Drosophila olfactory memory: single genes to complex neural circuits
Alex C. Keene & Scott Waddell Nature Reviews Neuroscience 8, 341-354 (May 2007) | doi:10.1038/nrn2098
A central goal of neuroscience is to understand how neural circuits encode memory and guide behaviour. Studying simple, genetically tractable organisms, such as Drosophila melanogaster, can illuminate principles of neural circuit organization and function. Early genetic dissection of D. melanogaster olfactory memory focused on individual genes and molecules. These molecular tags subsequently revealed key neural circuits for memory. Recent advances in genetic technology have allowed us to manipulate and observe activity in these circuits, and even individual neurons, in live animals. The studies have transformed D. melanogaster from a useful organism for gene discovery to an ideal model to understand neural circuit function in memory.
Генетические основы обонятельного обучения и памяти изучаются на Drosophila melanogaster уже 30 лет. Существенный успех был достигнут при скрининге мух дефектных в отношении памяти, сегодня существует огромная коллекция мутантов. Белки, обычно кодируемые мутантными генами, участвют в нескольких хорошо изученных клеточных процессах и сигнальных каскадах памяти (rev., see Refs 1-3; Table 1). Однако мало внимания было уделено определению того, как эти белки работают в контексте памяти и в точности в каких нейронах и соотв. нейральных дугах (circuitry) они функционируют. Неизвестно, взаимодействуют ли эти связанные с обучением белки др. с др. или даже, экспрессируются ли они в одних и тех же нейронах. Легкость и доступность генетических манипуляций с D. melanogaster делают её идеальной модельной системой для изучения молекулярных, клеточных и нейральных circuit основ памяти.
Впечатляющие генетические технологии часто разрабатываются на мухах4 с исследовательскими целями и они относительно легко адаптируют наилучшие технологии, разработанные для др. генетически пригодных организмов, чтобы изучать память. Фактически, исследования памяти иногда служили движущими силами для разработки новых генетических инструментов. Это сделало возможным выяснение специфических ролей идентифицируемых нейронов и генов в процессах памяти (Table 2). Недавно в арсенал были добавлены инструменты для прекращения и стимулирования функции генетически идентифицируемых нейронов, а также инструменты и техники для получения зрительных картин и прямой регистрации нейральной активности в специфических нейронах взрослого головного мозга5-18. Использование этой технологии ознаменовало новую эру анализа нейральных circuit памяти D. melanogaster .
D. melanogaster может быть научена связывать ряд (CS) с существенными (US) в нескольких отличающихся обучающих системах19-25. С помощью ряда доступных обучающих подходов многие исследователи учат мух ассоциировать запахами обусловленные стимулы или с карательным шоком или с вознаграждением сахарными безусловными раздражителями (unconditioned stimulus (US)) (Box 1)21, 22, 26. Вследствие таких тренировок память мух позволяет различать повторно запахи избегая или притягиваясь ими. Память плодовых мух сохраняется в течение часов или дней в зависимости от протокола тренировок. Множественные расположенные с разными интервалами тренировочные испытания формируют , которая может существовать несколько дней27. Память, формируемая после одиночных тренировочных испытаний сохраняется несколько часов и может быть представлена, по крайней мере, тремя фазами, не нуждающимися в новом белковом синтезе после тренировки - , и (ARM)28-30. Помимо живой природы обонятельной памяти у насекомых и млекопитающих общая архитектура обонятельной системы насекомых очень сходна с таковой у млекопитающих31.
Простейшая модель ассоциативной обонятельной памяти предполагает, что CS и US информация ассоциирует со специфическими нейронами обонятельных CS путей в головном мозге (Figs 1, 2). В соответствии с этой идеей большинство идентифицированных генов, необходимых для обучения и памяти у D. melanogaster (Table 1), как было установлено, экспрессируются на высоком уровне в нейронах обонятельного пути третьего порядка в the (Figs 1, 2). Современные модели поэтому предсказывают, что память формируется в специфических синапсах mushroom (грибовидных) тел, подкрепляемая совпадающей активностью в модулирующих monoaminergic нейронах, управляемых с помощью US пути26. Используя эту схему мы опишем область быстро развивающегося знания обонятельных CS путей, вместе с нашим пониманием US путей, передающих информацию или об электрическом шоке или вознаграждении сахарозой. Затем рассмотрим механизм CS-US ассоциации и формирования памяти. Закончим нашими недавними находками по стабилизации dorsal paired medial (DPM) нейрон-опосредованной памяти, которые указывают на то, что нервные дуги (circuitry), лежащие в основе обонятельной памяти, более сложны, чем просто CS и US интегрирующиеся нейроны.
