчания. Др. факторы, включая компоненты ядерных пор, как полагают, влияют на закрепление и репрессию теломер. Эти эффекты, скорее всего, непрямые, отражают потерю собственно секвестрации или таргетинга ассоциированной с порами desumoylase Ulp1 (ubiquitin-like-specific protease 1) или SUMO conjugase, Mms21 (methylmethanesulfonate-sensitivity protein 21), которые модифицируют yKu^26,27. Непрямые эффекты на закрепление теломер могут быть также приписаны мутациям факторов structural maintenance of chromatin (SMC) или компонентам их предполагаемых загрузочных комплексов, таких как Ctf18 (chromosome transmission fidelity protein 18)²⁸. Мы ожидаем дополнительных пронизывающих мембрану белков, участвующих в закреплении yKu- и Esc1-связанных теломер, включая вообще-то и консервативные белки внутренней ядерной оболочки, такие как те, что содержат SUN или KASH домены¹. Как подобная ядерная организация молчащего хроматина дрожжей вносит вклад в наследуемую репрессию? Важно, что факторы молчания (Sir2, Sir3 and Sir4) лимитируют концентрацию ещё где-либо в ядре за исключением теломер, где множественные сайты связывания белка, места секвестрирования факторов молчания от гистоновых хвостов из др. мест генома²⁹. Эта секвестрация факторов молчания благоприятствует распространению связывания Sir вдоль хроматина вблизи теломер и предупреждает смешанную репрессию не-субтеломерных генов²⁹. У мутантов, которые высвобождают теломеры и делают возможной дисперсию Sir-белка, наблюдается как потеря субтеломерной супрессии, так и избыток репрессии внутренних локусов, которые располагаются вблизи сайтов, которые nucleate связывание Sir. В соответствии с этим, Andrulis et al. показали, что искусственное закрепление хроматина на ядерной оболочке с помощью пронизывающих мембрану якорей, м. способствовать репрессии репортера до тех пор, пока он содержит Sir-nucleating сайты, называемые silencers³⁰. Хотя этот результат обычно неправильно интерпретируют, как указание, что закрепления на ядерной оболочке достаточно для обеспечения репрессии, что работа действительно предполагает, так это то, что расположение цис-действующих контрольных элементов (silencer) вблизи пулов Sir д. облегчать стабильную репрессию. Др. условия, которые усиливают слабую функцию замалчивания, способствуют молчанию, включая targeting Sir4-связывающего домена Esc1 на репортер²² или скоординированую избыточную экспрессию всех Sir генов²⁹. Итак, эти исследования говорят в пользу того, что критический элемент, который обеспечивается ядерной периферией, это доступ к ограниченнуому пулу репрессоров¹. Nuclear lamina and gene repression. В клетоках высших эукариот ядерная ламина является слоем из белков промежуточных филамент в месте интерфейса между хроматином и внутренняй ядерной мембраной (Fig. 2b). Alpha-спиральные heptad повторы ламины формируют скрученные в двойную спираль димеры, которые ассоциируют head-to-tail в филаментах, которые соединяют пору с порой. Потеря lamin A, которая ведет к гибели на постнатальной неделе 8 у мышей, коррелирует с драматическими изменениями в размере и форме ядер кардиомиоцитов и, что важно, со смещением гетерохроматина с периферии ядра^31,32. Поразительно обилие множества типичных репрессивных гистоновых меток, триметилирование гистона H3 по лизину 9 (H3K9me3), также было редуцировано. Дефекты в гетерохроматине и H3K9me3 также возникали в клетках, несущих мутации far-more-minor lamin A, такие как маленькие С-терминальные делеции, при синдроме преждевременного старения Hutchinson–Gilford progeria^33-35. Наконец, у червей дефекты организации хроматина, которые вызываются деплецией lamin, воспроизводятся за счет элиминации двух или более ассоцированных с lamin белков, Man1 и emerin, которые участвуют с ядерными lamin-ассоциированными белками, чтобы прикрепить хроматин к ядерной периферии³⁶. Т.о., ядерная ламина участвует или непосредственно или опосредованно в собственно распределении и поддержании гетерохроматина. Обилие и стабильность lamin белков предоставляют способ идентификации ДНК, которая ассоциирует с ядерной оболочкой на геномной шкале. Чтобы локализовать lamin-ассоциированные последовательности, Pickersgill et al. приспособили in vivo технику модификации ДНК, наз. DamID для D. melanogaster и увязали её с профилированием микромассивов³⁷. Этот метод использует слияние Escherichia coli DNA adenine methyltransferase (Dam) с геном lamin, который экспресируется на низком уровне в клетках культуры ткани D. melanogaster³⁷. Области генома мухи, которые были бок-о-бок с lamins, были преимущественно метилированы путем слияния белков, они могут быть изолированы, мечены и использованы для зонда к микромассивам всего генома. Приблизительно было обнаружено 500 генов, которые, по крайней мере, временно ассоциировали с lamin; большая масса из них была истощена в активных гистоновых модификациях, и были транскрипционно молчащими и обнаруживали кинетику поздней репликации³⁷. Они располагались вдоль всех хромосмных плеч, но не включали конституитивный центромерный гетерохроматин. Хотя невозможно определить с помощью DamID, связывают ли lamin-связывающие сайты временно или стабильно, но существует достоверное перекрывание этих локусов с местами, которые были предсказаны как стабильно связанные с ядерной оболочкой с помощью микроскопии высокого разрешения³⁸. Nuclear space and chromatin mobility Если субъядерное расположение любого определенного хромосомного локуса отражает его состояние транскрипционной активности, то хроматин д. быть способным перемещаться, чтобы достигать тканеспецифической и стадиоспецифической организации. Как жк движется хроматин? Используя time-lapse воспроизведние изображений GFP-нагруженных хромосомных локусов в лаб. Sedat наблюдали, что хроматин дрожжей и мух занят постоянными случайными блужданиями³⁹. Однако, эти инициальные исследования на дрожжах, проведенные на локусах, проксимальных к центромере, которые были прикреплены к пронизывающим ядерную оболочку spindle pole body (SPB) посредством коротких интерфазных микротрубочек, ограничивали движения хроматина^39-43. До некоторой степени менее принудительные случайные движения позднее были описаны во множестве для других локусов дрожжей путем связывания LacO-нагруженных генов с GFP–nuclear-pore маркером^40,42, модификации, которая делает возможным соотв. анализ подвижности и позиции относительно ядерной оболочки. У почкующихся дрожжей наиболее активные хромосомные локусы перемещаются с радиусом в 0.5–0.7 μm при случайном перемещении в нуклеоплазме^23,40,44. Это соответствует более чем 1/4 ядерного диаметра у дрожжей, но менее 1/10 ядерного диаметра в клетках млекопитающих. Т.к. 50% ядерного объема дрожжей находится внутри периферической оболочки, которая приблизительно толщиной 0.4 μm, то большинство дрожжевых генов, по-видимому, случайно сталкиваются с ядерной мембраной. С др. стороны, молчащие теломеры перемещаются в виде очень принудительных движений вдоль внутренней стороны ядерной оболочки и лишь редко занимают сердцевину ядра^23,24,40,44. Всё же движение типичных теломер ограничены приблизительно 12% поверхности внутренней ядерной оболочки⁴⁵. Сходное ограничение наблюдается для субнабора активных генов, особенно galactose-индуцированных локусов, которые ассоциируют с ядерными порами после индукции^46,47. Учитывая их латеральную динамику и поразительную радиальную локализацию, было предположено, что эти активные гены движутся от поры к поре⁴⁷. Путем мониторинга динамики флюоресцентно меченных SPB, внедренных в ядерную оболочку дрожжей⁴⁰, оказалось возможным продемонстрировать, что движение хроматина не возникает в результате ротаций ядра: перемещения SPB были более четко ограничены, чем движения хроматина (rc = 0.2 μm). Более того, photobleaching области пор, меченных Nup49–GFP, показало, что латеральные перемещения unbleached пор были более медленными, чем таковые хроматина, с восстановлением, требущим минут скорее, чем секунд^46,48. Что удерживает хроматин на ядерной оболочке? Значение межбелковых взаимодействий для ограничения динамики хроматина было продемонстрировано путем отслеживания колец, флюоресцентно нагруженных дрожжевым хроматином, которые вырезались из генома с помощью индуцибельных рекомбинационных событий²³. В то время как не-молчащие локусы на вырезанных кольцах пересекали дрожжевое ядро в быстром прыжке, кольца репрессированного хроматина фиксировались на ядерном периметре²³. Это ограничение было обусловлено сродством Sir белков к Esc1, т.к. если этот ассоциированный с мембраной якорь был нарушен, то вырезанный хроматин перемещался свободно как активный локус, хотя он оставался репрессированным²³. Т.о., первичное ограничение подвижности обусловливается не структурой хроматина, а белком обусловленными связывающими сайтами на ядерной оболочке, которые ограничивают перемещения ДНК в субядерной зоне⁴⁹. Сходные ограничения наблюдались для lamin-связанных сайтов в культивируемых клетках млекопитающих⁵⁰. Не-кодирующие РНК также могут выполнять роль в закреплении гетерохроматина у некоторыха видов. Эти исследования демонстрируют важный принцип, что ядерные макромолекулы, включая хроматин, высоко мобильны несмотря на прикрепление (Box 1). Это подтверждается одинаково быстрой кинетикой диффузии ядерных белков и частиц мРНК у высших эукариот^51,52. Дальнейшее по всему геному ChIP исследование с использованием у почкующихся дрожжей феромона спаривания alpha-фактора для индукции изменений в генной экспрессии, картировало ассоциацию генов с компонентами пор Xpo1, Nup116, Mlp1 и Mlp2 (Ref. 54). Большинство alpha-фактором индуцированных генов имело, по крайней мере, временную ассоциацию с ядерной периферией в ответ на активацию. Т.к. эти гены были распределены на 13 из 16 дрожжевых хромосом, то глобальные изменения организации хроматина, как было предположено, происходят в ответ на феромон⁵⁴. Интересно, что ассоциированная с порами мРНК экспортирующего фактора Mlp1 восстанавливалась с индуцированными генами чувствительным к RNase способом, а картирование высокого разрешения помещает Mlp1 преимущественно на 3' конце активных генов, указывая тем самым, что накопление транкриптов может быть важным для околоядерного закрепления. Менее ясно, почему Mlp1 или Mlp2 восстанавливались также с молчащими локусами, т.к. генетические исследования говорят против какой-либо непосредственной роли Mlp белков в закреплении теломер^18,22,24,25. Возможным объяснением явлется то, что когда формирующие сеть белки анализировались с помощью ChIP, то их ассоциация с ДНК, по-видимому, частично обусловлена непрямыми взаимодействиями, которые стабилизируются с помощью поперечных связей с formaldehyde. Следовательно, важно увязать ChIP с генетическими подходами и количественной микоскопией на больших популяциях клеток. Альтеранативый подход на уровне всего генома это картирование позиции генов, связанных с регулируемым расщеплением ДНК с помощью micrococcal nuclease (MN). Это исследование показало, что ранние ступени инициации, но не сами мРНК, связывают гены с ядерными порами. Авт. отслеживали паттерн взамиодействий динамичного белка пор Nup2, слитого с MN¹⁶. Nup2–MN-зависимое расщепление было выявлено в промоторах генов, индуцируемых galactose, это явно подтвеждает результаты ChIP. Но, когда задействована целая хромосома 6, то Nup2–MN расщепления обнаруживаются в промоторах большинства дивергентно транскрибируемых генов RNA polymerase II (RNA pol II) и в tRNA кластерах, независимо от высоких уровней транскрипции. Тем не менее доступность увеличивается, когда гены индуцируются¹⁶. На galactose-индуцированных промоторах транскрипционный фактор Gal4 и TATA-связывающий фактор усиливают Nup2–MN расщепление, в то время как компоненты SAGA histone acetyltransferase комплекса был и не нужны, указывая тем самым, что ранние ступени инициации увеличивают доступность для Nup2–MN¹⁶. Предполагается, что временный контакт с ядерными порами может быть предварительным условием для активации RNA pol II. Эти геномные подходы выявляют в чем-то потиворечивый сценарий: хотя они показывают, что индукция генов и поперечное связывание NPCкоррелируют, они неспособны установить функциональную зависимостсь транскрипции от позиционирования. Или отобранные промоторные факторы, способные закреплять гены, или транскрипты и транспортные факторы необходимы для поставки индуцируемых генов на ядерные поры? Одним из ограничений подходов геномного профилирования является то, что они имеют тенденцию отлавливать быстрые или одноударные события, учитывая количественно как стабильные, так и временные взаимодействия с одинаковой эффективностью. По этой причине неясно, исходя из Nup2–MN или ChIP, насколькостабильными может быть оценки взаимодействий. Наконец, эти результаты согласуются с наблюдением, что многие, если не большинство, транскрибируемые гены у дрожжей и млекопитающих не ассоциируют стабильно с порами. Это подтверждается изучением непосредственных картин активных^{локусов как в живых дрожжах²³, так и клетках млекопитающих51}. Чтобы расшифровать функциональное значение связи NPC–ген, необходим количественный анализ положения гена, скоррелированного с количественной оценкой уровня транскриптов в соотв. клетках. Yeast nuclear pores as active zones Количественный анализ субъядерных позиций для некоторых индуцибельных генов (INO1 (inositol 1-phosphate synthase gene), HXK1 (hexokinase isoenzyme 1 gene), GAL1, GAL2, HSP104 (heat-shock protein 104 gene)) посредством LacO/LacI tagging системы подтвердил, что они становятся стабильно позиционированы на периферии ядра, когда активированы. Более того, они остаются здесь после того, как ген выключается^{17,46,47,54-58}. Путем комбинирования данных о позиции с количественными PCR уровней мРНК, было показано, что максимальная экспрессия, по крафней мере, для некоторых локусов связана со стабильной ассоциацией с NPC^46,54,56. Однако, элементы, которые необходимы для транслокации, часто были ген-специфичными. Несмотря на это, некоторые принципы, направляющие позиционирование активных генов, налицо. Одним из четких принципов является то, что специфические последовательности промотора и активаторы являются критическими для предопределения, будет ли транскрипционная единица стабильно ассоциировать с ядерными порами. Важно, что GAL1 промотор, слитый с искусственным репортером, на эктопическах сайтах всё ещё может обеспечивать NPC релокализацию⁵⁸. Напротив, когда активировался HXK1 с помощью двух разных путей, только один (индукция низким уровнем глюкозы) приводил к локализации на NPC46. Т.