Molecular mechanism of the nuclear protein import cycle
Murray Stewart Nature Reviews Molecular Cell Biology 8, 195-208, No 3, (March 2007) | doi:10.1038/nrm2114
The nuclear import of proteins through nuclear pore complexes (NPCs) illustrates how a complex biological function can be generated by a spatially and temporally organized cycle of interactions between cargoes, carriers and the Ran GTPase. Recent work has given considerable insight into this process, especially about how interactions are coordinated and the basis for the molecular recognition that underlies the process. Although considerable progress has been made in identifying and characterizing the molecular interactions in the soluble phase that drive the nuclear protein import cycle, understanding the precise mechanism of translocation through NPCs remains a major challenge.
Пространственное разделение транскрипции и трансляции предоставляет эукариотам мощный механизм контроля генной экспрессии, а также необходимость избирательного транспорта между ядерным и цитоплазматическим компартментами для поддержания самостоятельности композиции каждого. Соотв., ядерная оболочка является критическим барьером, через который белки и РНК транспортируются регулируемым образом. Более того, помимо массового переноса постоянных ядерных белков, таких как гистоны из-за их синтеза в цитоплазме, изменения в генной экспрессии в целом нуждаются в контролируемом поступлении ключевых сигнальных молекул в ядро.
Макромолекулы, которые являются более крупными, чем ~40 kD транспортируются активно через ядерную оболочку посредством nuclear pore complexes (NPCs), используя растворимые транспортные факторы или молекулы носители, которые снуют между цитоплазмой и ядром1-11. NPCs (Box 1) являются громадными макромолекулярными ансамблями, которые пронизывают ядерную оболочку и формируют канал для двухстороннего обмена молекулами между цитоплазмой и ядром посредством центрального канала, который имеет ограниченный диаметр ~25-30 nm12. NPCs сконструированы из множественных копий из ~30 различных белков, называемых nucleoporins13-15.
Имеется несколько путей ядерного транспорта, каждый из которых транспортирует специфический набор макромолекул в или из ядра1-7. Большинство путей используют гомологичное семейство молекул носителей, называемых β-karyopherins, с важными носителями, называемыми importins и обеспечивающими экспорт, называемые exportins. Многие белки импортируются, используя importin-β (часто используя importin-α в качестве адаптора), хотя некоторые импортируются, используя др. importins,такие как transportin; многие белки экспортируются, используя экспортный носитель CRM1, в то время как pre-microRNA и tRNA экспортируются с помощью exportin-5 и exportin-t (каждый из которых является гомологом importin-β). Напротив, экспорт мРНК использует NXF1:NXT1 гетеродимер, который неродственен с karyopherins. Классический путь импорта ядерных белков (Fig. 1) охарактеризован лучше всего из этих транспортных циклов и все его компоненты (Table 1) идентифицированы (rev. Refs 1-11).
Nuclear protein import pathways
Существуют разные пути импорта ядерных белков, которые используют разные носители, но которые обладают многими общими признаками и базируются на упорядоченной сери межбелковых взаимодействий, с помощью которых груз распознаётся в цитоплазме, транслоцируется через NPCs и высвобождается в ядре1-7. В каждом пути грузы-белки находятся для импорта в ядро благодаря коротким последовательностям мотивов nuclear localization signal (NLS). Существуют разные классы NL, каждый из которых распознается с помощью компонентов из разных путей. Классический путь импорта ядерных белков использует importin-β в качестве носителя, транспортируя широкий круг грузов, он существенно изучен биохимически, генетически, клеточно-биологически и структурно. Хотя этот путь главный в данном обзоре, прогресс затронул и наше понимание путей импорта рибосомальных белков16, гистонов17 и heterogeneous nuclear ribonucleoproteins (hnRNPs) с M9 NLSs18, и те, которые используют др. носители и NLSs, которые отличны от тех. что используются в классическом пути.
The classic nuclear protein import cycle
Классический цикл импорта ядерных белков (Fig. 1) обеспечивает скорость транспорта ~100-1000 рузов в мин на NPC19 и управляется серией межбелковых взаимодействий. Белки-грузы с классическими NLS импортируются носителем importin-β, который связывает их посредством importin-α1-11. Оба импортина являются удлиненными молекулами, сконструированными из тандемной серии повторяющихся последовательностей мотивов (Box 2, Fig. 2b и S1,)). В цитоплазме белки грузы, которые содержат классический NLS, образуют импортный комплекс с гетеродимером importin-α:β, который облегчает прохождение через NPCs. В ядре RanGTP соединяется с importin-β, диссоциируя импортный комплекс и высвобождая груз. Importin-β в комплексе с RanGTP подвергается переработке в цитоплазме, тогда как importin-α экспортируется в комплексе с β-karyopherin CAS и RanGTP. Наконец, цитоплазматический RanGAP (Ran GTPase activating protein) стимулирует Ran GTPase, генерируя RanGDP, которая отсоединяется от импортинов и тем самым высвобождает их для следующего цикла импорта.