The olfactory conditioned stimulus pathway
Запахи определяются с помощью обонятельных рецепторов. Важно, что мы знаем, как обонятельная память хранится в головном мозге. Существенный прогресс был достигнут в этой области вследствие идентификации семейства приблизительно из 62 предположительно обонятельных рецепторных генов у D. melanogaster32-34. Мухи сначала воспринимают запахи с помощью olfactory sensory neurons (OSNs), располагающихся на антеннах и максиллярных щупиках во фронтальной части головы (Fig. 1). Развитие, организация и кодирующие свойства OSNs рассмотрены недавно в др. обзорах35, 36. В целом, OSNs обладают чувствительным к запаху профилем, который предопределяется присутствием одиночного класса обонятельных рецепторов. Кроме того, чувствительность к запаху является временным комплексом и один тип обонятельного рецептора может возбуждаться несколькими запахами и ингибироваться др.37-40. в
OSNs находят специфические гломерулы антенной доли, где они соединяются с проекциями нейронов. Слияние промоторов разных обонятельных рецепторных генов с репортерными кодирующими последовательностями позволили исследователям метить OSNs флюоресцентными репортерными генами и делать видимой организацию этих проекций. Большинство из 1400 D. melanogaster OSNs экспрессирует один из 61 обонятельных рецепторов и обонятельного рецептора 83b (OR83b, ко-рецептора. который необходим для проведения обонятельных рецепторов в сенсорный эпителий41-43. За немногими исключениями стало известно, где OSNs экспрессируют или множественные обонятельные рецепторы44 или даже рецепторы из семейства вкусовых рецепторов45, 46. Тщательные исследования установили, что OSNs, экспрессирующие один и тот же обонятельный рецептор проецируются в одни и те же гломерулы среди приблизительно 50 в антенной доле47-50. Внутри гломерул холинэргические OSNs образуют синапсы с тремя классами нейронов - возбуждающие холинэргические projection neurons (PNs), inhibitory GABA (gamma-aminobutyric acid)-containing local neurons (iLNs) и excitatory cholinergic local neurons (eLNs)51-55 (Fig. 2).
Взрослые мухи имеют около 150 PNs и, следовательно, 3-5 из них, по-видимому, иннервируют каждый из гломерулов антенной доли51. Большинство PN дендритов иннервируют одиночный гломерул, а значит такая анатомия указывает на то, что они получают информацию от одиночного класса OSN, а значит от одного типа обонятельных рецепторов56, 57 (Fig. 2). Некоторые воспроизводящие образы исследования экспрессирующих генетически кодируемые репортеры нейральной активности в OSNs или PNs подтверждают идею, что информация передается непосредственно как от OSNs в PNs. Наблюдение за PN активностью в гломерулах антенной доли с помощью synaptophluorin, чувствительного к pH репортера высвобождаемых синаптических пузырьков58, или с помощью G-CaMP, репортера концентрации внутриклеточного Ca2+59, показало, что дендриты PN и периодические PN соединения отвечают избирательно на один и тот же запах, который активирует их афферентные OSNs13, 14. Однако электрофизиологическая запись целой клетки показывает, что PNs могут быть более широко настроены, чем их афферентные OSNs. Некоторые PNs отвечают на специфические запахи, тогда как др. активируются или ингибируются, почти всеми запахами17. Эти результаты указывают на то, что д. существовать разные классы PNs и/или, что локальные нейроны внутри circuit переносят активности с одного гломерула на др. Этого можно ожидать, т.к. исследования на др. насекомых подтвердили, что гломерулы функционально взаимосвязаны и что сеть антенной доли продуцирует сложные паттерны возбуждения (firing) 60-64.
Антенная доля содержит сложный узел из OSNs, PNs, iLNs и eLNs (Fig. 2). Некоторые iLNs широко разветвляются по всей антенной доле, тогда как др., по-видимому, более локальны54. Следовательно, активность OSNs и PNs может 'распространять' ингибирование по всей антенной доле и тем самым модулировать PN реакции. Активность iLN может объяснить, почему некоторые PNs ингибируются в ответ на воздействия запаха17. Было предположено, что входящие ингибирующие сигналы локальных нейронов умножают различия между реакциями PN на запахи54. В дополнение к локальному опосредованному нейронами ингибированию, PNs формируют периодические соединения внутри гломерул13 и эти соединения могут оказывать непосредственные возбуждающие эффекты на соседние PNs. Более того, в недавнем исследовании описаны eLNs, которые ветвятся по всей антенной доле55. Было показано. что eLNs чувствительны к некоторым запахам и, следовательно, они скорее всего передают косвенно возбуждающие эффекты от OSNs на PNs, или от PNs на PNs. Поразительно, возбуждаемые запахами PN реакции могут быть обнаружены в гломерулах в отсутствие прямых OSN входов. Эти находки указывают на то, что антенная доля использует 'lateral excitation' в дополнение к 'lateral inhibition' чтобы оформить реакции на запахи и что подобно др. насекомым обонятельное кодирование обонятельной доли у D. melanogaster более сложное, чем прямое OSN-PN соединение. Чтобы понять, как OSNs, PNs, iLNs и eLNs функционально взаимосвязаны, необходим вид с высоким разрешением соединений между разными классами нейронов в антенной доле. Одновременные электрофизиологическая стимуляция и запись активности нейронов и оптическая запись активности антенной доли также д. помочь расшифровать функциональный код запахов.
У некоторых насекомых синаптическая пластичность в антенных долях также была изучена65-69. Большинство работ на D. melanogaster сконцентрировано на пластичности mushroom тел, но одно исследование по передаче изображения в живую с экспрессией synaptophluorin в PNs выявило кратковременные изменения в реакции PN на запахи. Используя , в исследование наблюдалось непосредственно вызванная запахом нейральная активность в антенных долях16. Было установлено, что после воздействия запаха, сочетаемого с шоком, запах вызывал реакцию в большем количестве гломерул антенной доли16. Было предположено, что синаптическая пластичность антенной доли может вносить вклад в поведенческую память в первые несколько мин. после после тренинга, хотя это ещё предстоит подтвердить. Др. исследование показало изменение в синтезе белка в антенной доле Ca2+/calmodulin-dependent kinase II (CaMKII) в долговременной памяти70. Важно бы удостовериться в уместности пластичности антенной доли для обонятельной памяти и для точного понимания, какие нейроны в антенной доле способны к модификациям благодаря опыту (experience)69.