о., промоторы являются избирательными и достаточными для связывания с NPC; рождающийся транскрипт сам по себе, по-видимому, недостаточен для ассоциации с порами. Galactose- и хит-шоками контролируемые промоторы обычно нуждаются в компонентах SAGA комплекса для стабильного позиционирования на ядерных порах^47,57,58, привлекая не только стержневые SAGA компоненты, подобные Ada2 (transcriptional adaptor 2), но и SAGA-ассоциированный фактор Sus1 (Ref. 47). Sus1 является уникальным в том, что совместно очищается с SAGA и Sac3–Thp1–Cdc31 комплексом, который является частью аппарата экспорта мРНК, который связан с NPC посредством Nup1 (Refs 59,60). Это может связывать промотор с аппаратом экспорта мРНК. Учитывая, что SAGA часто необходим для индукции чувствительных к стрессам генов, которые нуждаются в высоко динамичных рангах экспрессии, связанных с быстрым экспортом мРНК, стресс-индуцированные гены могут эксплуатировать ассоциацию с порами для достижения этих результатов. Являются ли промоторы достаточными для гарантии ассоциации с порами? Ответ, по-видимому, ген-специфичен. Для GAL2, upstream activation sequence (UAS) и промотор были достаточны для поддержания локализации на NPC⁵⁷, а релокализация на порах INO1 и GAL1 происходит независимо от элонгации⁵⁵. Это может отражать силу или контекст промотора, т.к. эктопические GAL1 UAS недостаточны для стабильной релокализации; специфические 3' UTR также необхъодимы⁵⁸. Сходным образом, субтеломерный HXK1 ген нуждается в своем собственном 3' UTR для стабильной ассоциации⁴⁶. Т.к. каждое исследование использует несколько отличающиеся репортеры в разных хроматновых условиях, то было предположено, что варьирующая потребность в 3' UTR отражает дифференциальную силу взаимодействий между связанными с промоторами факторами и NPC. Строгие взаимодействия промотор-пора могут избавлять от необходимости закрепления посредством 3' UTR-сцепленных факторов, но др. промоторы могут нуждаться в них. В подтверждение предположения, что мРНК и её процессинг важны для стабильного соединения с NPC, компонент экспортного комплекса Sac3 и его связка с порой Nup1 необходимы для релокализации GAL1 (Ref. 47). Sac3 взаимодействует с челночным экспортным фактором Mex67, который также затрагивает стбильное связывание с NPC GAL10 и HSP104 (Ref. 57). Mex67-зависимость может отражать белковую стабильность для связи ДНК или её ассоциацию с низко-уровневым, RNase-недоступным транскриптом, который д. рекрутировать Sac3 и THO комплекс, тетрамерный комплекс, состоящий из Hpr1, Tho2, Mtf1 и Thp2. Вместе эти комплексы мРНК-процессинга и мРНК-экспорта, по-видимому, связывабт транскрибируемый ген с компонентами NPC^47,61. Предполагается, что существуют разные типы взаимодействий NPC–ген; некоторые обеспечиваются с помощью Sus1–Sac3 с Nup1, а др. с помощью Mex67 с Mlp1 (Fig. 4). Третий путь, по-видимому, использует гистоновый H2A вариант H2A.Z, который вставляется на индуцируемые промоторы после активации⁵⁵. В этом случае удержание на NPC GAL1 и INO1 является Nup2-зависимым и требует инсерции H2A.Z. Наконец, субтеломерный ген HXK1 может эксплуатировать 4-й путь с участием Med8, компонентом промотор-связыающего медиатора, который взаимодействует с Nup116 (Ref. 46). В целом стабильная ассоциация дрожжевых генов с NPC, по-видимому, происходит в две ступени. Во-первых, факторы, связанные с промотором, включая SAGA и Sus1, обеспечивают временный контакт гена с белками пор, который для некоторых промоторов достаточен для релокализации. Во-вторых, факторы, которые рекрутируются для процессинга транскриптов могут стабилизировать ассоциацию и делать возможным образование небольших петель для одиночных генов^62,63 (Fig. 4). Соприкосновение промоторной и terminator областей приводит к петлеобразованию гена, что как плагают, облегчает реинициацию транскрипции и тем самым увеличивает эффективность транскрипции⁶³. Участие факторов процессинга транскриптов или контроля качества в прикреплениигена в дальнейшем было подтверждено тем фактом, что NPC-ассоциация активированного GAL1-репортера персистирует, по крайней мере, в течение 60 мин. после выключения промотора⁵⁸. Эта персистенция коррелирует с присутствием стабильной мРНК на поре. В самом деле персистенция факторов процессинга и экспорта зависит как от скорости транскрипционной элонгации, так и от сообщений о проверочных событиях считывания, которые предшествуют экспорту мРНК^64,65. Наконец, недавнее сообщение говорит о том, что удерживание гена после индукции и последующей репрессии нуждается в инсерции и распозновании H2A.Z⁵⁵. В этом случае связывание с NPC длится в течение 7 генераций после удаления индуцирующих условий. Изменяются ли в действительности уровни экспрессии в результате ассоциации с NPC? В двух случаях повышенные уровни транскриптов могут быть сцеплены со стабильным позиционированием гена на NPC^46,56; в случае др. генов, однако, влияние накопления транскриптов незначительно^47,57,58. Brickner and Walter показали, что активация S. cerevisiae INO1 происходит на ядерной мембране⁵⁶. В этом случае как активация промотора, так и релокализация нуждаются в Scs2, интегральном мембранном белке. При искусственном закреплении INO1 на периферии ядра транскрипционная активация происходит в отсутствие Scs2; в случае GAL1, искусственное прикрепление делает более быстрой реиндукцию после после наступающего периода репрессии^55,56. Во втором сообщении, нагруженный HXK1 локус сдвигался из теломерного кластера на ядерную пору после активации низкими уровнями glucose^16,46. Если связывание с порой предотвращалось путем наведения на цель вирусного трансактиватора на область, стоящую выше гена, то уровни накапливаемого HXK1 транскрипта были вдвое ниже⁴⁶. Наконец, возможно, что результаты по индукции INO1^55,56, HXK1 были обусловлены дважды более эффективным закреплением гена на ядерной оболочке, на этот раз посредством субдомена Esc1 (Ref. 46). Закрепление на ядерной оболочке, как полагают, способствет переносу на поры; следовательно, эти результаты показывают, что NPC-ассоциация может в самом деле помогать тонкой настройке уровней экспрессии. Напротив, при др. индуцибельных локусах, мутации. которые нарушают ассоциацию с порами не влияют существенно на уровни накопления мРНК^47,57,58. Эта вариация может отражать или хроматиновый контекст, в котором репортерный ген находится, или силу промотора. Сильные промоторы могут преодолевать репрессивный контекст хроматина, но, в случае более слабых промоторов, инсерция H2A.Z и связывание NPC могут быть необходимы для изоляции гена от фланкирующего хроматина^9,55. Known suspects at unexpected places Ассоциация ядерных пор с ремоделированием хроматина и активацией гена обнаруживается не только у дрожжей, но с помощью биохимиической ко-очистки у мух. Аналогично присутствию дрожжевого, связанного с порой компонента Sus1 как в SAGA, так и mRNA-export комплексах, NPC компоненты были восстановлены при очистках male-specific lethal (MSL) комплексов у D. melanogaster и человека6⁶. Этот комплекс участвует в двухкратной позитивной регуляции X-сцепленных генов у самцов мух (Fig. 5a,b). В дополнение к стержневому MSL комплексу (который содержит MSL1, MSL2, MSL3 и MOF (Males absent on first), affinity-purified комплекс, содержащий компоненты ядерных пор MTOR (Megator) и NUP153, и экзосомные компоненты DIS3 и RRP6. Хотя эти белки присутствуют в substoichiometric количествах, деплеция NPC белков MTOR и NUP153 отменяет обычный MSL паттерн окрашивания на Х хромосоме мышей и ставит под угрозу дозовую компенсацию субнабора X-сцепленных генов⁶⁶. Генетические и биохимические исследования показывают, что некоторые белки взаимодействуют с MSL белками^66-70, но пока только деплеция MTOR и NUP153 , как было установлено, вызывает достоверную редукцию в окрашивании MSL на хромосоме X⁶⁶. Т.к. MTOR рассматривается как функциональный ортолог дрожжевого Mlp1, совместная очистка MTOR с MSL обнаруживает параллелизм с Mex67–Mlp1 связью у дрожжей^17,57. Dosage compensation of the male X chromosome requires approximately twofold transcriptional activation of X-linked genes in comparison with the female X chromosome, a process that is mediated by the male-specific lethal (MSL) complex (reviewed in Refs 71–73). The X chromosome is immunostained red with an antibody against MOF (Males on absent first), NPC is immunostained green with an antibody against the nucleoporin Nup153, and DNA is stained blue with Hoechst322. A \| The nuclei of Schneider (SL-2) cells, when immunostained with antibodies against members of the MSL complex (in this case MOF (Males absent on first)), show a distinct X-chromosomal territory within the nucleus. Using confocal microscopy, parts of this X-chromosomal territory appear juxtaposed at or near to the nuclear periphery. Components of the nuclear pore complex (NPC) have been found to be associated with the MSL complex, and are required for dosage compensation of X-linked genes66. B \| Polytene chromosomes isolated from third instar larvae show a distinct binding pattern for the MSL complex on the male X chromosome, as detected by immunostaining with MOF antibody. The MSL complex is enriched on genes along the male X chromosome, with preference for the 3' end of genes74, 75, 76, 77. Image courtesy of J. Kind, European Molecular Biology Laboratory, Heidelberg, Germany. A speculative link between yeast and flies Что позволяет D. melanogaster MSL комплексу специфически распознавать X хромосому самца и вызывать двухкратную активацию транскрипции генов с дозовой компенсацией^71-73 (Fig. 5a,b). Хотя недавние глобальные подходы к профилированию хроматина^74-76 подталкивают, но основные вопросы остаются нерешенными. Анализ высокого разрешения ChIP–chip (chromatin immunoprecipitation with tiling arrays) выявляет преимущественное связывание MSL комплекса активными генами с обогащением в отношении 3' концов^74,75. Это 3' пристрастие напоминает ChIP-предопределенное распределение дрожжевого Mlp1, которое ассоциирует с индуцибельными генами и NPC⁵⁴. MSL связывание коррелирует с активными генами как у эмбрионов мух, так и в клеточных линиях эмбрионального происхождения^74-76. Учитывая совместную очистку MSL с MTOR⁶⁶, кажется возможным, что активные с MSL-связанные гены^78,79 рекрутируются на ядерные поры, даже если временно. Аналогично NPC-релокализации дрожжевой HXK1, которая нуждается в своём собственном 3' UTR и приводит в результате к двухкратному увеличению уровней мРНК⁴⁶, возможно, что ассоциация с NPC регулирует дозовую компенсацию у мух. Какой механизм регулирует соотв. уровень сообщений? Хотя соприкосновение с порами может облегчать экспорт мРНК, быстрые скорости диффузии мРНК в ядре говорят против субъядерного транспорта, как скорость-лимитирующего процесса⁵¹. Скорее всего, что транскрипционная элонгация является критической в контроле накопления мРНК^77-79. Путем купирования продукции мРНК с оборотом, накоплением message накопление может точно регулироваться. Снова, используя дрожжи в качестве примера было показано, что экзосомные компоненты Rrp6 и Dis3 (известен также как Rrp44) участвуют на разных ступенях созревания мРНК и сотрудничают с Mlp белками на др. существенных ступенях генной экспрессии^80,81. Недавняя работа связала Rrp6 с mRNA-export TREX комплексом^61,82,83, а экзосомные компоненты Rrp6 и Dis3 совместно очищались с элонгирующей формой RNA pol II⁸⁴. Т.к. Rrp6 субъединица участвует в контроле качества mRNP частиц на ранней ступени транскрипции^82,85,86, она может также вносить вклад в контроль элонгации. По аналогии с D. melanogaster MSL белки могут связывать мостикми экзосомы с MTOR, возможно регулируя скорость элонгации. Предполагается, что однажды индуцированная модуляция транскрипционной эффективности, возникшая на уровне элонгации, которая затем координируется с упаковкой, сканированием и процессингом мРНК⁶⁴. Следует отметить, что факторы, участвующие в этих процессах у дрожжей, в точности те. что участвуют во взимодействиях ген-NPC. Почему тонкая настройка элонгации д. происходить в ядерных порах? Ядерные поры дают убежище ряду энзимов ubiquitination и SUMOylation^26,27, которые могут играть интегральную роль в контроле элонгации⁸⁷. Т.о., позиционирование самого транскрипционного аппарата вблизи этих регуляторных энзимов может контролировать уровни мРНК. Кроме того, NPC вредоставляют удобный каркас для формирующих генные петли insulators, возможно обеспечивая, чтобы активные домены отделялись от соседней зоны репрессии^9,62,63,65. Создание активных и стабильно транскрибируемых генных петель может требовать, чтобы домен оставался в готовом для индукции состоянии, которое может быть достигнуто за счет комбинации связанных с порами insulator белков, гистоновых модификаций или гистоновых вариантов, таких как H2A.Z⁵⁵. Это может гарантировать, что MSL-регулируемые гены нуждаются только во временых контактах с NPC у ^{D. melanogaster}. У дрожжей имеются множественные пути для обеспечения ассоциаций с NPC, но однажды позиционированная инкорпорация H2A.Z или др. гистоновых модификаций мможет гарантировать, что скорость транскрипции будет поддерживаться на воспроизводимых уровнях в ходе митотических делений⁵⁵. Если ассоциации с ядерными порами могут тонко регулировать экспрессию генов, то соприкасающиеся с порами гены, д. на самом деле представлять собой наследуемый элемент эпигенетического контроля. Future Directions It remains to be seen how inner-membrane or pore-complex factors segregate heterochromatin from highly expressed genes, creating distinct zones at the nuclear envelope. Cross-talk between these zones and their mutual relationships to SUMOylating and ubiquitinylating enzymes, or even the proteasome, are still unclear. Not all transcription occurs at nuclear pores, and it is peculiar that stress-inducing conditions alone should favour localization of genes to the NPC. Above all, it remains to be seen whether nuclear pores or other internal structures fulfil a similar function in mammalian cells. Intriguingly, the mRNA and promoter sequences are not the only determinants for positioning, as different activation pathways can result in different subnuclear localizations for the same locus. This raises the potential for antagonism between activating mechanisms, and it will be exciting to discover how cells or organisms exploit this. Indeed, some genes, such as those in subtelomeric regions or on the X chromosome, could have evolved to use pore association as a mode of regulation. It is unknown whether there are specific pores for specific classes of genes, nor is it clear whether coordinately regulated genes are grouped at selected pores. Finally, given that NPC anchorage can be re-established after mitosis, we assume that positioning might be heritable through cell division. It is unknown which pore-bound components recognize H2A.Z or other histone modifications, and which marks maintain the association to ensure heritable patterns of expression. Just like for silent chromatin maintenance, we expect that there is a logic of heritable gene–NPC association that awaits deciphering.