Цикл импорта ядерного белка базируется на тщательно контролируемой серии взаимодействий в пространстве и во времени. Молекулярное распознавание является критическим для цикла, как в терминах распознавания носителями своего груза, так в терминах отличия между ядерным и цитоплазматическим компартментом. Взаимодействия между грузами и носителями оркестрируются с помощью нуклеотидного состояния Ran, которое циклически меняется между GTP- и GDP-связанным состоянием (Fig. 1b). Состояние Ran нуклеотида контролируется за счет его guanine nucleotide-exchange factor (RanGEF), который катализирует повторную загрузку GTP на RanGDP, и за счет RanGAP, который стимулирует гидролиз GTP. RanGEF является ядерным, а RanGAP цитоплазматическим, так что ядерная Ran находится в GTP-связанном состоянии, в то время как цитоплазматическая Ran связана с GDP. RanGTP экспортируется из ядра, связанной с β-karyopherin носителями, а после RanGAP-обусловленного гидролиза GTP, цитоплазматическая RanGDP транспортируется в ядро с помощью своего специфического переносчика, nuclear transport factor-2 ()20,21, для повторного присоединения GTP.
Конформация ключевых структурных петель в Ran (переключение петель I и II) изменяется существенно в зависимости от нуклеотида (Box 2 и ). Это структурное изменение предопределяет способ, с помощью которого транспортные факторы семейства importin-β взаимодействуют с грузами и то, что в конце концов Ran GTPase обеспечивает энергией ядерный транспорт.
Цикл импорта ядерного белка может быть подразделен на 4 ступени: сборка импортного комплекса груз-носитель в цитоплазме; транслокация через NPCs; разборка импортного комплекса в ядре; и рециклинг импортина.
Step 1: import-complex assembly
Классические NLSs содержат один или два кластера basic остатков (Fig. 2a). Состоящие из одной части NLSs, напр., представленные в SV40 large-T антигене, обладают одним кластером в 4-5 basic остатков, тогда как состоящие из двух частей NLSs, такие как те, что из nucleoplasmin, имеют второй basic кластер, расположенный приблизительно 10-12 остатков ниже первого кластера (Fig. 2a). Молекулярное распознавание NLSs является критическим для образования импортного комплекса и обеспечивается с помощью специфических сайтов на importin-α22-24. Importin-α сконструирован из тандемной серии Armadillo (ARM) повторов, которые образуют банано-подобной формы молекулу (Fig. 2 and ), a NLS-связывающие сайты образуются из множества Trp, Asn и кислых остатков, которые локализованы в борозде на внутренней вогнутой поверхности (Fig. 2b-d). Первичный сайт связывания для состоящих из одной части NLSs занимает ARM повторы 1-4 (главный сайт), a вторичный сайт (минорный сайт) занимает ARM повторы 6-8 (Refs 22-24). В состоящих из двух частей NLSs, крупный основной кластер занимает главный сайт, а более мелкий основной кластер занимает минорный сайт. Остатки в состоящем из одной части NLS и в более крупном кластере состоящем из двух частей NLSs обозначаются как P1-P6, в то время как остатки во втором сайте bipartite NLSs обозначаются как P'1-P'4 (Fig. 2c,d). Basic боковые цепочки NLSs осуществляют серию специфических взаимодействий с ключевыми остатками вдоль внутренней поверхности importin-α (Fig. 2c,d)22-24. показал, что Lys остаток в положении P2 особенно важен для этого взаимодействия, хотя позиции P3 и P5 также важны25,26. В целом NLS приспосабливаются к сайту связывания и таким образом обычно присутствуют в виде неструктуированной поверхностной петли в белке грузе, хотя иногда NLS образуются из несопоставимых регионов белка27. Более того, немногие белки грузы соединяются непосредственно с importin-β28,29 скорее, чем с importin-α.
N конец importin-α соединяется с importin-β посредством домена, известного как importin-β binding (IBB) домен30,31 (Box 2 and ), который также облегчаает высвобождение груза в ядре32 (Fig. 2e). Домен IBB содержит кластер основных остатков, которые сходны с NLS и МОГУТ соединяться с NLS-связывающими сайтами32,33 (Fig. 2e). Следовательно, помимо соединения importin-α с importin-β домен IBB обладает аутоингибирующей ролью32, так что когда он не соединяется с importin-β, он конкурирует с NLSs за связывание importin-α и тем самым вносит вклад в высвобождение груза. В согласии с этой гипотезой то, что сродство importin-α конструкций, которые лишены IBB-домена (DeltaIBB-importin-α), к NLSs становится существенно выше, чем сродство белка полной длины34-36. Однако, importin-α обычно обладает более высоким сродством к NLSs, чем к IBB домену и поэтому груз всё ещё будет присоединяться к полной длины импортину-α, но с более низким сродством, чем то, что наблюдается у DeltaIBB конструкции36. Когда IBB домен соединяется с importin-β, он не может больше конкурировать с NLSs за связывание с importin-α. Следовательно, в цитоплазме NLS-содержащие грузы возможно соединяются в первую очередь с комплексом importin-α:β скорее, чем только с importin-α. Обычно, NLSs обладают ~10-nM сродством к DeltaIBB-importin-α или к комплексу importin-α:β34-36 , а скорость ядерного импорта коррелирует с силой связывания с importin-α37.
