Ген Pax6 кодирует транскрипционный фактор, содержащий два типа ДНК связывающих доменов, paired box и homeobox (Stoykova & Gruss 1994; Callaerts etal. 1997). Pax6 играет консервативную роль в развивающихся сенсорных органах и головном мозге среди видов позвоночных и беспозвоночных (rev. Osumi 2001; Simpson & Price 2002; van Heyningen & Williamson 2002). Известно, что линии мышей и крыс с нарушением функции Pax6 обнаруживают тяжелые аномалии в развитии обонятельной системы; включая дисгенез обонятельного эпителия (Matsuo et al. 1993; Davis & Reed 1996; Anchan etal 1997) и неправильную локализацию или отсутствие специфический нейрональных субтипов в обонятельных лукоицах и обонятельном кортексе (Lopez-Mascaraque etal. 1998; Jimenez etal. 2000; Hirata etal. 2002; Nomura & Osumi 2004; Nomura etal. 2006). Эти данные указывают на то, что Pax6 играет жизненно важные роли в определенных процессах развития обонятельной системы. Будет рассмотрена роль Pax6 в: (i) в развитии обонятельных плакод и эпителия; (ii) позиционировании и наведении аксонов нейронов обонятельных луковиц; (iii) миграции и расположении нейронов обонятельного кортекса ; и (iv) в генерации специфических субтипов в постнатальных обонятельных луковицах.
Во время ранних эмбриональных стадий Pax6 экспрессируется в фронто-назальной области, включающей обонятельную плакоду, которая и дает позднее обонятельный эпителий (Matsuo et al. 1993; Grindley et al. 1995; Fig. 2A-D). У гомозиготных Pax6 мутантных мышей (Sey/Sey) и крыс (rSey/rSey), развитие обонятельных плакод сильно нарушено, это приводит к отсутствию обонятельных рецепторных нейронов (Hill etal. 1991; Matsuo etal. 1993; Grindley etal. 1995; Davis & Reed 1996; Jimenez etal. 2000; Fig. 2E,F). В некоторых исследованиях было показано, что развитие обонятельных плакод регулируется взаимодействием между эпителиальной и мезенхимной тканями в фронто-назальных регионах и что ретиноидами-обеспечиваемый сигнальный путь является важным составляющим этого взаимодействия (Osumi-Yamashita etal. 1990; LaMantia et al. 1993, 2000; Bhasin etal. 2003). Retinoic acid (RA), производное витамина A, продуцируется фронто-назальной областью и рассматривается как ключевая молекула для запуска retinoid-зависимой передачи сигналов (rev. Rawson & LaMantia 2006). Важно, что экспрессия репортерного гена, отвечающего на передачу сигналов RA, не обнаруживается в фронто-назальной области Sey/Sey мутантов (Anchan etal. 1997). Более того, экспрессия RA-генерирующего энзима, такого как Raldh-3, полностью отсутствует в поверхностной эктодерме rSey2/rSey2 мутантов (Suzuki et al. 2000), указывая тем самым, что нарушение развития носовых плакод у Pax6 мутантов может быть обусловлено отсутствием или дефектами RA-зависимого пути.
Предыдущие исследования показали, что neural crest-derived cells (NCDCs) также играют критическую роль в развитии фронто-назальной ткани (Osumi-Yamashita et at. 1994, 1997). Во время раннего эмбриогенеза NCDCs, происходящие из среднего мозга, вносят вклад в мезенхимные компоненты фронто-назальных масс (Osumi-Yamashita etal. 1994). Более того, нарушается миграция происходящих из среднего мозга NCDCs, как было показано у
Pax6 мутантных эмбрионов крыс и мышей (Matsuo et al. 1993; Osumi-Yamashita etal. 1997; Kanakubo etal. 2006). У Pax6 гомозиготных эмбрионов мигрирующие NCDCs не могут проникнуть в фронто-назальные массы (Matsuo etal. 1993; Osumi-Yamashita etal. 1997). Аномальная миграция обусловливается клеточно неавтономными дефектами в мигрирующих NCDCs (Osumi-Yamashita etal. 1997). Недавние исследования также показали, что HNK-1 carbohydrate эпитоп и
GlcAT-P ген, который кодирует энзим для синтеза HNK-1 эпитопа, эктопически экспрессируются в лицевой эктодерме мутантных
Pax6 крыс (Nagase etal. 2001, 2003). Более того, HNK-1 эпитоп обладает потенциалом ингибировать миграцию NCDCs (Nagase etal. 2003), указывая тем самым, что нарушенная миграция NCDCs может быть обусловлена эктопической экспрессией эпитопа HNK-1 у мутантов и что Pax6 играет ответственную роль в нормальном развитии фронто-назальной области путем регуляции экспрессии этих молекул.
