Рис.1.  |  Structure and receptors of netrins.


Рис.2.  |  Possible model for the convergence of netrin–DCC and netrin–integrin signalling


Рис.3.  |  Netrin-1 as a survival cue .


Рис.4.  |  Pancreas morphogenesis .


Рис.5.  |  Lung morphogenesis


Рис.6.  |  Mammary-gland morphogenesis .


Рис.7.  |  Netrin-1 as a chemorepellent and chemoattractant in angiogenesis.

Табл.1 Effectors of netrin-1-activated signalling

Внеклеточный матрикс (ECM) содержит множество белков, обеспечивающих информационные сигналы для некоторых клеточных функций, включая клеточную адгезию, миграцию, пролиферацию, дифференцировку и выживаемость. Среди способных к диффузии молекул наиболее изученными являются нетрины из-за их участия в управлении ростом аксонов во время развития. Их название происходит от слова netr/ что озанчает «тот кто управляет». Первым из семейства нетринов был идентифицирован UNC-6 у Caenorhabditis elegans. Позже были описаны netrin-A и netrin-B у Drosophila melanogaster. У позвоночных 3 нетрина (netrin-1–3) структурно родственные γ-цепи ламининов впервые были идентифицированы в 1990-х годах (РИС.1а). Менее родственный нетрин, найденный у мышей и человека, получил название β- netrin (или netrin -4) в соответствии с его гомологией с β-цепью ламинина (РИС.1а). Недавно у мышей, обезьян и человека был открыт новый подкласс нетринов – netrin-G1 и netrin-G2, имеющих 6 молекулярных вариантов, которые предположительно возникают в результате альтернативного сплайсинга (РИС.1а).

Кроме «управляющей» роли при росте аксонов, нетрины участвуют в миграции клеточных телец. Netrin-1 вызывает миграцию luteinizing hormonereleasing hormone (LHRH) клеток, клеток, являющихся производными нервного гребня и предшественников обонятельных интернейронов во время развития энтеральной нервной системы. Эти находки дали возможность продолжить исследования роли нетринов не только в развитии центральной нервной системы, но и других систем организма. В ряде работ было показано, что нетрины и/или их рецепторы экспрессируются в некоторых не невральных тканях во время развития, что свидетельствует об их участии в морфогенетических процессах многих органов. К примеру, было показано, что netrin-1 экспрессируется в эпителии уха и способствует формированию полукружного канала внутреннего уха. Netrin-1 экспрессируется в развивающейся поджелудочной железе, легких и грудных железах. Он также регулирует клеточную адгезию, миграцию, выживаемость, дифференцировку и разветвленную программу онтогенеза (т.наз. «морфогенез ветвления» - branching morphogenesis) (см. морфогенез ветвления ). Недавние исследования показали, что определенные нетрины могут функционировать как ориентиры для эндотелиальных клеток во время ангиогенеза, как хемореппеленты для лейкоцитов и как регуляторы формирования микротрубочек. Следует также заметить, что паттерн экспрессии netrin-1 не всегда коррелирует с экспрессией классических рецепторов netrin-1, что свидетельствует о существовании альтернативных механизмов распознавания нетрина.

В данном обзоре представлен анализ работ, в которых рассматриваются функции нетринов безотносительно к нервной системе. Основная цель авторов - обсуждение новых работ, касающихся экспрессии и функций нетринов в разных тканях.

Structure and receptors of netrins

Нетрины - это семейство высококонсервативных секреторных белков структурно родственных ламининам (РИС.1а), они являются структурными компонентами базальных мембран тканей. N-терминальные домены нетринов содержат области, высоко гомогенные доменам V и VI ламининов. Как и у ламинина, домен V нетринов содержит три epidermal growth factor (EGF)-подобных повтора с таким же характерным числом и интервалом Cys остатков. Однако С-терминальные домены нетринов не гомологичны таковым ламининов и содержат несколько повторов основных остатков (BXBB, BXB, в которых B представляет основной остаток). Организация этих остатков напоминает организацию некоторых ECM компонентов. В отличие от классических нетринов, вновь идентифицированные netrin-G1 и netrin-G2 характеризуются glycosylphosphatidylinositol (GPI) сцеплением с клетками (РИС.1а) и отсутствием определяемой аффинности для известных рецепторов классических нетринов. Было высказано предположение, что netrin-G1 и netrin-G2 эволюционировали независимо от других нетринов, возможно для опосредования различных короткодействующих межклеточных сигнальных функций.

