EST | OBP | OMP | VNO

Buck and Axel [1] идентифицировали семейство генов odorant receptor (OR) , исходя частично из наблюдения, что OR гены экспрессируются в обонятельном эпителии. Впоследствии дополнительные OR гены были распознаны среди геномных последовательностей по их сходству с первым набором идентифицированных OR генов [2,3], и по присутствию определенных предсказуемых белковых мотивов [1,4]. Недавно стали доступны полные геномные последовательности для ряда видов млекопитающих, что позволило произвести межвидовое сравнение полных репертуаров OR генов. Анализ опубликованных геномов подтвердил, что исходные подсчеты размеров репертуара OR генов млекопитающих в 100 генов сильно недооценены. В самом деле сегодня полагают, геномы млекопитающих несут 800-1400 OR генов [5-10], которые обычно локализованы в кластеры генов и находятся во многих хромосомах. Приблизительно 3% от всех генов кодируют обонятельные рецепторы, OR гены являются самым крупным семейством в геноме млекопитающих. l

Кстати OR гены млекопитающих остаются в основном orphan рецепторами. Фактически, вплоть до недавнего времени, не производилось систематического изучения экспрессии предполагаемых OR генов млекопитающих в обонятельном эпителии [7,11]. Более того, экспрессия некоторых предполагаемых OR генов млекопитающих выявлена только в не-обонятельных тканях , особенно в семенниках [12-14]. Эти наблюдения открывают возможность, что субнабор предполагаемых OR генов может быть не обонятельными рецепторами, а выполнять др. функции. Возможно OR гены могут выполнять функции и помимо распознавания запахов, напр., для хемотаксиса спермиев [15].

Недавно Zhang et al. [16] изучали экспрессию почти всех предполагаемых OR генов у мышей, используя микромассивы ДНК [16]. Большинство (~ 80%) предполагаемых OR генов мышей подтвердило свою экспрессию в обонятельном эпителии, но субнаборы были найдены и экспрессирующимися только в не-обонятельной ткани и их функциональное значение сегодня под вопросом [16]. У людей неизвестно, сколько предполагаемых OR генов экспрессируется в обонятельном эпителии и следовательно, сколько участвует в связывании запахов. Более того, прогнозируемый репертуар OR генов человека включает почти 600 псевдогенов [5] и остается неясным, сколь часто они экспрессируются. Т.к. обонятельные сенсорные нейроны, как полагают, экспрессируют только один функциональный OR ген, и если эти псевдогены обычно экспрессируются в обонятельном эпителии, то большая пропорция нейронов тогда должна экспрессировать один нефункциональный ген или ко-экспрессировать функциональный и нефункциональный OR гены [17].

Недавнее исследование [14] использовало expressed sequence tag (EST) данные и результаты изучения микромассивов по всему геному, чтобы выяснить экспрессию OR генов человека в обонятельном эпителии и некоторых не-обонятельных тканях. Однако, этот анализ оказался ограниченным из-за нехватки имеющихся данных, включая пристрастия и неаккуратность баз данных EST и неполные выборки OR генов в микромассивах всего генома человека (они включали probe-sets лишь для 356 прогнозируемых OR генов и псевдогенов). Более того, микромассивы всего генома не были специфически оптимизированы для измерения экспрессии OR генов, так что многие зонды могли быть чувствительны к перекрестной гибридизации с др. OR генами [14]. И в самом деле, анализ авт. probe-set последовательностей показал, что экспрессируются 217 OR генов и псевдогенов человека [14].

Нами получны новые микромассивы с зондами для почти всех OR генов человека.

Results and discussion

Чтобы измерить экспрессию OR генов человека, экстрагировали тотально РНК из 3-х выборок обонятельного эпителия людей, полученных National Disease Research Interchange) [18] в течение 6 ч после смерти донора. Мы подтвердили, что РНК была экстрагирована из обонятельного эпителия с помощью амплификации гена odorant binding protein 2B (OBP2B) (Figure 1), который экспрессируется исключительно в обонятельном эпителии [19]. Кроме того мы тестировали на присутствие обонятельных сенсорных нейронов в каждой выборке путем амплификации маркерного гена обонятельных сенсорных нейронов, olfactory marker protein (OMP) [20]. Далее метили и гибридизировали каждую выборку РНК из обонятельного эпителия. Сходным образом мы гибридизировали РНК из печени, легких, почек, сердца и тестисов человека (purchased from Ambion (Austin, TX, USA)).