Способ, с помощью которого importin-α распознает NLSs отлитчается от способа, с помощью которого не-классические NLSs распознаются непосредственно с помощью др. β-karyopherins. Напр., importin-β связывает sterol-response-element-binding protein-2 (), используя расширенные α-спирали из HEAT повторов 8 и 17 подобно палочкам для еды28, тогда как недавняя структурная работа по transportin показала, как он соединяется с M9 NLSs, которые имеют центральный basic или гидрофобный мотив, сопровождаемый характерной R/H/KX(2-5)PY консенсусной последовательностью18.
Step 2: translocation through NPCs
Макромолекулы Mr более 40 kD не могут выйти через NPCs, и только те, которые соединяются с носителями могут проходить через центральный транспортный канал, тогда как более мелкие молекулы могут свободно диффундировать через NPCs. Однако, оба механизма, с помощью которых комплексы груз-носитель транслоцируются через NPCs и механизм, с помощью которого др. молекулы исключаются, остаются дискуссионными. Исследования с флюоресценцией одиночных молекул показали, что движение комплексов груз-носитель через поры двунаправленное и быстрое38, напоминающее и в целом оно представляется процессом первого порядка, в котором скрорость ограничивается выходом груза. Следовательно, двунаправленность транспорта не обусловлена самой порой, а RanGTP-индуцированной диссоциацией импортного комплекса груз-носитель в ядре. Транслокация комплексов груз-носитель происходит быстрее, чем транслокация одного носителя и кажется, что имеются множественные параллельные пути транспорта39. Более того как время импорта, так и эффективность транспорта, по-видимому, зависят от концентрации importin-β40. Какие молекулы будут транспортированы через ядерные поры определяется в первую очередь носителями, каждый из которых соединяется со специфическим набором грузов (хотя иногда имеется некоторый уровень разнородности; некоторые грузы могут переноситься более чем одним носителем)1-11.
FG-nucleoporins. Субнабор NPC белков, которые содержат характерные тандемные Phe-Gly (FG) повторяющиеся последовательности13-15,(FG-nucleoporins) как полагают, важны для обеспечения движения комплексов груз-носитель через NPCs, так и для исключения др. макромолекул из центрального транспортного канала NPCs41-51. FG-nucleoporins обычно содержат ~20-30 таких повторов13-15,50,51, а ЭМ исследования14,52 показали, что повторы образуют кластеры вокруг ядерной и цитоплазматической сторон NPCs, а также в центральном транспортном канале (Box 1). Имеется приблизительно 3500 FG повторов на NPC13-15,41,50,51. Области FG-повторов в nucleoporins, по-видимому, обладают слабо упорядоченной структурой42,53,54 и достаточно гибки, чтобы обеспечить движение через NPC с одной стороны на др.5,55.
Боковые цепочки Phe гидрофобного стержня FG-повтора соединяются с мелкими гидрофобными полостями на поверхности носителя41-46,56. Взаимодействие слабое (обычно порядка μM сродства) и поэтому оно достаточно скоротечно, чтобы сделать возможным быстрый транспорт комплексов груз-носитель (высокое сродство д. было замедлить скорость41). Сконструированные мутанты с ослабленным сродством к стержню FG-nucleoporin показали, что подобное взаимодействие необходимо для ядерного импорта как importin-β, так Ran41-45,57. Кроме того, взаимодействие между носителями и стержнями FG-повторов может также зависеть от линкеров между стержнями. Напр., разные регионы из области GLFG-повтора Saccharomyces cerevisiae nucleoporin , который содержит то же самое количество GLFG стержневых последовательностей обладает иным сродством к importin-β49. Структурные исследования также показали, как линкеры между FG стержнями могут вносить вклад во взаимодействие между importin-β и S. cerevisiae nucleoporin (Ref. 56). Следовательно, хотя связывание с FG стержнями является центральным для взаимодействия между importin-β и nucleoporins, линкерные области могут модулировать силу взаимодействия. Более того, жадность каждого FG-nucleoporin к носителям зависит от количества FG повторов и поэтому существует значительная вариабельность кажущегося сродства для изолированных nucleoporins к носителям in vitro, хотя это может быть и не верно для in vivo, т.к. разные nucleoporin цепочки, по-видимому, перемешаны в NPC. В случае импортных комплексов importin-α:β, видимое сродство изолированных nucleoporins к комплексам увеличивается прогрессивно по мере перемещения от цитоплазматической стороны к ядерной стороне NPC и этот градиент, как было предположено, функционирует как движущая сила для ядерного импорта58,59. Однако, т.к. асимметрично распределенные nucleoporins несущественны50,60 и более того обратный градиент концентрации RanGTP61 может делать транспорт обратным, то кажется маловероятным, что градиент nucleoporin-сродства важен, хотя он может играть каталитическую роль34,35,56.