Функции нетринов, связанные с управления аксонами, осуществляются с помощью двух семейств рецепторов: UNC5 семейством (UNC5A–D у человека и UNC5H1–4 грызунов) и семейством neogenin. Оба являются близкородственными членами суперсемейства иммуноглобулина (РИС.1b). У C. elegans обнаружены гены unc-5 и unc-40, которые функционируют вместе с unc-5. контролируя т.о. управление ростом аксонов. У позвоночных были идентифицированы UNC5 белки вместе с гомологами UNC-40, DCC (deleted in colorectal cancer или deleted colorectal carcinoma) и neogenin. Кроме того, предполагают, что связанный с мембраной аденозиновый A2b рецептор функционирует как кандидатный netrin-1 рецептор, но его участие в распознавании netrin-1 и сигнализировании остается пока неясным. Предполагают также, что DCC и члены UNC5 семейства функционируют как и гены опухолевых супрессоров, поскольку участвуют в регуляции клеточной выживаемости. В 2003 году было показано, что интегрины α6β4 и α3β1 функционируют как netrin-1 рецепторы в эпителии и опосредуют клеточную адгезию и миграцию на netrin-1субстрате.

Signalling cascades that are activated by netrins

Внутриклеточные сигнальные пути, которые активируются рецепторами нетринов, достаточно хорошо изучены (см обзор: Barallobre M. J., Pascual M., Del Rio J. A. & Soriano E. The netrin family of guidance factors: emphasis on netrin-1 signalling. Brain Res. Brain Res. Rev. 49, 22–47. 2005). В следующем разделе авторы суммировали наиболее значимые факты в этой области исследований.

Activation of small GTPases

Известно, что при сигнализировании такого рода рецептор активирования ведет к перестройке актинового цитоскелета при подготовке перемещения клеток. Были идентифицированы многочисленные внутриклеточные эффекторы netrin-1-опосредованного сигнализирования. Например, netrin-1, связывающийся со своим рецептором, инициирует аттрактивные или репульсивные действия во время управления ростом аксонов или миграции нейронов. Эти netrin-опосредованные действия регулируются GTPases Rac или Rho белковыми семействами (ТАБЛ.1). Ингибирование Rho усиливает разрастание аксонов, но препятствует миграции предмозжечковых ядрышек нейронов в направлении к источнику netrin-1. И, напротив, подавление Rac и CDC42 подсемейств нарушает рост (удлинение) аксонов, но никак не влияет на миграцию ядрышек. (ТАБЛ.1).

В одном из исследовании gain-of-function молекулы UNC-40 вызывала диспропорции между клеточными телами и разрастанием аксонов, и избыточное ветвление аксонов у C. elegans. Эти эффекты были сцеплены с Rac GTPase CED-10, с Enabled гомологом UNC-34 и с предполагаемым actin-binding protein UNC-115 (Табл.1). Эти внутриклеточные эффекторы сигнализирования, т.е. CED-10, UNC-34 и UNC-115, как оказалось, селективно взаимодействуют с двумя различными цитоплазматическими мотивами (Р1 и Р2) UNC-40. А это свидетельствует о мультифункциональных сигнализирующих свойствах данных рецепторов во время передачи разных сигналов актиновому цитоскелету.

Kinases implicated in netrin signaling

Mitogenactivated protein kinase (MAPK) сигнальный путь имеет наиболее важное значение в регуляции актин-цитоскелетной динамики подвижности клеток. Показано, что netrin-1 связывание с DCC рецепторным комплексом вызывает рекрутирование внеклеточной signal-regulated kinase-1 (ERK1) и ERK2 в DCC рецепторном комплексе, приводя к активированию MAPK сигнализирования. Специфичность этих событий была выявлена в экспериментах, в которых подавление ERK1 и/или ERK2 ингибировало netrin-индуцированный рост и ориентацию аксонов. В этих исследованиях впервые было доказано, что активация MAPK сигнализирования через DCC способствует netrin сигнализированию при росте аксонов и управлении этим ростом.