Взгляд на электронную микрофотографию ядра клетки млекопитающих обнаруживает специальное взаимоотношение между ядерной оболочкой и хроматином. В дифференцированных ядрах плотно окрашенный, транскрипционно неактинвый 'гетерохроматин' обычно образует слой напротив внутренней поверхности ядерной мембраны. Эти участки гетерохроматина прерываются ядерными порами, которые содержат светло-окрашенную нуклеоплазму из 'открытых' или активных доменов (Fig. 1a,b). Сходным образом, у почкующихся дрожжей флюоресцентные маркеры для репрессивного хроматина иядерные поры могут быть леко различимы как самостоятельные не перекрывающиеся серии фокусов (Fig. 1c). Эвляется ли эта субъядерная компартментализация побочным эффектом дифференциальной упаковки хроматина, или позиционная информация действительно вносит вклад в регуляцию генов? Исследования на почкующихся дрожжах и Drosophila melanogaster подтверждают, что околоядерные компартменты влияют на различные ядерные активности от транскрипции и экспорта мРНК до репарации ДНК и стабильной передачи наследуемого состояния репрессии. Предполагается, что эквивалентные функциональные эффекты существуют и в системах млекопитающих.

Хорошо изученным примером функциональные окоядерных микроусловий является то, которое создается с помощью образования кластеров теломер на ядерной оболочке дрожжей¹. Эти фокусы секвестрируют факторы молчания, которые способствуют и стабилизируют гетерохроматин. Недавние данные подтвердили, что ассоциация активных, индуцированных генов с ядерными порами создает второй функциональный компартмент на периферии ядра. Гены могут перемещаться к порам зависимым от транскрипции способом и уровни экспресии могут снижаться, если эта релокализация нарушена. Исследования dosage compensation у мух также показало, что связанные с порами факторы могут помогать позитивной регуляции экспрессии генов у самцов.