Role of Pax6 in the developing olfactory bulb
Обонятельные луковицы представляют собой выпячивания ростральной части конечного мозга (telencephalon) и действуют как центры первичной переработке обонятельной информации (Lopez-Mascaraque & de Castro 2002). Они состоят из нескольких типов нейронов, которые обладают характерными свойствами и функциями (Hinds 1968; Pinching & Powell 1971). Митральные клетки являются проекционными нейронами обонятельных луковиц и, как известно, получают сигналы от обонятельного эпителия. Эти клетки также посылают аксоны в направлении обонятельной коры, передавая тем самым обонятельную информацию в высшие центры переработки информации. Интересно, что у Pax6 гомозиготных мутантов обонятельные луковицы не развиваются в ростральной части телэнцефалона. Вместо этого похожие на обонятельные луковицы структуры (OBLS) образуются на боковых частях телэнцефалона мутантов (Lopez-Mascaraque et al. 1998; Jimenez etal. 2000; Hirata etal. 2002; Fig. 3A,B). OBLS состоят из митральных клеток, которые направляют аксоны к обонятельный кортекс как и у нормальных эмбрионов (Jimenez etal. 2000; Hirata etal. 2002; Fig. 3C,D), хотя ориентация каждой клетки сильно нарушена (Lopez-Mascaraque etal. 2005).
Т.к. митральные клетки являются первыми дифференцирующимися нейронами обонятельных луковиц (Hinds 1968; Bayer 1983), то неправильное расположение митральных клеток, по-видимому, является первичным дефектом при аномальном развитии обонятельных луковиц у Pax6 мутантов. Чтобы выяснить, как Pax6 регулирует образование обонятельных луковиц, мы исследовали происхождение и пути миграции митральных клеток, используя культуры целых эмбрионов. Анализ по отслеживанию клеток показал, что митральные клетки возникают как ростральная часть телэнцефалона как в норме, так и у мутантов Pax6. Позднее, однако, митральные клетки неправильно направляются в латеральные части мутантного телэнцефалона (Nomura & Osumi 2004). Более того, эксперименты по клеточным трансплантациям показали, что аномальная миграция митральных клеток обусловлена неавтономными клеточными дефектами мигрирующих клеток. Предварительные исследования подтвердили, что проекции обонятельных рецепторных нейронов в телэнцефалон (обонятельные нервы) необходимы для индукции обонятельных луковиц (Stout & Graziadei 1980; Graziadei & Monti-Graziadei 1992). У Pax6 гомозиготных мутантов проекции обонятельных нервов целиком отсутствуют (Jimenez et al. 2000). Следовательно, вполне возможно, что неправильное расположение митральных клеток являются вторичным дефектом, обусловленным потерей иннервации обонятельными нервами у мутантов. Чтобы проверить эту возможность, мы устраняли влияние обонятельной иннервации хирургическим устранением обонятельного эпителия у эмбрионов дикого типа до возникновения проекций обонятельного нерва. Несмотря на отсутствие иннерваций обонятельными нервами митральные клетки всё ещё позиционировались в ростральной части телэнцефалона, демонстрируя тем самым, что неправильная миграция митральных клеток у мутантов Pax6 не зависит от потери обонятельной иннервации (Nomura & Osumi 2004). Одновременно избыточная экспрессия Pax6 экспрессионного вектора в Pax6 мутантном энцефалоне устраняла неправильную локализацию митральных клеток, указывая тем самым, что Pax6 действует в телэнцефалоне в ходе нормального развития обонятельных луковиц. Эти результаты показывают, что Pax6 регулирует положение обонятельных луковиц за счет ограничения миграции митральных клеток в ростральной части телэнцефалона (Nomura & Osumi 2004).