Projection neurons connect to mushroom bodies and the lateral horn. Генетические инструменты также в значительной степени нацелены на изучение анатомии нейронов более глубоких слоёв обонятельного пути. Репортеры в купе с утонченной генетической техникой (такой как FLP-опосредованная рекомбинация, FLP-FRT71 и мозаичный анализ со способными к репрессии клеточными маркерами72 (MARCM)) (Table 2) сделали возможным анализ на уровне одиночных нейронов PNs53, 73, 74. PNs передают обонятельную информацию из антенной доли в два места головного мозга - mushroom тела и латеральные рога51, 57 (Figs 1, 2). PNs организованы. по крайней мере, в два разных нервных тракта - внутренний (i) и медиальныйl (m) antennocerebral tract (ACT). PNs в iACT формируют синапсы в mushroom body calyx и лптеральных рогах, тогда как PNs в mACT обходят mushroom body calyx и идут прямо в боковой рог51. Некоторые PNs в mACT являются ингибирующими и иннервируют множественные гломерулы, и следовательно, исходя только из соединений, ожэидается, что они будут активироваться (или ингибироваться) многими или даже всеми запахами54, 74, 75.
Разделение проекций PN на mushroom тела и боковые рога представлено очевидной бифуркацией процессинга запахов на анатомическом уровне. Недавние элегантные исследования мечения одиночных PNs проливают свет на из соединение с латеральными рогами и mushroom body calyx. PNs, которые иннервируют один и тот же гломерул в антенной доле имеют сходные паттерны проекций в боковых рогах, указывают на то, что соединения в латеральных рогах также стратифицированы53, 73, 74. Кроме того, два сообщения дали детальное описание внутренне присущих нейронов латеральных рогов, которые ветвятся в пласте латерального рога, который перекрывается с зонами вхождения PN74, 76. PNs, по-видимому, иннервируют широкие зоны дендритов mushroom body calyx и mushroom body и широко распределены в этих зонах76, 77. Это согласуется с идеей, что Kenyon клетки интегрируют информацию о запахах.
Почему PNs передают обонятельную информацию из антенных долей как в mushroom телам, так и латеральным рогам? Считается, что латеральные рога представляют независимый от опыта путь, а грибовидные тела обеспечивают мух нервной сетью, чтобы кодировать обонятельный опыт (experience)78. Кормление вновь вылупившихся личинок цитостатическим веществом hydroxyurea фармакологически устраняет mushroom тела79 (также как и некоторые локальные нейроны и PNs антенной доли51) у взрослых мух. Такие мухи без mushroom тел неспособны к запоминанию запахов, но неожиданно они сохраняют способность избегать определенных концентраций запахов79. Следовательно, грибовидные тела не существенны для наивного избегания запахов. Считается, что наивное избегание нуждается в функциональных PNs. Блокирование PN синаптической трансмиссии кодируемым трансгеном токсином tetanus 182 (TNT; расщепляет белок синаптических пузырьков synaptobrevin и тем самым блокирует высвобождение нейротрансмиттеров) нарушает управляемое запахами поведение78, указывая тем самым, что соединения PN-lateral horn могут быть жизненно важными. Однако мнение, что наивные реакции на запахи исключительно обеспечиваются с помощью PN-lateral horn пути, возможно является чрезмерным упрощением. В одном из исследований установлено, что привлекающая и отталкивающая обонятельная информация по-разному представлена в латеральных рогах и mushroom телах80. Блокирование исходящих из mushroom тел сигналов нарушает управляемое запахами привлечение, но не отталкивание.
Odour is coded in the mushroom bodies as activity in a few Kenyon cells. Организация связей PN-mushroom body изучена недостаточно. Поэтому Kenyon клетки названы, исходя из домена их аксональных проекций в долях грибовидных тел (Fig. 3) скорее, чем исходя из полей дендритов в calyx. Грибовидные тела содержат приблизительно 2,500 Kenyon клеток на сторону головного мозга и сегодня они отнесены к α β α 'β ' и γ -подазделениям81, 82, в зависимости от того, где локализуются их проекции внутри долей mushroom тел. Однако исследования enhancer-trap показали, что возможно существует дальнейшее подразделение долей83. В самом деле, одно из исследований84 описывает дополнительные подразделения additional subdivisions (α c, β c и β '') базируясь на иммунохимии для предполагаемых нейротрансмиттеров aspartate, glutamate и taurine. Важно установить биологическое значение этих подразделений.