Проницаемость NPCs неожиданно оказалась нечувствительной к делециям FG повторов из многих нуклеопоринов. Систематические делеции областей FG-повторов из 11 дрожжевых nucleoporins в разных комбинациях показали, что FG домены из асимметрично локализованных nucleoporins были несущественны in vivo50. Делеции повторов из всех 5 асимметричных FG-nucleoporins или комбинированные делеции из симметричных nucleoporin FG повторов вызывают только 3-4-кратное снижение в скорости импорта NLS-содержащего груза, хотя специфические комбинации симметрично организованных nucleoporins были существенными50. Свыше половины от общей массы FG повторов может быть делетировано без потери жизнеспособности или потери нормальной барьерной функции NPCs и, более того, влияние делеций было разным для разных путей импорта. Удивительно, отсутствие корреляции между массой делетированных FG повторов и жизнеспособностью - делеция GLFG повторов из Nup100 и Nup116 было летальным, хотя они представляли лишь незначительную фракцию от общей массы FG-повторов50. Очень важно, что хотя все FG-nucleoporins содержат сходные повторяющиеся мотивы, не все FG повторы эквивалентны. Следовательно, помимо облегчения прохождения комплексов груз-носитель через NPCs, определенные FG-nucleoporins, или вообще специфические повторы внутри них, по-видимому, обладают дополнительными функциями, которые ещё точно не определены.
Models of selective transport. Концентрация FG повторов в транспортном канале NPC высока, возможно порядка 10 mM или ~200-300 mg per ml41 и это в комбинации с их нативной неупакованной конформацией53,54, может закрыть прохождение макромолекул. Поэтому было предположено, что молекулярная теснота, вызываемая высокими концентрациями FG повторов, может исключать крупные молекулы entropically14,62,63. Такое исключение может происходить благодаря высоким концентрациям полипептидных цепочек FG-повторов, входящих др. в др. и эта теснота ограничивает количество возможных конформаций каждой. Высокие концентрации цепочек не могут выбрать путь случайного блуждания, который ожидаем для не уложенных полипептидных цепей64, и они становятся более вытянутыми, подобно щетинкам в щетке65. Такое расположение цепочек, при котором движения ограничены, оказывается более упорядоченным и имеет низкую (и следовательно, высокую свободную энергию), чем свободные цепочки в растворе и тем самым устойчивы к сильной тесноте, которая возникает в результате внесения др. макромолекулярных цепей. Недавние in vitro эксперименты подтвердили гипотезу, что высокие концентрации FG повторов могут формировать молекулярные щетки62.
Альтернативно, было предположено, что FG-nucleoporin повторы формируют сито-образный гель благодаря взаимодействиям между гидрофобными FG стержнями16,48,66. Диффузия частиц в поперечно связанном геле зависит критически от размера гелевых пор67: частицы, большие размеров пор, не могут диффундировать, тогда как скорость диффузии частиц меньше размеров пор снижается незначительно. В этой модели диффузия ограничивается приблизительно 40 kD для NPCs и может быть следствием размера пор FG-nucleoporin геля. Недавняя работа показала, что область FG-повторов S. cerevisiae nucleoporin Nsp1 и в самом деле может формировать трехмерную сеть с hydrogel-подобными свойствами и что застывание (gelation) критически зависит от Phe остатков в повторяющихся стержнях66.
Как в модели молекулярной тесноты, так и в hydrogel/sieve модели, комплексы груз-носитель, как полагают, способны преодолевать барьер, создаваемый FG-nucleoporins благодаря своим взаимодействиям с FG-повторяющимися стержнями. Модель молекулярной тесноты предполагает, что связывания компенсирует наказание энтропией проникающих тесно упакованных nucleoporin цепочек14,63, в то время как hydrogel/sieve модель полагает, что взаимодействие с носителем локально прерывает взаимодействия между FG-повторами стержней, которые генерируют гель, и временно открывает соседние ячейки в геле66. Т.к. обе модели базируются на высоких концентрациях nucleoporins и их взаимодействиях с носителями, то трудно экспериментально выявть различия между ними. Обе модели для исключения нуждаются в высоких концентрациях FG повторов и таким образом нелегко примирить наблюдения, что ядерный транспорт и жизнеспособность законсервированы у S. cerevisiae, у которых свыше 50% nucleoporin FG повторов было делетировано50. Вместо этого специфические FG-nucleoporin повторы в определенных местах могут быть более важными для ограничения проницаемости50.