Какие молекулы стоят ниже Pax6 и контролируют развитие обонятельных луковиц ? В нескольких исследованиях было показано, что передача сигналов FGF играет важную роль в развитии обонятельных луковиц. Мыши, лишенные функции fgfr1 или с нарушенной экспрессией
fgf8 имеют гипопластичные обонятельные луковицы (Garel et al. 2003; Hebert etal. 2003). Чтобы исследовать, изменена ли передача сигналов fgf также у
Pax6 гомозиготных мутантов, мы исследовали паттерны экспрессии FGF лиганда и рецепторов в телэнцефалоне
Pax6 мутантов. С помощью гибридизации In situ идентифицирована сильная экспрессия
fgf8 в ростральной части срединной линии мутантного телэнцефалона, как и в случае WT (Fig. 4A,B). Напротив, заметная редукция уровня экспрессии
fgfr1 и fgfr3 наблюдалась в
Pax6 мутантном телэнцефалоне по сравнению с WT (Fig. 4C-F). Предыдущие исследования подтвердили, что передача сигналов FGF необходима для выпячивания обонятельных луковиц, посредством регуляции локальной клеточной пролиферации (Hebert etal. 2003). Наши результаты указывают на о, что передача сигналов FGF также нарушена в мутантном
Pax6 телэнцефалоне, что может объяснить отсутствие выпячиваний мутантных обонятельных луковиц.
Role of Pax6 in the developing olfactory cortex
Обонятельный кортекс действует как вторичный центр переработки обонятельной информации, в котором разного типа нейроны формируют трехслойную ламинарную структуру (Bayer 1986; Valverde & Santacana 1994). Предыдущие исследования показали, что большинство нейронов обонятельного кортекса происходит из вентральной части pallium, в которой строго экспрессируется Pax6 во время эмбриогенеза и мутанты Pax6 лишены субпопуляции этих нейронов (de Carlos etal. 1996; Yun etal. 2001; Hirata etal. 2002). Мы также сообщали, что нейроны в поверхностном слое обонятельного кортекса находятся в дефиците у Pax6 мутантов (Nomura etal. 2006). Эти нейроны происходят из дорсальной части телэнцефалона и мигрируют вентрально, прекращая миграцию на pallial/subpallial boundary (PSB), которая соответствует презумптивному обонятельному кортексу (Fig. 5A). У мутантов Pax6 эти нейроны мигрируют вентрально, но игнорируют PSB и проникают в вентральную часть телэнцефалона (Fig. 5B).
Эксперименты по клеточной трансплантации показали, что эта аномалия обусловлена клеточно неавтономными дефектами в мигрирующих клетках. При скрининге генов, которые ответственны за миграцию нейронов, мы идентифицировали ephrin-A5 в качестве молекулы кандидата, которая регулирует миграцию нейронов обонятельного кортекса. ephrin-A5 экспрессируется в вентральной части телэнцефалона (Fig. 5C), и уровень его экспрессии сильно снижен у Pax6 мутантов. Эктопическая экспрессия ephrin-A5 вектора в вентральной части мутантного телэнцефалона устраняет дефекты миграции нейронов обонятельного кортекса. Более того, ephrin-A5 дефицитные мыши обладают фенотипом, сходным с таковым у Pax6 мутантов: нейроны обонятельного кортекса не останавливаются на границе PSB и проникают в вентральную часть телэнцефалона. Эти результаты показывают, что Pax6 регулирует миграцию нейронов обонятельного кортекса путем регуляции экспрессии ephrin-A5. Исследования избыточности и недостаточности функции показали, что ephrin-A5 обладает отталкивающей активностью в отношении мигрирующих нейронов обонятельного кортекса, предупреждая тем самым их инвазию в вентральную часть телэнцефалона (Nomura etal. 2006; Fig. 5D).
Было установлено, что паттерны проекций аксонов митральных клеток в обонятельный кортекс также нарушены у
Pax6 мутантов (Hirata etal. 2002). Митральные клетки посылают свои аксоны на поверхность обонятельного кортекса, которые собираются вместе, что облегчает формирование плотных пучков аксонов, наз. lateral olfactory tract (LOT). Во время позднего эмбриогенеза аксоны митральных клеток формируют коллатеральные веточки, которые увеличиваются и проецируются в каудальную часть обонятельного кортекса (Hirata & Fujisawa 1999). У
Pax6 мутантов, однако, некоторые аксоны в LOT отделяются от пучков и эктопически простираются в обонятельный кортекс (Hirata etal. 2002). Более того, образование коллатералей митральных клеток также тяжело нарушено у
Pax6 мутантов и т.о., лишь немногие веточки аксонов проникают в обонятельный кортекс (Hirata etal. 2002). Было установлено, что специфическая популяция нейронов, известная как 'lot cells' участвует в развитии LOT (Sato etal. 1998). Во время ранних эмбриональных стадий, lot клетки возникают в дорсальной части телэнцефалона и мигрируют вентрально, затем заселяют презумптивную LOT область, подобно нейронам обонятельного кортекса (Tomioka etal. 2000; Kawasaki et al. 2006). Курьезно, но распределение lot клеток не изменяется в Pax6 мутантном обонятельном кортексе (Hirata et al. 2002), указывая тем самым, что LOT дефекты у мутантов не зависят от lot клеток. Интересно, что формирование коллатералей mammlio-tegmental тракте также нарушено у
Pax6 мутантов (Valverde etal. 2000), указывая тем самым, что Pax6 регулирует общие механизмы, лежащие в основе ответвления аксональных коллатералей в развивающемся головном мозге.