Функциональное значение соединений PN-mushroom body и организации нейронов mushroom тел каким-то образом зависит от того, как запахи представлены в PNs. Если запахи представлены как меченные линии PN активности, тогда точное проведение PNs к нейронам mushroom тел д. четко передавать информацию. Это д. означать, что данный запах воспроизводимо обрабатывается с помощью сходного набора нейронов mushroom тел у разных животных. Однако кажется наиболее вероятным, что кодирование запаха более комбинаторно и динамично и, следовательно, соединения только вряд ли объяснят репрезентацию запахов в Kenyon клетках. Личинки D. melanogaster имеют более простую обонятельную систему, чем взрослые мухи, но она всё ещё способна к обонятельной памяти85-88. Личинки обладают лишь 21 OSNs, которые проецируются в 21 гломерул антенной доли56, 89, 90. Личиночный mushroom body calyx также обладает четкой гломерулярной структурой и каждый из приблизительно 28 calycal гломерул иннервируется одним или двумя PNs90, 91. Личиночные Kenyon могут быть разбиты на три четких класса на базе архитектуры их дендритов: uniglomerular, biglomerular или те, что ветвятся более диффузно в крупных доменах calyx90, 91. Описаны сходные типы взрослых Kenyon клеток92, а прекрасная анатомическая работа описывает крупные подобные гломерулам образования холинэргических PN окончаний во взрослых mushroom body calyx, перемешанных с GABA-содержащими и редкими peptidergic и monoaminergic окончаниями93. Следовательно, грибовидные тела личинок и взрослых могут обрабатывать обонятельную информацию сходным параллельным образом. Каждый запах может быть представлен индивидуально, также как и интегрированным способом с др. пахучими воздействиями. Такая организация может иметь целью, сделать мух способными отличать индивидуальные запахи внутри сложных смесей.
Нейральная связь, следовательно, предсказывает, что запахи редко представлены в mushroom телах, а некоторые исследования по оптическому имеджингу, (как и некоторые исследования на др. насекомых94, 95) подтверждают это мнение. Впервые в D. melanogaster live imaging исследовании12, с использованием генетически-кодируемого ratiometric Ca2+ индикатора cameleon96, mskj предположено, что запахи выявляют стереотипическую активацию PNs в определенных регионах calyx грибовидного тела. Сходные запахами стереотипированные паттерны притока Ca2+ наблюдались в клеточных телах нейронов грибовидного тела15 при использовании G-CaMP59, указывая тем самым. что запахи фактически не активируют специфические субнаборы Kenyon клеток. Эти данные указывают на то, что независимо от того, как поступает сюда информация, индивидуальные запахи ммогут быть представлены как активности в редких массивах Kenyon клеток, и это убеждение является центральным в современных моделях памяти запахов (см. ниже). Хотя это является ценным замечанием, что хотя запахи и могут пробуждать активности в редких наборах клеточных тел нейронов грибовидного тела, и вообще в дендритах15, однако неясно, как информация представлена в долях mushroom тел, поскольку неизвестны степень взаимосвязей нейронов грибовидных тел с помощью щелевых соединений и/или химических синапсов. Нейроны грибовидных тел, которые обладают разными паттернами ветвления дендритов, распределенные в calycal зоназ, по-видимому, вносят вклад во все доли грибовидных тел, это указывает на то, что запахи также д. быть распределены в подразделениях долей76, 92. Наблюдение вживую реакций возбужденных запахом Kenyon клеток в долях грибовидных тел подтверждает более распространенную активацию Kenyon клеток, чем imaging клеточных тел97. Однако относительно слабое пространственное и временное разрешение, обеспечиваемое optical imaging, позволяет предположить, что наблюдаемые активности в долях грибовидных тел являются результатом Kenyon клетками управляемых локальных петель обратной связи нейрональной активности.
The unconditioned stimulus pathways
Dopamine and octopamine distinguish between an aversive and an appetitive US. Наиболее широко используемые парадигмы обонятельного обучения используют или карательный электрический шок или вознаграждение сахарозой в качестве US (Box 1). По прямой аналогии с др. организмами, US-активрованные сенсорные пути, как полагают, стимулируют моноаминэргические модуляторные нейроны26, 98. Имеющиеся доказательства указывают на то, что dopaminergic (DA) нейроны представляют усиливающие свойства вызывающих отвращение US, в то время как усиливающие свойства привлекающих US передаются посредством octopaminergic neurons (OA)26. Более того, необходимы исходящие из грибовидных тел сигналы для возвращения памяти как об отталкивающих, так и привлекающих стимулах26, 99, указывая тем самым, что оба типа памяти могут быть представлены нейронами грибовидных тел и что модулирующие пути US д. их пресекать.
Сенсорный механизм наказания электрическим шоком неизвестен. Однако сахар ощущается вкусовыми gustatory receptor neurons (GRNs) на тарзусах (feet) и proboscis (mouthpiece) мух100, 101. Идентификация генов gustatory receptor (GR)102, 103 делает возможной генерацию специфических GR-GAL4 трансгенных мух, которые позволяют метить и манипулировать индивидуальными и группами GRNs. GRNs ко-экспрессируют группы вкусовых рецепторов, которые чувствительны к сладким. горьким, кислым или соленым стимулам и проецируют свои аксоны в suboesophageal ганглий, где они, по-видимому, разветвляются в дискретные слои104-106 и могут непосредственно контактировать с модулирующими нейронами.