Недавние работы показали, что DCC взаимодействуют с focal adhesion kinase (FAK), т.е. киназой, участвующей в регуляции клеточной адгезии и миграции, а также с Src Tyr kinases (ТАБЛ.1). Связывание netrin-1 с DCC вызывает Tyr фосфорилирование DCC, тогда как разрушение FAK сигнализирования или Src-семейства киназ аннулирует netrin-1 индуцированный рост аксонов и аттрактивный поворот ростового конуса.

Внутриклеточные вторичные мессенджеры Ca2+ (Hong, K., Nishiyama, M., Henley, J., Tessier-Lavigne, M. & Poo, M., 1997) и циклический АМР (сАМР), так же как и мембранные ионные каналы, участвуют в аттрактивных и репульсивных процессах ростового конуса аксонов. Это, в первую очередь, относится к поворотам ростовых конусов, которые индуцируются внеклеточным градиентом netrin-1, требующим притока Са2+ через плазменно-мембранные Са2+ каналы, а также Са2+ индуцированного Са2+ высвобождения из цитоплазматических структур. Более того, ростовые конусы могут реагировать на те же ориентиры, но с противоположным «поведенческим» поворотом в зависимости от других случайных сигналов, которые влияют на внутриклеточные уровни сАМР. Следовательно, соотношение сАМР и активности циклического GMP регулирует полярность netrin-1-индуцированного управления аксонами: высокое соотношение благоприятствует аттракции, а низкое – репульсии.

Интерес представляет то, что внутриклеточные сигналы, активированные каноническими рецепторами нетринов (UNC-40, DCC и UNC5), совпадают с путями, активированными integrin-adhesion рецепторами (РИС.2). В свете последних данных, демонстрирующих функционирование netrin-1 в качестве лиганда специфических интегринов, это наблюдение является стимулом для более глубоких исследований действия нетринов в разных биологических системах.

Netrins in cell survival and cancer

В последнее время предполагают, что DCC и UNC5H работают как «зависимые рецепторы» (dependence receptors) из-за их зависимости от возможности netrin-1 обеспечивать выживаемость клеток (Mehlen, P. & Furne, C., 2005). Авторы описывают наиболее значимые результаты, полученные в данной области исследования.

Гипотеза о том, что DCC и UNC5H могут функционировать как зависимые рецепторы впервые была высказана Mehlen с соавт., обнаружившими, что в отсутствии их лиганда (netrin-1) эти 2 рецептора вызывают апоптоз клеток in vitro. Добавление netrin-1 подавляло клеточный апоптоз и способствовало лучшей выживаемости клеток. Позже было показано, что и DCC, и UBC5H являются caspase-3 субстратами и их разделение каспазой-3 индуцирует апоптоз (РИС.3a,b). Внутриклеточные сиквенсы DCC и UNC5H (особенно UNC5H1, UNC5H2 и UNC5H3) известные как addiction-dependence domains (ADDs; иногда их называют «доменами смерти») рекрутируют и активируют caspase-9. Такое рекрутирование ведет, в свою очередь, к активированию caspase-3, расщепляющей содержащие домены смерти рецепторы.

Было также установлено, что DCC-опосредованный апоптоз ассоциируется с palmitoylation и redistribution DCC в отношении липидных плотиков. И хотя данные наблюдения свидетельствуют в пользу механизма DCC-опосредованного апоптоза, слдует напомнить, что palmitoylation и recruitment DCC к липидным плотикам также встречается во время netrin-1-индуцированной DCC-зависимой ERK активации и во время netrin-1опосредованного разрастания аксонов.

Tanikawa с коллегами нашли, что UNC5B является прямой транскрипционной мишенью p53 и что он опосредует p53-зависимый апоптоз. Связывание netrin-1 с UNC5B полностью подавляло р53-индуцированный апоптоз. Это впоследствии подтвердилось тем, что экспрессия UNC5A, UNC5B и UNC5C генов даунрегулируется при многих злокачественных новообразованиях у человека, включая опухоли кишечника, груди, яичников, желудка, легких и почек. Экспрессия UNC5 генов в разных трансформированных клеточных линиях приводила к интенсивному подавлению роста клеток в мягком агаре, редуцировала инвазию в Matrigel и индукцию апоптоза. Все эти явления могут быть устранены при добавлении netrin-1 [Thiebault, K. et al., 2003].