Было предположено10,34,35,56,68, что FG повторы могут влиять на скорость транспорта благодаря концентрации растворенных компонентов классической кухни импорта ядерных белков (таких как importin-α, importin-β и Ran) в NPCs. В самом деле, их концентрации обычно видны в исследованиях флюоресцентной микроскопии. Благодаря расстоянию между NPCs на ядерной оболочке обычно порядка μm69, шансы молекул в цитоплазме столкнуться с NPC малы, а избирательная концентрация соотв. макромаолекул вблизи NPCs д. облегчать их столкновение со входом в поры. FG-повторы, содержащие фибриллы, которые тянутся на несколько μm в цитоплазму могут облегчать транспорт путем наведения связанных комплексов груз-носитель на транспортный канал10,70, одинаково со способом, с помощью которого щупальца морских anemone помогают сконцентрировать пищу около своего рта. Однако, такой механизм вряд ли может объяснить целиком избирательность, т.к. цитоплазматические филаменты не являются необходимыми абсолютно для импорта ядерных белков71. Естественно, такие механизмы не являются взаимно исключающими и все могут участвовать в избирательности.
Несколько механизмов было предположено для объяснения, как комплексы груз-носитель движутся через NPCs (rev. Ref. 51). Гидрофобные взаимодействия между белками носителями и FG-повторяющимися стержневыми последовательностями безусловно важны, а созданные транспортные факторы с пониженным сродством к FG-nucleoporins не способны поддерживать ядерный транспорт41-45. Взаимодействие между многими носителями и FG-nucleoporin стержнями, по-видимому, в целом разнородны. Более того, большинство регионов FG-повторов, по-видимому, локализуется диффузно в транспортном канале NPC и такие неспецифические взаимодействия между транспортными факторами и разными FG-repeat cores, по-видимому, облегчают существенно прохождение комплексов груз-носитель через NPCs. Однако, исследования, описанные выше50, в которых FG повторы определенных nucleoporins были делетированы, показывают, что помимо эти х разнородных взаимодействий, имеются также специфические взаимодействия, которые критические для транспорта, хотя точный вклад каждого еще предстоит установить.
Молекулярные механизмы, с помощью которых FG-nucleoporin повторы облегчают движение комплексов груз-носитель через NPCs, дискуссионны. Было предположено, что комплексы груз-носитель скачут с одного FG повтора на следующий, что можно уподобить использованию повторов подобно камням для перехода72 или подобно скольжению по маслу спагетти2. Альтернативно, FG-nucleoporins могут обеспечивать избирательную фазу, в которой только транспортные факторы растворяются16,48.
Step 3: import-complex disassembly
Ядерный RanGTP диссоциирует импортный комплекс груз-носитель и тем самым обеспечивает направленность процесса транспорта. Быстрая диффузия комплекса груз-носитель взад и вперед в транспортном канале NPC40 поддерживает быстрое равновесие посредством NPC т таким образом оно следует из , что удаление комплекса с ядерной стороны NPC за счет его диссоциации с помощью RanGTP д. приводить к чистому току комплексов груз-носитель из цитоплазмы в ядро, чтобы восстановить равновесие. На молекулярной шкале это эквивалентно скажем тому, что хотя тепловая энергия (Броуновское движение) позволяет грузу соединяться со своим носителем, чтобы диффундировать быстро в любом направлении через канал пор, но груз не может вернуться в цитоплазму после своей диссоциации от носителя в ядре. В конечном итоге, благодаря энергии RanGTP гидролиза усиливается Броуновское движение комплексов груз-носитель и тем самым генерируется , которые делает возможным направленный транспорт путем диссоциации комплексов.
Dissociation of the importin-α:βcomplex. Связывание RanGTP с importin-β диссоциирует комплекс importin-α:β, приводя к высвобождению груза. Имеется лишь ограниченное перекрывание между RanGTP и IBB-домен-связывающими сайтами на importin-β, итак RanGTP высвобождает importin-α IBB домен в первую очередь путем индукции конформационных изменений importin-β, скорее, чем за счет конкуренции импортина-β, высвобождая тем самым IBB домен в основном за счет аллостерического механизма73,74. В importin-β:IBB-domain комплексе74 (Box 2 and Supplementary information S2 (movie)), имеется обширное электростатическое взаимодействие между basic IBB доменом и кислыми остатками, которые образуют почти непрерывный негативно заряженный участок на внутренней поверхности importin-β. Это обширное взаимодействие нуждается в точном совпадении между винтрообразным pitch импортина-β и α-спиралью, предполагаемой для IBB домена, так что importin-β закручивается вокруг IBB домена. Конформационное изменение importin-β вызванное с помощью RanGTP связывания нарушает совпадение между importin-β helicoid и IBB-доменовой спиралью и поэтому эффективно предупреждает их взаимодействие74 (Fig. 3c and Supplementary information ).