Expression of OR genes in human olfactory epithelium

OR гены с достоверно повышенной экспрессией в обонятельном эпителии по сравнению с др. тканью рассматривались как 'установленные'. Мы нашли 437 предполагаемых OR генов, экспрессируемых в обонятельном эпителии человека при P менее 0.05 (Figure 2a; Additional data file 1), when at most 29 are expected by chance, given the statistical cutoff and the number of genes on the array (see Table 1 for results using alternative statistical cutoffs). Эти результаты были оценены с помощью RT-PCR на 10 случайно выбранных OR генах, чья экспрессия была обнаружена в обонятельном эпителии (Additional data file 1); во всех 10 случаях RT-PCR подтвердила результаты анализа массивов. Было подтверждено, что огромное большинство (76%) прогнозируемых OR генов человека в самом деле экспрессируются в обонятельном эпителии. Функциональное значение 141 предполагаемого OR гена человека находится под вопросом, т.к. их экспрессия не выявлена в обонятельном эпителии. Отметим однако, что 109 из 141 OR генов не обнаруживали достоверных повышенных уровней экспрессии в исследованных тканях (Additional data file 1). нельзя исключить возможности, что субнабор в 109 OR генов не был обнаружен из-за сходных уровней экспрессии во всех исследованных тканях, включая обонятельный эпителий [16].

Table 1. Number of expressed OR genes in human olfactory epithelium

Предыдущие исследования отметили также анекдотичную экспрессии индивидуальных OR псевдогенов человека [11,14]. Из 212 OR псевдогенов человека, анализируемых в микромассивах 142 (67%) экспрессировались в обонятельном эпителии (Additional data file 1). Т.к. эта фракция достоверно ниже той фракции из интактных OR генов, 295 out of 366 (80%), экспрессирующихся в обонятельном эпителии (Fisher Exact test, P менее 10-3; see Table 1 for results using alternative statistical cut-offs). Более того, интактные OR гены, по-видимому, экспрессируютсяe в среднем на более высоком уровне, чем OR псевдогены (assuming that the probe effect is canceled in large samples, such that we can compare hybridization intensity across groups of probe-sets, the mean difference in normalized intensity is +16%; Mann-Whitney-U, P = 0.005). Это согласуется с недавними наблюдениями у мышей (XZ and SF, manuscript in preparation). Наблюдение широко распространенной экспрессии OR псевдогенов в данном исследовании, а также в ряде др. [11,14], указывает на то, что система распада nonsense-обусловленных РНК (rev. [26]) не достаточно эффективно удаляет мРНК OR псевдогенов.

В наш массив мы включали только OR псевдогены с одним или двумя преждевременными нарушениями кодирующей области. Такие ORs были скорее всего недавно возникшими псевдогенами, так что их экспрессия не была неожиданной. Распространенной моделью является та, согласно которой зрелые обонятельные сенсорные нейроны, как полагают, обладают клеточным механизмом, который ограничивает экспрессию только одним OR геном [27,28]. Эта модель предсказывает, что нейронами экспрессируемые псевдогены д. в конечном итоге переключаются на экспрессию функционального гена [27,28], поскольку функциональные и OR псевдогены редко ко-экспрессируются. Т.о., если экспрессия OR псевдогена широко распространена, то согласно нашим наблюдениям, это д. указывать, что каждый данный момент времени большая пропорция нейронов не будет экспрессировать функциональных генов и т.о., не будет вносить вклад в восприятие запаха. Это предсказание согласуется с небольшими количествами OR псевдогенов, обнаруженных у видов, которые сильно зависят от восприятия запахов [29].

Согласно альтернативной модели OR псевдогены в обонятельных сенсорных нейронах появляются с той же самой вероятностью, что и экспрессия интактных OR генов, но что нейроны, экспрессирующие только нефункциональный OR ген не будут проникать в обонятельную луковицу и никогда не достигают созревания и удаляются [17], тогда как нейроны. которые ко-экспрессируют функциональный ген, а также псевдоген конвергируют в обонятельные луковицы [17]. Эта модель не имеет отношения к клеточному механизму, который ограничивает экспрессию только одного OR гена. Соответственно данная модель предполагает, что псевдогены могут или ко-экспрессироваться с функциональным геном или ограничены молодыми нейронами, которые удаляются. Это предположение согласуется с нашими наблюдениями более низкой пропорции и более слабой экспрессии OR псевдогенов по сравнению с интактными генами. Если это верно, то можно предположить, что существенная пропорция клеток обонятельных сенсорных нейронов человека ко-экспрессирует функциональный, а также OR псевдоген.