Гены, кодирующие моноаминовые биосинтетические энзимы, составляют основу для манипуляций с модулирующими нейронами, передающими усиливающие свойства US сигналов. Tyrosine hydroxylase превращает tyrosine в L-3,4-dihydroxyphenylalanine, который затем превращается в dopamine с помощью dopamine decarboxylase (DDC). Мутации в гене tyrosine hydroxylase (pale) и Ddc генах являются летальными или или дают больных мух, которые не пригодны для анализа поведения107, 108. Однако промоторная область гена TH, слитая с GAL4 кодирующей последовательностью TH-GAL4 может быть использована для экспрессии трансгенов эффекторов в DA нейронах109. Напр., продемонстрировано, что DA нейроны необходимы исключительно шоком усиливаемой обонятельной памяти, тогда как OA необходимы для подкрепляемой сахарами обонятельной памяти26. Используя TH-GAL4 для управления доминантным чувствительным к температуре блокатором синаптической трансмиссии, кодируемого shibirets1 трансгеном5, было установлено, что синаптическая передача от DA нейронов необходима во время приобретения негативно усиливаемой памяти, но безразлична для позитивно усиливаемой памяти26.
DA нейроны иннервируют широкие области головного мозга, включая грибовидные тела109, 110, и хотя ещё предстоит подтвердить, что DA нейроны. иннервирующие гибовидные тела, являются теми, которыеs имеют отношение к памяти, функциональный imaging подтверждает идею, что они передают усиливающие свойства вызывающих отвращение US. В исследовании110 использовали Ca2+ репортер cameleon96 для оптической записи активности в проекция DA неронов в грибовидные тела. Такие DA проекции реагировали слабо на запахи, но сильно на шок. Важно отметить, что DA выполняют плейотропную роль в головном мозге111-115, и поэтому можно утверждать, что DA являются скорее разрешающими для отвращающих условных рефлексов, чем каузативными. Недавнее новое исследование на личинках было посвящено этому вопросу11. Светом активируемый катионный канал channelrhodopsin 2 (Ref. 9) был трансгенно добавлен в DA нейроны и было продемонстрировано, что у личинок может быть выработан условный рефлекс отвращения с помощью замещения карательных US на прямую стимуляцию DA нейронов (светом). Сл возможно, что передача сигналов нейронами DA является достаточной для передачи вызывающих отвращение US. в
OA также синтезируется из тирозина с помощью двухступенчатой реакции. Тирозин сначала превращается в tyramine с помощью tyrosine decarboxylase (кодируемой Tdc2), а tyramine с помощью beta-hydroxylase (кодируеомый Tbh) превращается в OA. OA-дефицитные Tbh мутантные мухи жизнеспособны и обнаруживают специфические дефекты подкрепляемой сахарами памяти26. Дефекты памяти могут быть устранены путем индукции хитшоковым промотором управляемого Tbh трансгена у взрослых мух или с помощью OA кормления перед тренировкой; это указывает на то, что OA возможно функционируют остро в памяти. Прекрасным кандидатом на роль связанных с памятью OA нейронов могут быть те, что напоминают OA VUMmx1 нейрон пчел98. VUMmx1 ветвится в suboesophageal ганглии, где он может непосредственно управлять чувствительными к сахару GRNs. VUMmx1 у пчел проецируется билатерально в антенные доли, грибовидные тела и латеральные protocerebrum. В классическом исследовании VUMmx1 было показано, что вместо активации в награду сахаром электрическая стимуляция VUMmx1 может замещать условные рефлексы, вызываемые презентацией сахара у пчел88.
Иммуногистохимический анализ с помощью OA-антител идентифицировал VUM-подобные нейроны у D. melanogaster116. К сожалению, Tbh-GAL4 трансгенные мухи сегодня недоступны и поэтому невозможно визуализовать или манипулировать функцией OA нейронов. используя генетическую технику тем же способом, что и манипуляции с DA TH-GAL4 нейронами (Ref. 109). Однако, Tdc2-GAL4 мухи могут быть использованы для экспрессии репортерных и эффекторных трансгенов в tyraminergic и OA нейронах117, а мечение отдельных клеток с использованием Tdc2-GAL4 драйвера может быть пригодно для изоляции D. melanogaster VUMmx1-подобных нейронов. Как и в случае DA нейронов в условных рефлексах отвращения, было тестировано, являются ли OA в основном пермиссивными для создания условных рефлексов или представляют инструктивные US сигналы11. Channelrhodopsin 2 экспрессировался с помощью Tdc2-GAL4, и было продемонстрировано, что у личинок могут быть привлекательные условные рефлексы путем замещения вознаграждающих US прямой стимуляцией OA (и tyraminergic) нейронов. Следовательно, OA нейроны возможно передают усиливающие свойства вызывающих желания US.
Наше понимание усиливающей monoamine функции в памяти может быть подкреплено изучением monoamine рецепторов. Важным вопросом в этой области является, как память о отвращении и привлекательности представлена внутри грибовидных тел. Возможно, что специфические субнаборы Kenyon клеток ответственны за разные модулирующие monoamines. Или DA и OA нейроны могут активировать разные синапсы одних и тех же Kenyon клеток26, 118. DA и OA рецепторы были идентифицированы, как экспрессирующиеся в грибовидных телах, и при низком разрешении они кажутся локализованнными по всем долям грибовидных тел119-121. Напротив, DA нейроны не случайно иннервируют целиком грибовидные тела, а плотно иннервируют ножку alpha-доли, кончик beta-долей и heel область110 (Fig. 3). Сходным образом, OA нейроны иннервируют дискретные области mushroom body calyx и gamma-долю116. Было бы интересно определить управляют ли места иннервации monoaminergic нейронами лежащей в основе организацией отталкивающей и привлекающей обонятельной памятью.