Epigenetic specification of cell identity

Транскрипционная регуляция является критической для предопределения качественных особенностей клеток. Это не может быть достигнуто исключительно за счет организованного появления и исчезновения транскрипционных факторов, а в результате сложного взаимодействия сиквенс-специфических ДНК-связывающих факторов и эпигенетического статуса последовательностей мишеней, которое ограничивает фракцию генома, которя является предметом сиквенс-специфического регулятьорного контроля (rev. 2). В комбинации с пост-транскрипционными ступенями, которые регулируют эффективность процессинга мРНК, экспорт и трансляция, являются механизмами, которые ведут к воспроизводимым специфичным для типов клеток паттернам генной экспрессии.

Эукариотические геномы содержат три класса хроматина2, 3. Первый является открытым или активно транскрибируемым хроматином, который содержит гены с ангажированными РНК полимеразами. Второй является потенциально активным хроматином, который содержит промоторы, которые позиционированы, чтобы отвечать на активирующие сигналы, но с которых стабильные транскрипты редки или не существуют. Эти два состояния объясняют огромное большинство хроматина у дрожжей, но до сих пор представлены лишь небольшой фракцией в геноме млекопитающих. Третий тип хроматина представлен транскрипционно молчащих гетерохроматином, составляет большинство ДНК в дифференциированных соматических клетках. Здесь гены в основном репрессированы наследуемым способом и промоторы генов стремятся быть недоступными для транскрипционных факторов (rev. 3). Хотя существование эти х характерных хроматиновых доменов хорошо известно, факторы, которые создают и регулируют их охарактеризованы плохо. Один элемент, который вносит вклед как в становление, так и поддержание состояний хроматина, связан с их пространственным распределением внутри интерфазного ядра (rev. 1,4–7).

Insulator function and nuclear pores

Элементы некодирующих ДНК, называемые пограничными элементами, вносят вклад в хроматиновые домены двумя способами8. Во-первых, они защищают регионы открытого хроматина от посягательств репрессии, которая вызывается гетерохроматином. Во-вторых, они ограничивают взаимодействие энхансеров с промоторами. Оба события, как полагают, используют элементы ядерной организации или посредством формирования хроматиновых петель или путем привязки к топологически определенным доменам ядерных структур8, 9, 10, 11.

Важным аспектом разграничивающей функции является способность обеспечивать дально-действующие взаимодействия ДНК. Напр., D. melanogaster insulator элемент Fab-7 (также известный как Abd-B) , как было показано, физически ассоциирует со второй, случайно вставленной копией Fab-7 независимо от её позиции на хромосомном плече. Эта ассоциация в транс-положении нарушается с потерей белка Polycomb12, который также обладает изолирующей функцией. Др. элемент D. melanogaster gypsy insulator, который связывает фактор, наз. Suppressor of hairy wing (Su(Hw)), может обладать сходной функцией. Элемент gypsy сам по себе часто ассоциирует с ядерной периферией и если он оказывается вставленным в геном, то вызывает в окружающей ДНК сдвиг к месту инсерции Su(Hw)-зависимым способом11. Более того, подобно Polycomb-связывающим сайтам, два gypsy элемента, которые вставлены в удаленные сайты одной и той же или разных хромосом обнаруживают само-ассоциацию. Хотя околоядерное закрепление gypsy коррелирует с его разграничивающей функцией, Xu с коллегами позднее идентифицировали стержневой элемент в 340-bp, который поддерживает разграничивающую активность без закрепления ДНК на периферии ядра13. Этот минимальный стержневой элемент может связывать Su(Hw) и сохранять способность к взаимодействию в транс-положении13. Т.о., периферическое положение может быть побочным эффектом избирательных дально-действующих взаимодействий, которые генерируют петли хроматина, которые необходиы для insulator функции8.