Inter-individual variation in OR gene expression

Недавние работы показали, что значительная генетическая изменчивость регионов, кодирующих OR белки у людей (в частности, сегрегирующие нулевые мутации), может объяснить меж-индивидуальную изменчивость в смысле восприятия запахов [30,31]. Мы нашли также доказательства, что репертуары экспрессируемых OR генов варьируют между индивидами (Figure 3). Хотя в нашей выборке только три ткани обонятельного эпителия, что недостаточно для количественной оценки вариабельности экспрессии OR генов, но они подтверждают, что такая изменчивость значительна. Независимо от статистических cutoff (10-5 более P менее 0.05), использованной для выявления OR генов, которые экспрессируются в каждой выборке, репертуар экспрессируемых OR генов у каждой пары индивидов отличался, по крайней мере, на 14%. Это количество отражает техническую ошибку, также как и настоящие меж-индивидуальные отличия. Однако, мы не наблюдали достоверных отличий в экспрессии генов 'домашнего хозяйства' в тканях обонятельного эпителия, следовательно, техническое объяснение мало вероятно для объяснения различий в детекции экспрессии OR генов между выборками. Т.о., наши находки открывают возможность, что помимо различий в функции белков, существует изменчивость в регуляции OR генов, которая также вносит вклад в фенотипические отличия чувствительности обоняния между индивидами. Если это так, то исследования генетических основ специфической потери обоняния (anosmia) д. включать и генетические варианты промоторов OR генов и предполагаемых контролирующих регионов в добавление к полиморфизмам кодирующих регионов.

Expression of OR genes in non-olfactory epithelium tissues

Мы определяли экспрессию OR генов в 5 не-обонятельных тканях с помощью идентификации генов, чья экспрессия достоверно повышена и одной или более тканях . Наш подход аналогичен, использованному Zhang et al. [16], которые наблюдали, что у мышей экспрессия OR генов наинизшая в vomeronasal organ (VNO), поэтому использовали уровни экспрессии в этой ткани в качестве фона, с которым сравнивали данные от др. тканей. Т.к. у людей отсутствует характерный VNO [32], и мы не смогли найти ткань, в которой экспрессия OR была бы четко ниже (Additional data file 1), поэтому мы сравнивали повышенную экспрессию в каждой индивидуальной ткани с распределением уровней экспрессии во всех др. тканях (включая и обонятельный эпителий). Лишь 33 OR генов (Figure 2a; Additional data file 1) были найдены как имеющие достоверно повышенную экспрессию в не-обонятельных тканях по сравнению с обонятельным эпителием. Хотя наши критерии детекции несколько отличались от тех, что использовались Zhang et al., наши находки согласуются с их результатами на мышах в терминах пропорции OR генов в не-обонятельных тканях [16].

Когда мы сравнивали экспрессию только среди не-обонятельных тканей, то мы нашли 147 OR генов, имеющих статистически повышенную экспрессию в одной или большем числе тканей (Figure 2b; Additional data file 1). Поэтому мы рассматривали экспрессию этих генов, как выявляемую в не-обонятельных тканях. Когда мы использовали RT-PCR для выборки из 4-х генов в 4-х тканях, чтобы оценить наши результаты, то нашли только один пример, который не поддтверждался нашими находками в массивах (Additional data file 4). Since we expect 29/578 genes to be false positives (given the statistical cutoff we used; P менее 0.05), an error rate of 1/22 assays (4.5%) in the RT-PCR results for olfactory epithelium and non-olfactory tissues is consistent with our expectation. RT-PCR также выявил экспрессию в одном случае, не выявляемую с помощью массива (для OR2T1 в почках). Again, this false negative is expected given the increased sensitivity of RT-PCR, and the conservative criteria that we used to detect expression from the microarray data.

Мы отметили, что 32 из эктопически экспрессирующихся OR генов (идентифицированных сравнением только с др. не-обонятельными тканями) не были идентифицированы как экспрессирующиеся обонятельным эпителием. Эта находка ставит вопрос, каково функциональное значение этих 32 генов как обонятельных рецепторов. Если эти гены экспрессируются только в не-обонятельных тканях, то вряд ли они участвуют в распознании запахов. Предложена только одна гипотеза относительно дополнительных функций OR генов, согласно которой они возможно играют роль в хемотаксисе спермиев [15], но мы установили, что тканями с наибольшими количествами эктопически экспрессируемых OR генов в действительности были легкие и сердце (Table 2). Эти результаты согласуются с предыдущими наблюдениями эктопической экспрессии OR генов у людей, базирующимися на ESTs и микромассивах экспрессии по всему геному [14]. Кроме того, хотя подход, использованный в [14] для анализа данных микромассивов отличен от использованного нами, перекрывание списка эктопически экспрессируемых OR генов в двух исследованиях существенно выше, чем ожидалось от случайного совпадения (P = 0.012; Additional data file 2).

Table 2. Number of expressed OR genes in non-olfactory epithelium tissues Do OR genes have additional functions?