Концепция о том, что netrin-1 функционирует как фактор выживаемости in vivo для клеток экспрессирующих DCC и/или UNC5 рецепторы, не подверглась сомнению. Недавно сообщалось, что сверхэкспрессия netrin-1 в кишечном тракте мышей ведет к снижению апоптоза и к образованию спонтанных гиперпластических повреждений и/или аденом. Более того, сверхэкспрессия netrin-1 у мышей с мутацией Apc (adenomatous polyposis coli) гена, ассоциируется с повышенной частотой агрессивных аденокарцином. Т.о., эти исследования доказывают, что netrin-1 рецепторы DCC и UNC5 могут функционировать как опухолевые супрессоры при определенных условиях, т.е. в отсутствии их лиганда netrin-1.

Pancreatic branching morphogenesis

Трехмерная структура органов возникает в результате тонкого контролирования механизмов адгезии, миграции, пролиферации, дифференцировки и клеточной гибели. Все эти процессы зависят от взаимодействия разных клеточных популяций с компонентами внеклеточного окружения (ЕСМ и факторов роста) и влияния тканевых функций во взрослом организме.

Поджелудочная железа представляет собой любопытную систему для исследования органогенеза. Эта эпителиальная ткань, содержащая эндокринные и экзокринные клетки, развивается благодаря процессу «морфогенеза ветвления» (см. выше) из эпителия первичной кишки. Сначала этот процесс зависит от прямого контакта энтодермы срединной линии с нотохордой, а в конечном итоге ведет к энвагинации дорсальной почки (стадия 13 сомитов у мышей, 8,5 эмбриональный день после коитуса) и вентральной почки (30 сомитов и T10.5) (РИС.4). Взаимодействие эпителиального компонента этих двух зачатков поджелудочной железы с ЕСМ, ростовыми факторам и другими сигнальными молекулами, поставляемыми мезенхимой, вызывает волны клеточной пролиферации, «ветвящийся морфогенез» и дифференцировку экзокринных и эндокринных клеточных линий (РИС.4).

Предварительные исследования показали, что netrin-1 может играть важную роль в морфогенезе поджелудочной железы и клеточной миграции. Netrin-1 экспрессируется в развивающейся поджелудочной железе в отдельных популяциях эпителиальных клеток, в структурах протоков, в группах развивающихся островков и в клетках разбросанных в недифференцированной ацинозной ткани. Секретируемый netrin-1 связывается с ECM компонентами базальных мембран и поддерживает адгезию и миграцию эпителиальных клеток потенциальных предшественников.

Далее авторы рассматривают функции Netrin-1 как лиганда α3β1 и α6β4 интегринов при развитии поджелудочной железы, а также роль hepatocyte growth factor/scatter factor (HGF/SF) в миграции клеток и его взаимодействие с netrin-1.

Spatial control of lung-bud development

У мышей морфогенез легких начинается на Е9.5 с отпочковывания от передней кишки. Примордиальные почки формируются внутренним слоем, состоящим из энтодермального эпителия и наружного слоя мезенхимы (РИС.5). Ветвление и рост дыхательного древа зависит от действия многочисленных транскрипционных факторов, ростовых факторов, компонентов ЕСМ и сигнальных белков. Факторы роста фибробластов (FGFs) играют здесь главенствующую роль. FGF10 продуцируется мезенхимой на самых ранних стадиях формирования почки легких и стимулирует пролиферацию энтодермальных клеток в апикальной области развивающейся почки. Паттерн экспрессии специфичных FGF1 на разных этапах развития почки контролирует региональную энтодермальную клеточную пролиферацию.