Importin-β сконструирован из 19 HEAT повторов (H1-19), каждый из которых базируется на двух α-спиралях (Box 2; Fig. 3), которые складываются вместе, чтобы создать удлиненную винтообразную молекулу56,74,75. RanGTP соединяется с тремя сайтами на importin-β73,74 (Fig. 3a,b и ). Переключающая петля II соединяется с importin-β вблизи N конца с областью, которая соответствует HEAT повторам 1-4 и которая является общей для всех β-karyopherins76. Сходное взаимодействие switch II петли наблюдается в комплексе RanGTP или с transportin77 или CAS33. Второй Ran-связывающий сайт на importin-β осуществляет в основном электростатическое взаимодействие с петлей в HEAT повторе 8 (refs 73,74). Третий RanGTP-связывающий сайт участвует во взаимодействии switch I петли с HEAT повторами 12-15 и является критическим для генерации конформационных изменений, которые усиливают helicoidal pitch74. В комплексе importin-β:IBB-домен путь следования importin-β helicoid д. сталкиваться с Ran. RanGTP связывание может, следовательно, только приспосабливаться, когда importin-β цепь движется, это в свою очередь генерирует увеличение helicoidal pitch, что высвобождает IBB домен. Электростатическое взаимодействие между Lys37 и Lys152 остатками Ran с кластером из негативно заряженных остатков на importin-β является центральным в этом взаимодействии и хотя прерывание этого взаимодействия для K37D/K152A-Ran не предупреждает связывания RanGTP с importin-β, оно ингибирует высвобождение IBB-домена74.
Cargo release. Хотя отсоединение importin-α от importin-β делает импорт необратимым, всё ещё необходимо отсоединение груза от importin-α. Когда освобожденный от importin-β с помощью RanGTP, IBB домен конкурирует с NLS груза за соединение с importin-α, то тем самым снижается сродство груза к importin-α и тем самым облегчается высвобождение32 посредством аутоингибиторного механизма (Fig. 2e). Аналогичный механизм был предположен для высвобождения M9 NLSs от transportin, причем петля в HEAT повторе 8 транспортина, как было предположено, конкурирует за NLS-связывающий сайт, когда он высвобождается с помощью RanGTP18,77.
Т.к. importin-α обладает значительным сродством к классическим NLSs (в целом ~10 nM), то скорость диссоциации слишком медленная, чтобы приспособиться к скорости транспорта ~100-1000 в сек на NPC16. FG-nucleoporins, расположенные на ядерной стороне NPC, такие как S. cerevisiae Nup1 и , ускоряют разборку35,36,56,68 импортного комплекса importin-α:β:груз, а делеция любого из nucleoporin приводит к дефектам роста. Nup1 обнаруживает более высокое сродство к импортному комплексу importin-α:β, чем др. nucleoporins56,68 и таким образом концентрирует импортные комплексы на ядерной стороне пор, тем самым увеличивая скорость связывания с RanGTP. Сходным образом, т.к. он может связывать как RanGTP, так и CAS, то экспортный переносчик importin-α, Nup2, также может увеличивать скорость разборки импортирующего комплекса за счет увеличения локальной концентрации этих факторов34. Однако, Nup2 (и его metazoan аналог, ) также активно удаляют monopartite и bipartite NLSs с importin-α за счет увеличения скорости диссоциации34,35,68. Структурные исследования34,35 (Fig. 4 и ) показали, что Nup2/NUP50 связывают importin-α в двух сайтах: сайт высокого сродства на С конце importin-α и сайт низкого сродства, который перекрывается с сайтом связывания NLS. Связывание Nup2/NUP50 с сайтом высокого сродства на importin-α C конце значительно увеличивает локальную концентрацию домена Nup2/NUP50, который соединяется с сайтом низкого сродства и тем самым ускоряет NLS off-rate с помощью механизма, аналогичного тому, что предположен для IBB домена32,35.
Step 4: importin recycling
После разборки импортирующего комплекса с помощью RanGTP, importins подвергаются рециклингу в цитоплазме. Importin-β для этого комплексуется с RanGTP, в то время как importin-α экспортируется активно с помощью CAS1-11. Структура S. cerevisiae CAS:importin-α:RanGTP экспортного комплекса (Fig. 5a и )33 показывает, что CAS закручивается вокруг RanGTP и importin-α с необычно большим интерфейсом взаимодействия. CAS структурно сходен с importin-β и базируется на 19 HEAT повторах. В комплексе домен IBB соединяется с сайтами importin-α, связывающими NLS, а мутагенные исследования33 показали, что это связывание является критическим для образования экспортного комплекса. Следовательно, мутации вмешиваются в связывание IBB домена или с NLS сайтами или с CAS
предупреждая образование экспортного комплекса. Важным следствием центральной роли IBB домена в образовании экспортного комплекса является то, что может только формироваться, когда груз высвобождается с importin-α. Это свойство предупреждает бесполезные циклы, с помощью которых importin-α возвращается в цитоплазму, всё ещё неся груз33. Однако, IBB домен может также удалять Nup2/NUP50, связанный с importin-α, но это делается более трудным с этими nucleoporins, связанными с importin-α с более высоким сродством с NLSs35. Было предположено35, что ключом в этой дилемме является путь, с помощью которого CAS соединяется с importin-α (Fig. 5). В экспортном комплексе д. происходить стерическое столкновение, если Nup2/NUP50 будет оставаться связанным с importin-α C концом и это, по-видимому, ведет к тому, что Nup2/NUP50 удаляется двухступенчатым механизмом, который преобразовывает путь, с помощью которого Nup2/NUP50 отсоединяют NLSs. Следовательно, CAS сначала устраняет Nup2/NUP50 с сайта высокого сродства на С конце importin-α, это затем облегчает IBB домену устранение Nup2/NUP50 с NLS-связывающих сайтов, как показано на Рис. 5d.