Mushroom bodies are molecular memory centres
На сегодня грибовидные тела являются предпочтительной областью головного мозга для CS-US ассоциаций, хотя, как упоминалось ранее, некоторые исследования указывают, что антенные доли также могут участвовать. Первым доказательством роли грибовидных тел D. melanogaster в обонятельной памяти получены в исследовании коллекции линий мутантных мух с различными анатомическими дефектами головного мозга122. Мухи с дефектными грибовидными телами ощущают запахи и шоки, но не ассоциируют эти стимулы (for further discussion, see Ref. 122). Вслед за морфологическими мутантами головного мозга, фармакологическое устранение грибовидных тел и немногих нейронов антенных долей подтвердили мнение, что грибовидные тела необходимы для ассоциативной обонятельной памяти79. в
Первые два гена были идентифицированы при нецеленаправленном скрининге дефектов обучения и памяти, были открыты два компонента cyclic AMP (cAMP) каскада - dunce (dnc), кодирующий cAMP phosphodiesterase123-127 и rutabaga (rut), кодирующий type I Ca2+/calmodulin-stimulated adenylyl cyclase128, 129. Удивительное совпадение с анатомическими исследованиями, локализация белков DNC130 и RUT 131 (в дополнение к protein kinase A subunits81, 132 и недавно RADISH133) в меченных Kenyon клетках грибовидных тел. RUT cyclase привлекла наибольшее внимание в исследованиях памяти, т.к. она может правдоподобно регистрировать совпадающие активности CS-US в специфических Kenyon клетках благодаря притоку Ca2+ вследствие PN-управляемой деполяризации и связывания monoamine с G-protein-coupled рецепторами. Селективная экспрессия rut кДНК в грибовидных телах, даже только у взрослых, восстанавливает память дикого типа у rut мутантных мух134-136, указывая тем самым, что rut-зависимая пластичность в MBs достаточна для обонятельной памяти. Более того, специфическая экспрессия постоянно активного Galphas в Kenyon клетках устраняла обонятельное обучение137, подтверждая. что обучение нуждается в передаче сигналов G белка в этих клетках. Моноамины, которые передают усиливающие свойства US являются наиболее очевидными внеклеточными лигандами для стимуляции связанных с памятью G-protein-coupled рецепторов, а активность RUT и как упоминалось выше, DA и OA рецепторы, как известно экспрессируются в грибовидных телах119-121. Понимание их функции и организации очень важно.
Некоторые др. интересные молекулы, как было показано, экспрессируются в грибовидных телах и необходимы для обучения и памяти. Сюда входят volado alpha-integrin138, fasciclin II , адгезивная молекула нервных клеток139, и молекулы. контролирующие транспорт и трансляцию мРНК, кодируемые pumilio, oskar и eIF-5C генами140. Эти и др. идентифицированные гены предоставляют важный подход к молекулярным процессам памяти. Однако сегодня эта область нуждается в выходе за пределы инициальной идентификации генов и к началу понимания, как, где и когда продукты этих генов функционируют в контексте памяти. Важно, установить. экспрессируются ли эти связанные с обучением белки в тех же самых, самостоятельных или перекрывающихся наборах Kenyon клеток.
Находка. что большинство связанных с памятью генов строго экспрессируется в грибовидных телах ведет к предположению, что они затрагивают память, функционируя здесь. Однако большинство генов экспрессируется также в др. регионах головного мозга и в большинстве случаев важность экспрессии в грибовидных телах для создания памяти формально не подтверждена. Фактически уже в ранних исследованиях было предположено, что экспрессия dnc вне грибовидных тел важна для кратковременной памяти, тогда как экспрессия в грибовидных телах необходима для долговременной памяти141. В этом исследовании использовались генетические повреждения локуса dnc и впервые были описаны регион-ограниченные дефекты экспрессии для памяти мух. Эксперименты по региональной потере функции оказались важными, чтобы ответить необходимы ли гены в грибовидных телах или их связанная с памятью функция располагается в др. месте. Трансгенно кодируемая RNA interference142 представляет собой пригодный инструмент для такого анализаl и недавно была использована для демонстрации потребности гена tequila во взрослых грибовидных телах для долговременной памяти143. в
Как активность грибовидных тел связана с памятью? Мощным подходом для изучения активной роли Kenyon клеток является селективное блокирование их выхода, используя upstream activating sequence (UAS)-shibirets1 трансгена5, и тест, является ли нейротрансмиссия из этой группы Kenyon клеток необходимой для памяти. Используя этот метод выводы Kenyon клеток первоначально показались безразличными для приобретения и хранения памяти, но они необходимы для восстановления отвращающей и привлекающей обонятельной памяти2, 26, 144-146. Однако большинство грибовидных тел управляет только меткой фракции Kenyon клеток, и были предприняты лишь незначительные усилия определить количественно степень экспрессии в каждой линии. Два широко используемых GAL4 драйверов грибовидных тел экспрессируются примерно в трети Kenyon клеток146, 147. Экспериментаторы обычно используют множественные GAL4 драйверы, чтобы быть уверенными в их тканевой специфичности и сегодня мало известно, перекрываются ли нейроны, с которыми производятся манипуляции. Большинство широко используемых GAL4 драйверов грибовидных тел преимущественно экспрессируется в нейронах alphabeta и/или gamma-нейронах грибовидных тел, но не alpha'beta' нейронах99. Используя GAL4 драйверы со значительным перекрыванием с alpha'beta' нейронами, чтобы экспрессировать UAS-shibirets1 трансген, мы установили, что стабильная память нуждается в нейротрансмиссии от alpha'beta' нейронов грибовидных тел во время и после тренировки99. Неожиданно мы не обнаружили роли alpha'beta' нейронов во время восстановления памяти средней продолжительности99 , тогда как в соответствии со всеми предыдущими исследованиями передача сигналов alphabeta нейронами является жизненноважной2, 26, 144-146. Следовательно, alpha'beta' и alphabeta Kenyon клетки функционально различны и эти нейральные субнаборы грибовидных тел последовательно вовлекаются в формирование, стабилизацию и восстановление памяти99 (мы обсудим эти данные ниже в связи с dorsal paired medial (DPM) нейронами). Важно, что эти находки указывают на то, что необходимы более глубокие исследования анатомии грибовидных тел и что это является критическим для понимания того, как функционируют относящиеся к делу клеточные сигнальные каскады в соотв. Kenyon клетках.