Role of Pax6 in the generation of olfactory bulb interneurons
Развитие обонятельной системы продолжается после рождения и в некоторых регионах постоянно генерируются новые нейроны во время взрослой жизни (Kempermann 2006). Генерация интернейронов обонятельных луковиц особенно исследовалась как модель постнатального/взрослого нейрогенеза (Temple 2001; Alvarez-Buylla & Garcia-Verdugo 2002). Интернейроны являются функционально важными составляющими обонятельных луковиц и они подразделяются на два больших субтипа: granule cells (GCs) и periglomerular cells (PGCs), которые различают на основании их морфологических, физиологических и химических характеристик (Kosaka et al. 1995; Lledo etal. 2004). GCs являются гомогенно GABAergic, в то время как PGCs являются гетерогенной популяцией. включающей GABAergic и dopaminergic нейроны. Эти нейроны поставляются нейральными стволовыми клетками, которые располагаются в субвентрикулярной зоне телэнцефалона и мигрируют тангенциально в направлении обонятельных луковиц посредством 'rostral migratory stream (RMS)'. Ранее было продемонстрировано, что Pax6 экспрессируется в нейрональных предшественниках RMS и играет важную роль в спецификации подтипов обонятельных интернейронов (Hack etal. 2005; Kohwi etal. 2005). Избыточная экспрессия Pax6 во взрослых нейрональных предшественниках в RMS увеличивает количество dopaminergic PGCs (Hack etal. 2005). Трансплантационные исследования клеток нейрональных предшественников также выявили клеточно-автономную потребность Pax6 для дифференцировки dopaminergic PGCs (Kohwi etal. 2005). Более того, количества dopaminergic PGCs снижены у Pax6 гетерозиготных мутантных мышей (Dellovade etal. 1998; Kohwi etal. 2005). Мы недавно идентифицировали, что количество др. PGC субтипов также редуцируется в обонятельных луковицах Pax6 гетерозиготных мутантов (H. Haba, T Nomura and N. Osumi unpubl. data, 2007), указывая тем самым, что собственно доза Pax6 существенна для дифференцировки и/или поддержания этих нейронов.
Разнообразные транскрипционные факторы, такие как Dlx-1/-2 (Anderson etal. 1997), Gsh-1/-2 (Toresson & Campbell 2001), Arx (Yoshihara etal. 2005) и Sp8 (Waclaw etal. 2006) дифференциально экспрессируются в обонятельных интернейронах, а комбинированная экспрессия этих генов, по-видимому, устанавливает 'transcriptional codes' для спецификации интернейронов (Allen etal. 2007). Более того, некоторые внеклеточные белки и их рецепторы, такие как slits (Wu etal. 1999; Nguyen-Ba-Charvet etal. 2004; Sawamoto etal. 2006), neuregulins (Ghashghaei etal. 2006) и Reelin (Hack et al. 2002) участвуют в собственно миграции и дифференцировке интернейронов обонятельных луковиц. Изучение генетических взаимодействий между этими молекулами и Pax6 является важным для понимания контролирующей системы, которая регулирует развитие интернейронов.
Conclusions
Although recent advances in developmental neurobiology have unveiled genetic programs that govern the brain formation, several aspects of the highly orchestrated processes of the olfactory system development remain to be deciphered. In addition to molecular embryological approaches, spatial and temporal manipulations of the functions of specific genes are needed to explore various cellular and molecular interactions. Future analysis dissecting Pax6 function in a cell and tissue-specific manner will not only provide a better understanding of the role of this transcription factor in the developing olfactory system, but also shed light on the molecular mechanisms underlying the developmental processes of the vertebrate sensory system.
Сайт создан в системе
uCoz
, Hasumi Haba and Noriko Osumi