Зависят ли др. инсуляторы от прикрепления к ядерным структурам? В клетках человека conserved sequence-specific factor, CTCF, участвует в функции широкого набора инсуляторов и, как было продемонстрировано, привязывает ассоциированный с инсулятором трансген с ядрышком14. Было предположено, что разграничивающая активность CTCF может быть необходима для этой локализации. Сходным образом скрининг почкующихся дрожжей, которые оценивались в отношении insulator активности в библиотеке целенаправленно слитых белков9 предоставил множество кандидатов, которые действуют как барьеры распространению гетерохроматина. Некоторые, по-видимому, действуют путем создания петель ДНК, которые соответствуют 'защищаемым' генам и привязывают их к Nup2 (nucleoporin 2), динамическому компоненту ядерных пор9. Сходные модели привязывания были предложены для транскрипционного фактора TFIIIC делящихся дрожжей, который блокирует распространение гетерохроматина очевидно путем прикрепления рядом с ядерной оболочкой10. Связывание фактора TFIIIC у почкующихся дрожжей с геном tRNA вблизи локуса silent mating type HMR также необходимо для пограничнрой функции15. В дальнейшем исследовании дрожжевые tRNAгены, как было установлено, доступны для расщепления с помощью Nup2–micrococcal-nuclease fusion16. Предполагая, что функциональный Nup2 связан с порами, эти результаты доказывают, что порой-обеспечиваемое прикрепление может блокировать распространение гетерохроматина у дрожжей. Остается протестировать, является ли TFIIIC или прикрепление к ядерной поре универсальным механизмом инсуляторной и пограничной функции.

The nuclear envelope harbours repressive zones

Telomeric silencing in yeast. Наблюдение, что закрепление на периферии ядра д. защищать промотор от репрессии, явилось сюрпризом, т.к. у всех организмов от дрожжей до человека, ядерная оболочка известна как приют репрессированных доменов (Fig. 2). Однако, было показано у почкующихся дрожжей, что места, которые закрепляют молчащий хроматин, механистически отличны от тех, что предназхначены для активных генов^17,18. Гетерохроматин дрожжей формирует субтеломерные домены и в основном состоит из недостаточно ацетилированных нуклеосом, которые связаны с комплексом молчащих информационных регуляторов, Sir2, Sir3 и Sir4 (rev. Ref. 19). Sir-связанный хроматин локализуется почти исключительно в фокусах на ядерной оболочке²⁰, расположенных между, но не совпадающими с ядерными порами^18,21,22 (Fig. 1c). Хотя гетерохроматин в клетках млекопитающих также обнаруживается на ядерной оболочке между порами, но механизмы закрепления отличны у дрожжей и многоклеточных эукариот^1,6.

У почкующихся дрожжей молчащие теломеры закреплены на местах, лишенных пор, с помощью двух частично перекрывающихся путей^18,23,24. Один из них четко коррелирует с репрессией и обеспечивается за счет связывания Sir4 с кислым, ассоциированным с мембраной белком, наз. Esc1 (enhancer of silent chromatin 1)^18,22. Взаимодействие Sir4–Esc1 необходимо и достаточно для закрепления молчащего хроматина на ядерной оболочке¹⁸, даже молчащего хроматина на эписоме²³. Иммуно-электронная микроскопия подтверждает, что Esc1 является периферическим, в основном исключенным из ядерных пор (Fig. 2). Было продемонстрировано, что это разделение, Esc1 и молчащих теломерных фокусов, сохраняется в виде распределения дикого типа в присутствии мутации nup133Delta, которая позволяет порам формировать кластеры на одной стороне ядра¹⁸ (Fig. 3). Второй путь закрепления теломер нуждается в консервативном гетеродимерном белке yKu^24,25. Этот фактор, связывающий концы ДНК, может закреплять хромосомы независимо от Sir-обусловленного молчания, возможно помогая теломерам формировать кластеры вместе прежде, чем будет достигнуто состояние молчания.

Др. факторы, включая компоненты ядерных пор, как полагают, влияют на закрепление и репрессию теломер. Эти эффекты, скорее всего, непрямые, отражают потерю собственно секвестрации или таргетинга ассоциированной с порами desumoylase Ulp1 (ubiquitin-like-specific protease 1) или SUMO conjugase, Mms21 (methylmethanesulfonate-sensitivity protein 21), которые модифицируют yKu^26,27. Непрямые эффекты на закрепление теломер могут быть также приписаны мутациям факторов structural maintenance of chromatin (SMC) или компонентам их предполагаемых загрузочных комплексов, таких как Ctf18 (chromosome transmission fidelity protein 18)²⁸. Мы ожидаем дополнительных пронизывающих мембрану белков, участвующих в закреплении yKu- и Esc1-связанных теломер, включая вообще-то и консервативные белки внутренней ядерной оболочки, такие как те, что содержат SUN или KASH домены¹.

Как подобная ядерная организация молчащего хроматина дрожжей вносит вклад в наследуемую репрессию? Важно, что факторы молчания (Sir2, Sir3 and Sir4) лимитируют концентрацию ещё где-либо в ядре за исключением теломер, где множественные сайты связывания белка, места секвестрирования факторов молчания от гистоновых хвостов из др. мест генома²⁹. Эта секвестрация факторов молчания благоприятствует распространению связывания Sir вдоль хроматина вблизи теломер и предупреждает смешанную репрессию не-субтеломерных генов²⁹. У мутантов, которые высвобождают теломеры и делают возможной дисперсию Sir-белка, наблюдается как потеря субтеломерной супрессии, так и избыток репрессии внутренних локусов, которые располагаются вблизи сайтов, которые nucleate связывание Sir. В соответствии с этим, Andrulis et al. показали, что искусственное закрепление хроматина на ядерной оболочке с помощью пронизывающих мембрану якорей, м. способствовать репрессии репортера до тех пор, пока он содержит Sir-nucleating сайты, называемые silencers³⁰. Хотя этот результат обычно неправильно интерпретируют, как указание, что закрепления на ядерной оболочке достаточно для обеспечения репрессии, что работа действительно предполагает, так это то, что расположение цис-действующих контрольных элементов (silencer) вблизи пулов Sir д. облегчать стабильную репрессию. Др. условия, которые усиливают слабую функцию замалчивания, способствуют молчанию, включая targeting Sir4-связывающего домена Esc1 на репортер²² или скоординированую избыточную экспрессию всех Sir генов²⁹. Итак, эти исследования говорят в пользу того, что критический элемент, который обеспечивается ядерной периферией, это доступ к ограниченнуому пулу репрессоров¹.

Nuclear lamina and gene repression. В клетоках высших эукариот ядерная ламина является слоем из белков промежуточных филамент в месте интерфейса между хроматином и внутренняй ядерной мембраной (Fig. 2b). Alpha-спиральные heptad повторы ламины формируют скрученные в двойную спираль димеры, которые ассоциируют head-to-tail в филаментах, которые соединяют пору с порой. Потеря lamin A, которая ведет к гибели на постнатальной неделе 8 у мышей, коррелирует с драматическими изменениями в размере и форме ядер кардиомиоцитов и, что важно, со смещением гетерохроматина с периферии ядра^31,32. Поразительно обилие множества типичных репрессивных гистоновых меток, триметилирование гистона H3 по лизину 9 (H3K9me3), также было редуцировано. Дефекты в гетерохроматине и H3K9me3 также возникали в клетках, несущих мутации far-more-minor lamin A, такие как маленькие С-терминальные делеции, при синдроме преждевременного старения Hutchinson–Gilford progeria^33-35. Наконец, у червей дефекты организации хроматина, которые вызываются деплецией lamin, воспроизводятся за счет элиминации двух или более ассоцированных с lamin белков, Man1 и emerin, которые участвуют с ядерными lamin-ассоциированными белками, чтобы прикрепить хроматин к ядерной периферии³⁶. Т.о., ядерная ламина участвует или непосредственно или опосредованно в собственно распределении и поддержании гетерохроматина.