Тем не менее мы верим, что существующие доказательства согласуются с мнением, что рефлекторные дуги (circuits) грибовидных тел действуют как детекторы совпадений для обонятельной памяти. Потребность в выходах alphabeta нейронов грибовидных тел во время восстановления памяти указывает на то, что грибовидные тела являются важной частью нейральных circuitry, необходимых для восстановления памяти2, 26, 99, 144-146. Возможно. что воздействие запаха вызывает поведенческую реакцию у мух, которая зависит от интеграции между путем грибовидных тел и путем латеральных рогов. Если животное имело прежде полноценное знакомство с запахами, но путь грибовидных тел доминирует, в то время как, если мухи являются nai"ve , то этот путь м. иметь незначительный эффект.
Mushroom body-associated DPM neurons
Грибовидные тела не явно контактируют с одной определенной областью головного мозга, такой как premotor область. Вместо этого они посылают информацию во многие окружающие и плохо охарактеризованные области. Некоторые типы ассоциированных с грибовидными телами нейронов, которые проецируются в окружающий нейропиль были идентифицированы с использованием и enhancer trapping57. Доступность специфических трансгенных линий, экспрессирующих GAL4 в этих нейронах позволяет временно ингибировать синаптическую передачу из этиз нейронов и протестировать их функцию в памяти. мы осуществили такие эксперименты, чтобы проанализировать нейроны, ассоциированные с грибовидными телами, которые были названы DPM нейронами148.
DPM нейроны (Fig. 4) проецируются исключительно в доли грибовидных тел и основание peduncle148. DPM нейроны были идентифицированы как место экспрессии предполагаемого нейропептида , кодируемого геном amnesiac (amn)148-151. Экспрессия amn в DPM нейронах мутантных amn мух восстанавливает память об отталкивающих и привлекающих запахах, подтверждая тем самым, что DPM нейроны являются критическим местом действия amn в головном мозге для стабилизации обеих форм обонятельной памяти148, 152-154. Более того, временное блокирование синаптической передачи от DPM нейронов с помощью UAS-shibirets1 вызывает amn-подобный фенотип памяти148. Поразительно, нейротрансмиссия от DPM нейронов несущественна во время тренировок и тестирования, но блокирование выходов на 30 мин. во время сохранения нарушает память153-155. Следовательно, DPM нейроны обладают пролонгированной, однако временной ролью в стабильности обонятельной памяти. Мы полагаем, что DPM нейроны являются воспринимающими и передаточными в грибовидные тела и являются циклической обратной связью (recurrent feedback)
Воспроизведение нейральной DPM активности и синаптической трансмиссии155 с G-CaMP59 и synaptophluorin58 репортерами у мух выявило, что запахи и шок вызывают реакцию в нейронах DPM155. Спустя 30 мин после совместного воздействия запаха и шока, запахом вызываемая реакция в DPM нейронах повышалась параллельно с временной потребностью в DPM нейронах для стабильности памяти. Следовательно, нейроны DPM сообщают об энграмме (memory trace) . Поразительно, что эти отпечатки памяти (memory trace) являются специфическими для предыдущего одновременного воздействия шока и запаха и они обнаруживаются только в проекциях DPM нейронов в альфа-доли вертикальных грибовидных тел. Кроме того, alpha-доли и alpha' доли не формируют memory trace у amn мутантов, но отпечатки памяти ммогут быть восстановлены за счет избирательной экспрессии amn трансгена в DPM нейронах. Это указывает на то, что AMN функция в DPM нейронах необходима для развития memory trace.
Model for olfactory memory. Наша предпочтительная интерпретация этих imaging данных заключается в том, что DPM нейроны сообщают об изменениях синаптической силы в Kenyon клетках грибовидных тел (Fig. 5) и что обратная связь посредством DPM нейронов с соотв. Kenyon клетками является существенной для развития стойких синаптических изменений в этих клетках. Мы полагаем, что DPM нейроны отвечают на все тестируемые запахи, т.к. они являются рецептивными по отношению к Kenyon клеткам. Т.к. запахи, по-видимому, представлены как разбросанные паттерны возбужденных Kenyon клеток, то мы предполагаем, что образование условных рефлексов у мух на один запах и шок специфически индуцируют синаптическую пластичность в выводящих синапсах этих чувствительных к запаху Kenyon клеток. Повторное воздействие на мух запахами (напр., во время тестирования) следовательно, активирует только эти ранее модифицированные Kenyon клетки, вызывая повышенную реакцию в DPM нейронах. Сегодня мы полагаем, что эта модель является простейшим объяснением развития специфической к запахам memory trace в DPM нейронах, в противоположность синапс-специфическим постсинаптическим изменениям самих DPM нейронов155.