Spatial localization of netrins. Недавние исследования показали, что нетрины участвуют в «морфогенезе ветвления» легких. Netrin-1 (Ntn1) и Ntn4 мРНК экспрессируются в эпителиальных клетках lung-bud stalks и депонируется в окружающем базальной слое. Ntn1 и Ntn4 экспрессируются наиболее интенсивно в неветвящейся проксимальной энтодерме и в области стебелька (stalk) растущей почки и они не исчезают из растущей верхушки почек, где наблюдается наиболее активное ветвление. Это свидетельствует о том, что пространственное ограничение этих двух нетринов важно для успешного «морфогенеза ветвления» (РИС.5). Кроме того, netrin-4 (и в меньшей степени netrin-1) подавляют формирование вторичных почек, индуцированных либо FGF7, либо FGF10. Этот эффект не блокировался антителами к DCС, указывая на то, что альтернативные рецепторы нетрина могут вовлекаться в данный процесс.

Netrin-1 in mammary-gland development

Молочная железа – другой интересный пример эпителия, развивающегося через «морфогенез ветвления». Во время удлинения протоков (РИС.6а-с) терминальные концевые почки (TEB) (РИС. 6d) демонстрируют быстрый рост и пенетрацию жировой подушки. Cap-клетки и TEBs являются стволовыми клетками, которые дифференцируются в миоэпителиальные клетки (MECs), формирующие внешний слой протока. Подлежащие cap клетки являются прелюменальными клетками, которые в конечном итоге организуются во внутренний lumenal epithelial cell (LEC) слой протока.

Srinivasan et al обнаружили, что netrin-1 продуцируется в этих prelumenal клетках и что нетриновый рецептор неогенин локализуется в прилегающих cap-клетках (РИС.6 d). Трансплантация эпителия молочных желез от Ntn1 -/- мышей в жировую подушку мышей вела к аномальному развитию ткани молочной железы с заметной дестабилизацией и отделением cap-клеточного слоя от prelumenal клеточного слоя. Сходные результаты наблюдали у неогенин-дефицитных ( Neo1–/–) TEBs, свидетельствуя о том, что netrin-1 и неогенин взаимодействуют для стабилизации cap-cell layer, возможно посредством неогенин-зависимого контроля реорганизации цитоскелета в cap-клетках.

Далее авторы обсуждают роль другого неврального фактора - SLIT2, который ранее был охарактеризован как антогонист netrin-1 в управлении аксонами [90].

Netrins as guidance cues in angiogenesis

Сосудистая система имеет большое сходство с периферической нервной системой, т.к. многие из молекулярных «игроков» изначально рассматривающихся как регуляторы движения и нахождения пути аксонами, участвуют и в ветвлении и развитии кровеносных сосудов.

Lu с коллегами показали, что netrin-1 работает как репульсивный ориентир во время роста и нахождения путей роста кровеносными сосудами (РИС.7). Netrin рецептор UNC5B, обычно опосредующий репульсивные ориентиры, локализован в развивающихся капиллярах. Мыши с loss-of-function мутациями в Unc5B имеют избыточное ветвление кровеносных сосудов. Утрата Unc5B также ассоциировалась с избыточным удлинением филоподий в эндотелиальных верхушечных клетках (endothelial tip cells). Используя культуру артериальных эндотелиальных клеток, экспрессирующих Unc5B, авторы показали, что netrin-1 снижает рост филоподий в эндотелиальных клетках. Более того, нокдаун netrin-1 ортолога у полосатого данио индуцировал сходный тип аномального ветвления в развивающихся кровеносных сосудах. Эти эксперименты показывают, что netrin-1-UNC5B путь может регулировать формирование кровеносных сосудов во время эмбриогенеза, ограничивая избыточное латеральное удлинение филоподий в эндотелиальных клетках и, т.о., благоприятствовать росту почек кровеносных сосудов по «тканевым коридорам».

И хотя эти результаты убедительно показали, что netrin-1 эффективно влияет на удлинение филоподий, остается открытым вопрос о механизмах, позитивно регулирующих направление навигации сосудов по ткани во время развития.

Park с соавторами сообщали, что netrin-1 стимулирует митогенез и миграцию гладких мышц сосудов и эндотелиальных клеточных линиях. Оказалось также, что netrin-1 скорее способствует, чем предотвращает миграцию эндотелиальных клеток. Такое разногласие м.б. объяснено различными экспериментальными условиями в разных лабораториях (разные периоды времени, разные концентрации netrin-1 и т.п.).