Обилие и стабильность lamin белков предоставляют способ идентификации ДНК, которая ассоциирует с ядерной оболочкой на геномной шкале. Чтобы локализовать lamin-ассоциированные последовательности, Pickersgill et al. приспособили in vivo технику модификации ДНК, наз. DamID для D. melanogaster и увязали её с профилированием микромассивов³⁷. Этот метод использует слияние Escherichia coli DNA adenine methyltransferase (Dam) с геном lamin, который экспресируется на низком уровне в клетках культуры ткани D. melanogaster³⁷. Области генома мухи, которые были бок-о-бок с lamins, были преимущественно метилированы путем слияния белков, они могут быть изолированы, мечены и использованы для зонда к микромассивам всего генома. Приблизительно было обнаружено 500 генов, которые, по крайней мере, временно ассоциировали с lamin; большая масса из них была истощена в активных гистоновых модификациях, и были транскрипционно молчащими и обнаруживали кинетику поздней репликации³⁷. Они располагались вдоль всех хромосмных плеч, но не включали конституитивный центромерный гетерохроматин. Хотя невозможно определить с помощью DamID, связывают ли lamin-связывающие сайты временно или стабильно, но существует достоверное перекрывание этих локусов с местами, которые были предсказаны как стабильно связанные с ядерной оболочкой с помощью микроскопии высокого разрешения³⁸.

Nuclear space and chromatin mobility

Если субъядерное расположение любого определенного хромосомного локуса отражает его состояние транскрипционной активности, то хроматин д. быть способным перемещаться, чтобы достигать тканеспецифической и стадиоспецифической организации. Как жк движется хроматин?

Используя time-lapse воспроизведние изображений GFP-нагруженных хромосомных локусов в лаб. Sedat наблюдали, что хроматин дрожжей и мух занят постоянными случайными блужданиями³⁹. Однако, эти инициальные исследования на дрожжах, проведенные на локусах, проксимальных к центромере, которые были прикреплены к пронизывающим ядерную оболочку spindle pole body (SPB) посредством коротких интерфазных микротрубочек, ограничивали движения хроматина^39-43. До некоторой степени менее принудительные случайные движения позднее были описаны во множестве для других локусов дрожжей путем связывания LacO-нагруженных генов с GFP–nuclear-pore маркером^40,42, модификации, которая делает возможным соотв. анализ подвижности и позиции относительно ядерной оболочки.

У почкующихся дрожжей наиболее активные хромосомные локусы перемещаются с радиусом в 0.5–0.7 μm при случайном перемещении в нуклеоплазме^23,40,44. Это соответствует более чем 1/4 ядерного диаметра у дрожжей, но менее 1/10 ядерного диаметра в клетках млекопитающих. Т.к. 50% ядерного объема дрожжей находится внутри периферической оболочки, которая приблизительно толщиной 0.4 μm, то большинство дрожжевых генов, по-видимому, случайно сталкиваются с ядерной мембраной. С др. стороны, молчащие теломеры перемещаются в виде очень принудительных движений вдоль внутренней стороны ядерной оболочки и лишь редко занимают сердцевину ядра^23,24,40,44. Всё же движение типичных теломер ограничены приблизительно 12% поверхности внутренней ядерной оболочки⁴⁵. Сходное ограничение наблюдается для субнабора активных генов, особенно galactose-индуцированных локусов, которые ассоциируют с ядерными порами после индукции^46,47. Учитывая их латеральную динамику и поразительную радиальную локализацию, было предположено, что эти активные гены движутся от поры к поре⁴⁷.

Путем мониторинга динамики флюоресцентно меченных SPB, внедренных в ядерную оболочку дрожжей⁴⁰, оказалось возможным продемонстрировать, что движение хроматина не возникает в результате ротаций ядра: перемещения SPB были более четко ограничены, чем движения хроматина (rc = 0.2 μm). Более того, photobleaching области пор, меченных Nup49–GFP, показало, что латеральные перемещения unbleached пор были более медленными, чем таковые хроматина, с восстановлением, требущим минут скорее, чем секунд^46,48.

Что удерживает хроматин на ядерной оболочке? Значение межбелковых взаимодействий для ограничения динамики хроматина было продемонстрировано путем отслеживания колец, флюоресцентно нагруженных дрожжевым хроматином, которые вырезались из генома с помощью индуцибельных рекомбинационных событий²³. В то время как не-молчащие локусы на вырезанных кольцах пересекали дрожжевое ядро в быстром прыжке, кольца репрессированного хроматина фиксировались на ядерном периметре²³. Это ограничение было обусловлено сродством Sir белков к Esc1, т.к. если этот ассоциированный с мембраной якорь был нарушен, то вырезанный хроматин перемещался свободно как активный локус, хотя он оставался репрессированным²³. Т.о., первичное ограничение подвижности обусловливается не структурой хроматина, а белком обусловленными связывающими сайтами на ядерной оболочке, которые ограничивают перемещения ДНК в субядерной зоне⁴⁹. Сходные ограничения наблюдались для lamin-связанных сайтов в культивируемых клетках млекопитающих⁵⁰. Не-кодирующие РНК также могут выполнять роль в закреплении гетерохроматина у некоторыха видов. Эти исследования демонстрируют важный принцип, что ядерные макромолекулы, включая хроматин, высоко мобильны несмотря на прикрепление (Box 1). Это подтверждается одинаково быстрой кинетикой диффузии ядерных белков и частиц мРНК у высших эукариот^51,52.

Дальнейшее по всему геному ChIP исследование с использованием у почкующихся дрожжей феромона спаривания alpha-фактора для индукции изменений в генной экспрессии, картировало ассоциацию генов с компонентами пор Xpo1, Nup116, Mlp1 и Mlp2 (Ref. 54). Большинство alpha-фактором индуцированных генов имело, по крайней мере, временную ассоциацию с ядерной периферией в ответ на активацию. Т.к. эти гены были распределены на 13 из 16 дрожжевых хромосом, то глобальные изменения организации хроматина, как было предположено, происходят в ответ на феромон⁵⁴. Интересно, что ассоциированная с порами мРНК экспортирующего фактора Mlp1 восстанавливалась с индуцированными генами чувствительным к RNase способом, а картирование высокого разрешения помещает Mlp1 преимущественно на 3' конце активных генов, указывая тем самым, что накопление транкриптов может быть важным для околоядерного закрепления. Менее ясно, почему Mlp1 или Mlp2 восстанавливались также с молчащими локусами, т.к. генетические исследования говорят против какой-либо непосредственной роли Mlp белков в закреплении теломер^18,22,24,25. Возможным объяснением явлется то, что когда формирующие сеть белки анализировались с помощью ChIP, то их ассоциация с ДНК, по-видимому, частично обусловлена непрямыми взаимодействиями, которые стабилизируются с помощью поперечных связей с formaldehyde. Следовательно, важно увязать ChIP с генетическими подходами и количественной микоскопией на больших популяциях клеток.

Альтеранативый подход на уровне всего генома это картирование позиции генов, связанных с регулируемым расщеплением ДНК с помощью micrococcal nuclease (MN). Это исследование показало, что ранние ступени инициации, но не сами мРНК, связывают гены с ядерными порами. Авт. отслеживали паттерн взамиодействий динамичного белка пор Nup2, слитого с MN¹⁶. Nup2–MN-зависимое расщепление было выявлено в промоторах генов, индуцируемых galactose, это явно подтвеждает результаты ChIP. Но, когда задействована целая хромосома 6, то Nup2–MN расщепления обнаруживаются в промоторах большинства дивергентно транскрибируемых генов RNA polymerase II (RNA pol II) и в tRNA кластерах, независимо от высоких уровней транскрипции. Тем не менее доступность увеличивается, когда гены индуцируются¹⁶. На galactose-индуцированных промоторах транскрипционный фактор Gal4 и TATA-связывающий фактор усиливают Nup2–MN расщепление, в то время как компоненты SAGA histone acetyltransferase комплекса был и не нужны, указывая тем самым, что ранние ступени инициации увеличивают доступность для Nup2–MN¹⁶. Предполагается, что временный контакт с ядерными порами может быть предварительным условием для активации RNA pol II.

Эти геномные подходы выявляют в чем-то потиворечивый сценарий: хотя они показывают, что индукция генов и поперечное связывание NPCкоррелируют, они неспособны установить функциональную зависимостсь транскрипции от позиционирования. Или отобранные промоторные факторы, способные закреплять гены, или транскрипты и транспортные факторы необходимы для поставки индуцируемых генов на ядерные поры? Одним из ограничений подходов геномного профилирования является то, что они имеют тенденцию отлавливать быстрые или одноударные события, учитывая количественно как стабильные, так и временные взаимодействия с одинаковой эффективностью. По этой причине неясно, исходя из Nup2–MN или ChIP, насколькостабильными может быть оценки взаимодействий. Наконец, эти результаты согласуются с наблюдением, что многие, если не большинство, транскрибируемые гены у дрожжей и млекопитающих не ассоциируют стабильно с порами. Это подтверждается изучением непосредственных картин активных^{локусов как в живых дрожжах²³, так и клетках млекопитающих51}. Чтобы расшифровать функциональное значение связи NPC–ген, необходим количественный анализ положения гена, скоррелированного с количественной оценкой уровня транскриптов в соотв. клетках.