Способ, с помощью которого importin-α взаимодействует сначала с Nup2/NUP50 , а затем с CAS гарантирует направленность ступени цикла высвобождения груза и т.о. предоставляет молекулярный храповик для предотвращения бесполезных циклов35. Более того, освободившись от importin-β, высокая локальная концентрация IBB домена, которая возникает в результате его физического прикрепления к importin-α облегчает высвобождение NLS32. Тот же самый принцип наблюдается с Nup2/NUP50 - сайт связывания с высоким сродством для Nup2/NUP50 на С конце importin-α ведет к высокой локальной концентрации региона, который устраняет NLSs, но это превращается в обратный процесс, когда CAS удаляет со своего места область высокого сродства связывания Nup2/NUP5035. Хотя для простоты все эти взаимодействия можно рассматривать как самостоятельные ступени, но скорее всего это серия взаимодействий на нуклеоплазматической поверхности NPC, участвующих в разборке импортирующих комплексов и рециклинге importin, происходящего концентрированным способом с nucleoporins, такими как Nup1 и Nup2, функционирующими в качестве каркаса для координации этого процесса.
Т.к. importin-β:RanGTP и CAS:RanGTP:importin-α комплексы возвращаются в цитоплазму посредством NPCs, то цитоплазматический RanGAP (вместе с добавочным белком RanBP1, который удаляет RanGTP с importin-β78) стимулирует гидролиз GTP, что высвобождает Ran от importin-β и CAS, высвобождая importins для др. цикла импорта1- 11. Хотя это не продемонстрировано в деталях, но скорее всего высвобождение importin и разборка импортирующих комплексов могут быть скоординированы с помощью nucleoporins, расположенных на цитоплазматической стороне NPC (таких как RanBP2, которые обладают потенциалом связывать RanGAP, importin-β и Ran), связывая разные компоненты и сводя их вместе скоординированным образом.
Конформация свободных CAS, генерируемая вследствие гидролиза RanGTP79, обнаруживает заметные изменения в helicoidal pitch по-видимому, сравнению с CAS:importin-α:RanGTP экспортным комплексом33 (Fig. 5b and Supplementary information S7, S8, ). Когда освобожденные Ran и importin-α оказываются в цитоплазме, CAS принимает закрытую конформацию, в которой остатки на его N конце соединяются с областью вблизи центра молекулы79. Эта закрытая конформация контрастирует с более открытой конформацией, принимаемой в экспортном комплексе, и возможно ригидна, аналогично более ригидной форме, которую importin-β принимает, когда комплексуется с RanGTP9. Безусловно существенные различия обнаруживаются в helicoidal pitch между двумя функциональными состояниями CAS что согласуется с молекулой, имеющей значительную конформационную гибкость, сходную с той, что в importin-β9.
Importance of molecular flexibility
Значительная вариабельность в helicoidal pitch, обнаруживаемая с importin-β и CAS в разных функциональных состояниях (Figs 3,5 и Supplementary information S4, S9,) указывает на то, что эти молекулы гибки9,33,74,75,79-81. Тандемные HEAT повторы в importin-β и CAS могут рассматриваться как сильно поврежденные спиральные пружинки (spring)81 (Box 2), так что небольшие изменения в относительной ориентации последовательных HEAT спиралей могут кумулятивно генерировать существенные изменения в helicoidal pitch33,74. Эти локальные перемещения д. также комбинироваться с шарниро-подобными движениями сегментов, содержащих несколько HEAT повторов9,79.
Молекулярная гибкость позволяет importin-β связывать широкий круг различных партнеров посредством induced-fit механизма, который участвует в изменениях helicoidal pitch. Это можно видеть, напр., когда сравниваются конформации их комплексов с IBB доменом и с RanGTP (Fig. 3c and Supplementary information S4 (movie)). Способ, с помощью которого β-karyopherins закручивается вокруг своих партнеров указывает на то. что молекулы в целом не подходят др. к др. в простых интерфейсах распознавания и вместо этого importin-β и CAS возможно постепенно закручиваются вокруг своего груза. Поэтому гибкость облегчает образование комплексов груз-носитель с большими интимными интерфейсами взаимодействия.