Недавно Wilson с коллегами сообщили, что сверхэкспрессия netrin-1 индуцирует повышенный рекруимент клеток гладкой мускулатуры в участках нео-васкуляризации у in vivo модели limb ишемии.

Отмечается также, что ангиогенные эффекты netrin-1 могут отличаться при эмбриональном развитии и у взрослого организма. Кроме того, высказывается предположение, что netrin-1 может оказывать направленное действие на разные типы сосудистых клеток (т.е. клетки гладких мышц и эндотелиальные клетки венул) через разные рецепторные пути. А в механизмах netrin-1 распознавания могут быть вовлечены специфические интегриновые рецепторы, локализованные в эндотелиальных клетках (α3β1 и α6β4).

Conclusions and future perspectives

Нетрины, изначально охарактеризованные как ориентиры в управлении ростом аксонов, сейчас рассматриваются как важные элементы, участвующие в развитии разных органов и тканей, особенно тех, развитие которых связано с «морфогенезом ветвления». В целом, нетрины функционируют совместно с другими управляющими ориентирами, обеспечивающими завершение процесса развития и навигационную информацию, что приводит в конечном итоге к появлению высокоорганизованной структуры органа у взрослого организма. Согласно современной концепции, функции нетринов в не невральных тканях включают краткосрочные механизмы действия, когда клетки, реагирующие на нетрин, локализуются вблизи клеток продуцирующих нетрин. Единственным исключением являются ворсинки кишечника. В этом случае высокие уровни нетрина-1 определялись в проксимальной части крипт, возможно, обеспечивая выживаемость DDC-экспрессирующих клеток, в то время как низкие уровни netrin-1 определялись в дистальных участках ворсинок, где апоптоз и shedding встречаются чаще. При развитии кровеносных сосудов нетрины, по всей видимости, работают через кратко- и долгосрочные механизмы действия.

Наблюдения о функционировании ламинин-связывающих интегринов (α3β1 и α6β4) в качестве рецепторов netrin-1 вызвали большой интерес среди нейробиологов. Было обнаружено, что эти два интегрина оказывают значительное влияние на развитие центральной нервной системы. Недавно было показано, что адгезия и миграция различных клеточных популяций зависит от функции ламинин-связывающих интегринов. Например, α6 integrin-/- мыши, кроме дефектов эпителиальных тканей, имеют тяжелые аномалии ламинарной структуры коры мозга и сетчатки.

И хотя эти дефекты в настоящее время связывают главным образом с нарушениями взаимодействия интегрина и ламинина, отсутствие распознавания netrin-1 α6 интегринами может также быть причиной аномального фенотипа.

Исследования поджелудочной железы, легких и молочных желез показали, что нетрины создают позиционно-зависимые ориентиры для передвижения клеток, их пролиферации и выживаемости. Например, при моделировании этого процесса на легких, UNC5-семейство рецепторов опосредует ингибиторные эффекты нетринов на FGF-стимулированную пролиферацию в stalk области растущей почки. Предположительно, что эндотелиальные клетки на конце почек продолжают пролиферацию, благодаря отсутствию нетринового ингибирования и продолжающейся стимуляции FGF. И, наконец, характеристки DCC и UNC5H как зависимых рецепторов, вызывающих апоптоз в отсутствии их лиганда netrin-1, дают возможность предположить что этот невральный хемотропный фактор влияет на выживаемость не только в нервной, но и других тканях. Эта новая концепция предполагает, что тонкий баланс между доступностью netrin-1 при связывании с DCC или UNC5H может быть важен для судьбы невральных и не невральных тканей во время развития, при ремоделировании и гомеостазе тканей взрослого организма и при развитии опухолей.

Авторы полагают, что на самом деле должно существовать гораздо больше нетринов, чем обнаружено в мозге, и что в ближайшем будущем исследователей ждут большие открытия в этой области. Участие нетринов в эпителиальном и васкулярном морфогенезе, а также в идентификации специфических интегринов как нетриновых рецепторов, дает основание думать, что в скором времени будут обнаружены их новые функции не только в мозге, но и в других органах.