Yeast nuclear pores as active zones

Количественный анализ субъядерных позиций для некоторых индуцибельных генов (INO1 (inositol 1-phosphate synthase gene), HXK1 (hexokinase isoenzyme 1 gene), GAL1, GAL2, HSP104 (heat-shock protein 104 gene)) посредством LacO/LacI tagging системы подтвердил, что они становятся стабильно позиционированы на периферии ядра, когда активированы. Более того, они остаются здесь после того, как ген выключается^{17,46,47,54-58}. Путем комбинирования данных о позиции с количественными PCR уровней мРНК, было показано, что максимальная экспрессия, по крафней мере, для некоторых локусов связана со стабильной ассоциацией с NPC^46,54,56. Однако, элементы, которые необходимы для транслокации, часто были ген-специфичными. Несмотря на это, некоторые принципы, направляющие позиционирование активных генов, налицо.

Одним из четких принципов является то, что специфические последовательности промотора и активаторы являются критическими для предопределения, будет ли транскрипционная единица стабильно ассоциировать с ядерными порами. Важно, что GAL1 промотор, слитый с искусственным репортером, на эктопическах сайтах всё ещё может обеспечивать NPC релокализацию⁵⁸. Напротив, когда активировался HXK1 с помощью двух разных путей, только один (индукция низким уровнем глюкозы) приводил к локализации на NPC46. Т.о., промоторы являются избирательными и достаточными для связывания с NPC; рождающийся транскрипт сам по себе, по-видимому, недостаточен для ассоциации с порами. Galactose- и хит-шоками контролируемые промоторы обычно нуждаются в компонентах SAGA комплекса для стабильного позиционирования на ядерных порах^47,57,58, привлекая не только стержневые SAGA компоненты, подобные Ada2 (transcriptional adaptor 2), но и SAGA-ассоциированный фактор Sus1 (Ref. 47). Sus1 является уникальным в том, что совместно очищается с SAGA и Sac3–Thp1–Cdc31 комплексом, который является частью аппарата экспорта мРНК, который связан с NPC посредством Nup1 (Refs 59,60). Это может связывать промотор с аппаратом экспорта мРНК. Учитывая, что SAGA часто необходим для индукции чувствительных к стрессам генов, которые нуждаются в высоко динамичных рангах экспрессии, связанных с быстрым экспортом мРНК, стресс-индуцированные гены могут эксплуатировать ассоциацию с порами для достижения этих результатов.

Являются ли промоторы достаточными для гарантии ассоциации с порами? Ответ, по-видимому, ген-специфичен. Для GAL2, upstream activation sequence (UAS) и промотор были достаточны для поддержания локализации на NPC⁵⁷, а релокализация на порах INO1 и GAL1 происходит независимо от элонгации⁵⁵. Это может отражать силу или контекст промотора, т.к. эктопические GAL1 UAS недостаточны для стабильной релокализации; специфические 3' UTR также необхъодимы⁵⁸. Сходным образом, субтеломерный HXK1 ген нуждается в своем собственном 3' UTR для стабильной ассоциации⁴⁶. Т.к. каждое исследование использует несколько отличающиеся репортеры в разных хроматновых условиях, то было предположено, что варьирующая потребность в 3' UTR отражает дифференциальную силу взаимодействий между связанными с промоторами факторами и NPC. Строгие взаимодействия промотор-пора могут избавлять от необходимости закрепления посредством 3' UTR-сцепленных факторов, но др. промоторы могут нуждаться в них.

В подтверждение предположения, что мРНК и её процессинг важны для стабильного соединения с NPC, компонент экспортного комплекса Sac3 и его связка с порой Nup1 необходимы для релокализации GAL1 (Ref. 47). Sac3 взаимодействует с челночным экспортным фактором Mex67, который также затрагивает стбильное связывание с NPC GAL10 и HSP104 (Ref. 57). Mex67-зависимость может отражать белковую стабильность для связи ДНК или её ассоциацию с низко-уровневым, RNase-недоступным транскриптом, который д. рекрутировать Sac3 и THO комплекс, тетрамерный комплекс, состоящий из Hpr1, Tho2, Mtf1 и Thp2. Вместе эти комплексы мРНК-процессинга и мРНК-экспорта, по-видимому, связывабт транскрибируемый ген с компонентами NPC^47,61. Предполагается, что существуют разные типы взаимодействий NPC–ген; некоторые обеспечиваются с помощью Sus1–Sac3 с Nup1, а др. с помощью Mex67 с Mlp1 (Fig. 4). Третий путь, по-видимому, использует гистоновый H2A вариант H2A.Z, который вставляется на индуцируемые промоторы после активации⁵⁵. В этом случае удержание на NPC GAL1 и INO1 является Nup2-зависимым и требует инсерции H2A.Z. Наконец, субтеломерный ген HXK1 может эксплуатировать 4-й путь с участием Med8, компонентом промотор-связыающего медиатора, который взаимодействует с Nup116 (Ref. 46).

В целом стабильная ассоциация дрожжевых генов с NPC, по-видимому, происходит в две ступени. Во-первых, факторы, связанные с промотором, включая SAGA и Sus1, обеспечивают временный контакт гена с белками пор, который для некоторых промоторов достаточен для релокализации. Во-вторых, факторы, которые рекрутируются для процессинга транскриптов могут стабилизировать ассоциацию и делать возможным образование небольших петель для одиночных генов^62,63 (Fig. 4). Соприкосновение промоторной и terminator областей приводит к петлеобразованию гена, что как плагают, облегчает реинициацию транскрипции и тем самым увеличивает эффективность транскрипции⁶³. Участие факторов процессинга транскриптов или контроля качества в прикреплениигена в дальнейшем было подтверждено тем фактом, что NPC-ассоциация активированного GAL1-репортера персистирует, по крайней мере, в течение 60 мин. после выключения промотора⁵⁸. Эта персистенция коррелирует с присутствием стабильной мРНК на поре. В самом деле персистенция факторов процессинга и экспорта зависит как от скорости транскрипционной элонгации, так и от сообщений о проверочных событиях считывания, которые предшествуют экспорту мРНК^64,65. Наконец, недавнее сообщение говорит о том, что удерживание гена после индукции и последующей репрессии нуждается в инсерции и распозновании H2A.Z⁵⁵. В этом случае связывание с NPC длится в течение 7 генераций после удаления индуцирующих условий.

Изменяются ли в действительности уровни экспрессии в результате ассоциации с NPC? В двух случаях повышенные уровни транскриптов могут быть сцеплены со стабильным позиционированием гена на NPC^46,56; в случае др. генов, однако, влияние накопления транскриптов незначительно^47,57,58. Brickner and Walter показали, что активация S. cerevisiae INO1 происходит на ядерной мембране⁵⁶. В этом случае как активация промотора, так и релокализация нуждаются в Scs2, интегральном мембранном белке. При искусственном закреплении INO1 на периферии ядра транскрипционная активация происходит в отсутствие Scs2; в случае GAL1, искусственное прикрепление делает более быстрой реиндукцию после после наступающего периода репрессии^55,56. Во втором сообщении, нагруженный HXK1 локус сдвигался из теломерного кластера на ядерную пору после активации низкими уровнями glucose^16,46. Если связывание с порой предотвращалось путем наведения на цель вирусного трансактиватора на область, стоящую выше гена, то уровни накапливаемого HXK1 транскрипта были вдвое ниже⁴⁶. Наконец, возможно, что результаты по индукции INO1^55,56, HXK1 были обусловлены дважды более эффективным закреплением гена на ядерной оболочке, на этот раз посредством субдомена Esc1 (Ref. 46). Закрепление на ядерной оболочке, как полагают, способствет переносу на поры; следовательно, эти результаты показывают, что NPC-ассоциация может в самом деле помогать тонкой настройке уровней экспрессии.

Напротив, при др. индуцибельных локусах, мутации. которые нарушают ассоциацию с порами не влияют существенно на уровни накопления мРНК^47,57,58. Эта вариация может отражать или хроматиновый контекст, в котором репортерный ген находится, или силу промотора. Сильные промоторы могут преодолевать репрессивный контекст хроматина, но, в случае более слабых промоторов, инсерция H2A.Z и связывание NPC могут быть необходимы для изоляции гена от фланкирующего хроматина^9,55.