Деформация helicoids, вынужденная оборачиваться вокруг партнеров, как полагают экономит энергию, которая используется для облегчения разборки комплекса9,33,74. В этой модели энергия, сохраняемая в результате деформации helicoid, д. быть контр-сбалансирована энергией, высвобождаемой в результате взаимодействия интерфейсов, чтобы генерировать 'spring-loaded' комплексы, которые д. легко диссоциировать вследствие RanGTP гидролиза
Этот механизм д. приспосабливать крупные интерфейсы (ассоциированные с высокой энергией взаимодействия и следовательно, с высокой специфичностью), т.к. это делает возможными переходы между состояниями, достигаемыми с использованием небольших количеств энергии. Такой механизм может быть полезным для облегчения точного молекулярного распознавания, которое является предварительным условием для тщательно срежессированной серии взаимодействий, необходимых для циклов ядерного транспорта.
Quantitative models of the import cycle
Т.к. концентрации компонентов и константы их связывания известны, то были предприняты усилия разработать количественную модель цикла импорта ядерных белков82-84 или ядерного экспорта85, используя методы приблизительно сходные с теми. что использовались для моделирования метаболических путей. Эти модели были использованы для идентификации некоторых ключевых аспектов цикла и их регулировки и дали некоторую неожиданную информацию. Хотя ядерный транспорт является активным процессом, он часто не может действовать против концентрационного градиента. Вместо этого его роль часто заключается прежде всего в облегчении прохождения избранных молекул между компартментами. Следовательно, скорость транспорта может быть более важной, чем концентрационный градиент, который может накачиваться против и по аналогии с др. хорошо охарактеризованными транспортными системами, такими как K+/Na+-насосы (для которых наибольшее значение имеет равновесие), не всегда может быть успешным. В ядерном транспорте энергия не используется для непосредственного транспорта материала, а вместо этого используется прежде всего для распознавания материала для транспорта и для определения различий между ядром и цитоплазмой. Следовательно, общая скорость транспорта имеет тенденцию быть определяемой скоростью образования комплексов груз-носитель в цитоплазме и диссоциацией их в ядре скорее, чем скоростью прохождения через NPCs.
Один подход смоделировал градиент RanGTP82 и показал, что концентрация ядерной RanGTP приблизительно в 1000 раз больше, чем цитоплазматической RanGTP. Кинетика импорта ядерных белков была воспроизведена в компьютерной модели, базируясь на известных концентрациях, скоростях и константах связывания82. Эта модель учитывала полностью обратимое прохождение комплексов груз-носитель через NPCs, купированное с RanGTP-индуцируемой диссоциацией импортирующего комплекса в ядре82. Однако, увеличение скорости связывания RanGTP с importin-β слишком медленное, чтобы объяснить наблюдаемые скорости транспорта, и д. быть ускорены в соответствии с активной ролью выявленной для FG-nucleoporins на нуклеоплазматической стороне NPC34,35,68.
В др. исследовании83,84, подход к системному анализу базировался на компьютерном моделировании, связанном с кинетическими испытаниями в реальном времени и использовался для изучения importin-β-обусловленного импорта. Эта модель отражала экспериментально установленные скорости и корректно предсказывала, что импорт ограничивается прежде всего концентрацией importin-α и ядерной RanGTP. Увеличение концентрации importin-α увеличивало скорость образования импортирующих комплексов, тогда как увеличение концентрации ядерной RanGTP увеличивало скорость распада импортирующих комплексов. Некоторые неожиданные предсказания модели, которые были подтверждены экспериментально, заключались в том, что увеличение концентрации или importin-β или RanGEF ингибирует скорее, чем стимулирует импорт ядерных белков83. Это ингибирование вызывается изменениями концентрации RanGTP в ядре. показал, что возможно ни концентрация CAS, ни проницаемость NPC для комплексов груз-носитель не являются ограничивающими скорость. Однако, эта модель оказалась неспособной объяснить увеличение скорости ядерного транспорта, наблюдаемое в ответ на увеличение концентрации RanBP1, а также некоторые аспекты транспортного цикла. Более того, каталитическая ступень, такая как участие Nup1 и Nup2, не была включена.
Conclusions
The classic nuclear protein import cycle shows how a spatially and temporally organized series of interactions between macromolecular components can generate a complex biological function. How soluble carriers recognize and release cargoes in the appropriate compartment and how Ran orchestrates these interactions by inducing conformational changes that are facilitated by β-karyopherin flexibility are now well understood. However, more information is still required on the active displacement steps needed to ensure sufficiently rapid dissociation of complexes in both the nucleus and the cytoplasm and on how these steps might be coordinated by nucleoporins. Initial attempts to generate quantitative models of the nuclear protein import cycle have been encouraging, and this approach shows considerable promise for gaining further insight into the molecular mechanisms involved. Moreover, it seems likely that many of the general concepts developed for the classic nuclear protein import cycle can be extended to other nuclear transport cycles, although the details of the molecular recognition steps will be necessarily different and, except for transportin18, their precise structural basis still needs to be determined. However, the way in which some macromolecules are selectively transported through NPCs while others are excluded remains controversial, as does the way in which FG-nucleoporin chains are arranged in the transport channel. Therefore, although great progress has been made in identifying and characterizing the molecular interactions in the soluble phase that drive this nuclear protein import cycle, understanding the precise mechanism of translocation through the NPCs remains an important future challenge.