Как DPM нейроны вносят вклад в процесс памяти? Данные по synaptophluorin155 указывают на то, что DPM нейроны являются также передающими в грибовидные тела и наши поведенческие тесты строго указывают на то, что они предоставляют существенные память стабилизирующие импульсы148, 152-155. Наши недавние находки, что передача от alpha'beta' Kenyon клеток необходима во время и после тренинга99 находятся в согласии с идеей, что они передают сигналы DPM нейронам, которые передают сигнал обратно Kenyon клеткам. Кроме того, мы также установили, что DPM нейроны, которые были генетически модифицированы так, что большинство их проецируется к alpha'beta' долям грибовидных тел, сохраняют свою функцию154. Следовательно, эти находки согласуются с функциональной связью между alpha'beta' нейронами грибовидных тел и DPM нейронами в развитии памяти.
Изучение DPM нейронов также важно для организации памяти в Kenyon клетках. В то время как DA и OA нейроны дифференциально участвуют в негативном и позитивном подкреплении памяти11, 26, передача грибовидными телами необходима для восстановления памяти как отталкивающей, так и привлекающей26, 99. Продукция DPM нейронов и нейротрансмиссия alpha'beta' клетками грибовидных тел является критической во время периода между тренировкой и тестированием ждя стабильности памяти как на сладости, так и на шок99, 153-155. Следовательно, возникает существенное перекрывание между нейральными дугами (circuit) для памяти на привлекающие и отталкивающие запахи. Было бы очень важно понять уровень, на котором эти памяти отличаются по этим рефлекторным петлям (circuits).
Как память стабилизируется на молекулярном уровне? К сожалению, наше понимание молекулярных процессов ограничено. DPM нейроны ко-экспрессируют amn и холинергический нейрон-специфический маркер, указывая тем самым, что DPM нейрогены могут использовать AMN пептиды и ацетилхолин в качестве ко-трансмиттеров153. Субклеточная локализация ацетилхолиновых рецепторов в грибовидных телах не была описана, но ацетилхолин может выявлять реакции в Kenyon клетках156 и может быть высвобожден в долях грибовидных тел DPM нейронами (и на дендритах грибовидных тел в calyx с помощью PNs). Следовательно, nicotinic и muscarinic-типа ацетилхолиновые рецепторы157-160, как и рецепторы для предполагаемых AMN пептидов, могут вносить вклад в DPM-зависимую пластичность. Благодаря описанной гомологии AMN с pituitary adenylate cyclase-activating peptide (PACAP) млекопитающих можно предположить, что AMN пептиды стимулируют cAMP каскад устойчивым способом150. Однако расшифровка роли amn в памяти требует дальнейших исследований, а функция и локализация AMN и ацетилхолиновых рецепторов может нас просветить.
Conclusions and future perspectives
Current data suggest that mushroom bodies are a key site of memory processing (Fig. 5). Kenyon cells receive olfactory CS input from cholinergic PNs and US input from modulatory monoaminergic neurons. Coincident activity probably triggers cAMP synthesis and synaptic plasticity in the relevant Kenyon cells. It is possible that ongoing activity in the alpha'beta' Kenyon cells after training in turn drives DPM neurons that feedback onto Kenyon cells and stabilize the memory traces in the relevant alphabeta cells. We expect there to be further complexity to this simple model.
The field now has a veritable feast of mutant flies (Table 1) to pick apart the molecular mechanism of memory. However, we need to determine the neurons in which they function, how these pathways interact and how they are engaged by interneuronal signals to engender memory. Nevertheless, this line of study has the potential to lead us to a holistic understanding of memory formation, storage and retrieval.
Increased application of live imaging techniques to D. melanogaster memory research will undoubtedly herald important and unexpected information. Imaging approaches have the obvious benefit of allowing simultaneous recording from large ensembles of neurons, and the small fly brain provides the added advantage that one can image almost the entire network at once. By contrast, the small size of the fly brain is likely to impede ensemble recording with multi-channel electrodes. However, for some applications such as recording from single DPM neurons, ensemble properties are not so important and the detail provided by electrical recording may be a distinct advantage. Either way, functional physiology of the nervous system provides another dimension to our analysis and fills the considerable gap between a dysfunctional gene and behavioural memory performance.
Newly developed genetically-encoded reporters of neural activity and cell signalling cascades (such as cAMP161) are instantly applicable to D. melanogaster memory research because it is trivial to express them in defined neural subsets. In fact, it is now possible to transgenically express one gene (for example, an optical reporter) in one set of neurons and a different gene (such as an effector) in another set, in the same fly162. This technology permits us to test functional neural circuit connectivity by stimulating, or switching off, a set of neurons while imaging activity in other neurons163. Eventually, we should be able to mimic a learning event in genetically-defined neurons in the absence of sensory stimuli. Clever application of these tools (Table 2) coupled with our large collection of memory-defective mutants (Table 1) should revolutionize our understanding of fly memory. It will be very interesting to functionally image the brains of the memory mutant flies to see if they are all 'stupid' for a similar reason