Known suspects at unexpected places

Ассоциация ядерных пор с ремоделированием хроматина и активацией гена обнаруживается не только у дрожжей, но с помощью биохимиической ко-очистки у мух. Аналогично присутствию дрожжевого, связанного с порой компонента Sus1 как в SAGA, так и mRNA-export комплексах, NPC компоненты были восстановлены при очистках male-specific lethal (MSL) комплексов у D. melanogaster и человека6⁶. Этот комплекс участвует в двухкратной позитивной регуляции X-сцепленных генов у самцов мух (Fig. 5a,b). В дополнение к стержневому MSL комплексу (который содержит MSL1, MSL2, MSL3 и MOF (Males absent on first), affinity-purified комплекс, содержащий компоненты ядерных пор MTOR (Megator) и NUP153, и экзосомные компоненты DIS3 и RRP6. Хотя эти белки присутствуют в substoichiometric количествах, деплеция NPC белков MTOR и NUP153 отменяет обычный MSL паттерн окрашивания на Х хромосоме мышей и ставит под угрозу дозовую компенсацию субнабора X-сцепленных генов⁶⁶. Генетические и биохимические исследования показывают, что некоторые белки взаимодействуют с MSL белками^66-70, но пока только деплеция MTOR и NUP153 , как было установлено, вызывает достоверную редукцию в окрашивании MSL на хромосоме X⁶⁶. Т.к. MTOR рассматривается как функциональный ортолог дрожжевого Mlp1, совместная очистка MTOR с MSL обнаруживает параллелизм с Mex67–Mlp1 связью у дрожжей^17,57.

Dosage compensation of the male X chromosome requires approximately twofold transcriptional activation of X-linked genes in comparison with the female X chromosome, a process that is mediated by the male-specific lethal (MSL) complex (reviewed in Refs 71–73). The X chromosome is immunostained red with an antibody against MOF (Males on absent first), NPC is immunostained green with an antibody against the nucleoporin Nup153, and DNA is stained blue with Hoechst322. A | The nuclei of Schneider (SL-2) cells, when immunostained with antibodies against members of the MSL complex (in this case MOF (Males absent on first)), show a distinct X-chromosomal territory within the nucleus. Using confocal microscopy, parts of this X-chromosomal territory appear juxtaposed at or near to the nuclear periphery. Components of the nuclear pore complex (NPC) have been found to be associated with the MSL complex, and are required for dosage compensation of X-linked genes66. B | Polytene chromosomes isolated from third instar larvae show a distinct binding pattern for the MSL complex on the male X chromosome, as detected by immunostaining with MOF antibody. The MSL complex is enriched on genes along the male X chromosome, with preference for the 3' end of genes74, 75, 76, 77. Image courtesy of J. Kind, European Molecular Biology Laboratory, Heidelberg, Germany.

A speculative link between yeast and flies

Что позволяет D. melanogaster MSL комплексу специфически распознавать X хромосому самца и вызывать двухкратную активацию транскрипции генов с дозовой компенсацией^71-73 (Fig. 5a,b). Хотя недавние глобальные подходы к профилированию хроматина^74-76 подталкивают, но основные вопросы остаются нерешенными. Анализ высокого разрешения ChIP–chip (chromatin immunoprecipitation with tiling arrays) выявляет преимущественное связывание MSL комплекса активными генами с обогащением в отношении 3' концов^74,75. Это 3' пристрастие напоминает ChIP-предопределенное распределение дрожжевого Mlp1, которое ассоциирует с индуцибельными генами и NPC⁵⁴. MSL связывание коррелирует с активными генами как у эмбрионов мух, так и в клеточных линиях эмбрионального происхождения^74-76. Учитывая совместную очистку MSL с MTOR⁶⁶, кажется возможным, что активные с MSL-связанные гены^78,79 рекрутируются на ядерные поры, даже если временно. Аналогично NPC-релокализации дрожжевой HXK1, которая нуждается в своём собственном 3' UTR и приводит в результате к двухкратному увеличению уровней мРНК⁴⁶, возможно, что ассоциация с NPC регулирует дозовую компенсацию у мух.

Какой механизм регулирует соотв. уровень сообщений? Хотя соприкосновение с порами может облегчать экспорт мРНК, быстрые скорости диффузии мРНК в ядре говорят против субъядерного транспорта, как скорость-лимитирующего процесса⁵¹. Скорее всего, что транскрипционная элонгация является критической в контроле накопления мРНК^77-79. Путем купирования продукции мРНК с оборотом, накоплением message накопление может точно регулироваться. Снова, используя дрожжи в качестве примера было показано, что экзосомные компоненты Rrp6 и Dis3 (известен также как Rrp44) участвуют на разных ступенях созревания мРНК и сотрудничают с Mlp белками на др. существенных ступенях генной экспрессии^80,81. Недавняя работа связала Rrp6 с mRNA-export TREX комплексом^61,82,83, а экзосомные компоненты Rrp6 и Dis3 совместно очищались с элонгирующей формой RNA pol II⁸⁴. Т.к. Rrp6 субъединица участвует в контроле качества mRNP частиц на ранней ступени транскрипции^82,85,86, она может также вносить вклад в контроль элонгации. По аналогии с D. melanogaster MSL белки могут связывать мостикми экзосомы с MTOR, возможно регулируя скорость элонгации. Предполагается, что однажды индуцированная модуляция транскрипционной эффективности, возникшая на уровне элонгации, которая затем координируется с упаковкой, сканированием и процессингом мРНК⁶⁴. Следует отметить, что факторы, участвующие в этих процессах у дрожжей, в точности те. что участвуют во взимодействиях ген-NPC.

Почему тонкая настройка элонгации д. происходить в ядерных порах? Ядерные поры дают убежище ряду энзимов ubiquitination и SUMOylation^26,27, которые могут играть интегральную роль в контроле элонгации⁸⁷. Т.о., позиционирование самого транскрипционного аппарата вблизи этих регуляторных энзимов может контролировать уровни мРНК. Кроме того, NPC вредоставляют удобный каркас для формирующих генные петли insulators, возможно обеспечивая, чтобы активные домены отделялись от соседней зоны репрессии^9,62,63,65. Создание активных и стабильно транскрибируемых генных петель может требовать, чтобы домен оставался в готовом для индукции состоянии, которое может быть достигнуто за счет комбинации связанных с порами insulator белков, гистоновых модификаций или гистоновых вариантов, таких как H2A.Z⁵⁵. Это может гарантировать, что MSL-регулируемые гены нуждаются только во временых контактах с NPC у ^{D. melanogaster}. У дрожжей имеются множественные пути для обеспечения ассоциаций с NPC, но однажды позиционированная инкорпорация H2A.Z или др. гистоновых модификаций мможет гарантировать, что скорость транскрипции будет поддерживаться на воспроизводимых уровнях в ходе митотических делений⁵⁵. Если ассоциации с ядерными порами могут тонко регулировать экспрессию генов, то соприкасающиеся с порами гены, д. на самом деле представлять собой наследуемый элемент эпигенетического контроля.

Future Directions

It remains to be seen how inner-membrane or pore-complex factors segregate heterochromatin from highly expressed genes, creating distinct zones at the nuclear envelope. Cross-talk between these zones and their mutual relationships to SUMOylating and ubiquitinylating enzymes, or even the proteasome, are still unclear. Not all transcription occurs at nuclear pores, and it is peculiar that stress-inducing conditions alone should favour localization of genes to the NPC. Above all, it remains to be seen whether nuclear pores or other internal structures fulfil a similar function in mammalian cells.

Intriguingly, the mRNA and promoter sequences are not the only determinants for positioning, as different activation pathways can result in different subnuclear localizations for the same locus. This raises the potential for antagonism between activating mechanisms, and it will be exciting to discover how cells or organisms exploit this. Indeed, some genes, such as those in subtelomeric regions or on the X chromosome, could have evolved to use pore association as a mode of regulation. It is unknown whether there are specific pores for specific classes of genes, nor is it clear whether coordinately regulated genes are grouped at selected pores. Finally, given that NPC anchorage can be re-established after mitosis, we assume that positioning might be heritable through cell division. It is unknown which pore-bound components recognize H2A.Z or other histone modifications, and which marks maintain the association to ensure heritable patterns of expression. Just like for silent chromatin maintenance, we expect that there is a logic of heritable gene–NPC association that awaits deciphering.

The nuclear envelope and transcriptional controlAsifa Akhtar & Susan M. GasserNature Reviews Genetics 8,No.7, 507-517 (July 2007) | doi:10.1038/nrg2122

FURTHER INFORMATION

DATABASES

Entrez-Gene

UniProtKB

The nuclear envelope and transcriptional control
Asifa Akhtar & Susan M. Gasser
Nature Reviews Genetics 8,No.7, 507-517 (July 2007) | doi:10.1038/nrg2122