С первого наблюдения эктопической экспрессии OR генов [12,13], было предположено, что обонятельные рецепторы могут выполнять дополнительную функцию в не-обонятельных тканях. Мы предприняли эволюционный анализ эктопически экспрессируемых генов OR , чтобы протестировать эту гипотезу. На основании недавнего наблюдения, что гены, экспрессируемые в большом количестве тканей находятся под более строгим эволюционным давлением по сравнению с генами, которые экспрессируются в одной или нескольких тканях [33,34]. Это наблюдение были интерпретировано, как отражение более высокого количества эволюционных ограничений, накладываемых необходимостью оптимизировать функцию во множественных тканях по сравнению с функциональными ограничениями экспрессии в одиночной ткани.

Путем сравнения human-chimpanzee-rhesus ортологов OR генов мы установили, что OR гены человека, которые также экспрессируются эктопически, не находятся под более значительным эволюционным ограничением в ветви людей (median Dn/Ds on the human lineage = 0.62) , чем OR гены, экспрессируемые исключительно в обонятельном эпителии (median Dn/Ds = 0.64; Mann-Whitney U; one tailed P = 0.60). Это наблюдение указывает на то, что эктопическая экспрессия OR генов человека может не подвергаться дополнительным функциональным ограничениям в отношении белков обонятельных рецепторов. Кроме того не выявлено достоверных различий в Dn/Ds отношении, когда мы использовали белковые домены (напр., специфические трансмембранные домены или предполагаемые сайты связывания [35]), скорее, чем всю кодирующую область в нашем сравнении (P > 0.32 for all comparisons). Мы отмечаем однако, что индивидуальные белковые домены являются короткими (17-45 остатков), и следовательно, не накапливают множества замен внутри человеческой ветви; как результат анализ доменов индивидуальных белков может быть не достаточно мощным для идентификации различий в селективном далении.

Когда мы сфокусировались на гомологах человеческих и мышиных OR генов (мы используем термин 'homologs' вместо 'orthologs' т.к. определение orthology между семействами человеческих и мышиных генов не столь прямолинейно), то мы нашли, что они вряд ли более склонны эктопически экспрессироваться в одной и той же ткани, чем ожидалось, исходя из случайности. Конкретно, мы не можем отторгнуть нулевую гипотезу, что гомологичные OR гены экспрессируются в сердце, легких и тестисах (ткани, включенные в оба наших исследования [16]) случайно (P = 0.55, P = 0.06, and P = 0.64 for a comparison of OR genes expressed in heart, lung, and testis, respectively, using a hyper-geometric distribution). Все эти наблюдения указывают на то, что что профили эктопической экспрессии индивидуальных OR генов не законсервированы между видами млекопитающих. Итак, хотя мы не можем исключить возможность, что субнабор OR генов обладает дополнительными функциями, но в целом наши результаты подчеркивают случайную экспрессию большого числа OR генов млекопитающих в не-обонятельных тканях при отсутствии функционального значения из-за текучести (leaky) промоторов. Т.о., наши результаты согласуются с нейтральным объяснением эктопической экспрессии OR генов, предложенным [14]. Сравнение вариабельности эктопической экспрессии OR генов внутри и между видами позволит проверить гипотезу более прямо (reviewed in [36]).

Conclusion

Мы выявили экспрессию 437 прогнозируемых OR генов человека в обонятельном эпителии в подтверждение их функционального значения в качестве обонятельных рецепторов. Напротив, по крайней мере 32 предполагаемых OR генов человека могут не быть обонятельными рецепторами и они, по-видимому, экспрессируются исключительно в не-обонятельных тканях. Предостерегает то, что учитывая наблюдаемую межиндивидуальную вариабельность экспрессии OR генов, субнабор из этих 32 OR генов может экспрессироваться у др. индивидов. Мы также описали значиетльную эктопическую экспрессию OR генов человека. Однако, наш эволюционный анализ эктопически экспрессируемых OR генов не привел к подтверждению гипотезы, что обонятельные рецепторы обладают дополнительными функциями.

Characterizing the expression of the human olfactory receptor gene family using a novel DNA microarrayXiaohong Zhang, Omar De la Cruz, Jayant M Pinto, Dan Nicolae, Stuart Firestein and Yoav GiladGenome Biology 2007-V.8-No.5-r86 (http://genomebiology.com/2007/8/5/R86)

Characterizing the expression of the human olfactory receptor gene family using a novel DNA microarray
Xiaohong Zhang, Omar De la Cruz, Jayant M Pinto, Dan Nicolae, Stuart Firestein and Yoav Gilad
Genome Biology 2007-V.8-No.5-r86 (http://genomebiology.com/2007/8/5/R86)