Посещений:
Индукия Отических Плакод

Роль FGF

Expression and functions of FGF ligands during early otic development
THOMAS SCHIMMANG
Int. J. Dev. Biol. 51: 473-481 (2007) doi: 10.1387/ijdb.072334ts

Classical studies have postulated the action of an endomesodermal signal initiating inner ear induction, subsequently followed by a neural tube-derived signal to complete the process of otic placode formation in the surface ectoderm. Members of the Fibroblast growth factor (FGF) gene family have been implicated in these processes. In this review, expression analysis and recent experimental evidence for candidate inner ear FGF ligands during inner ear induction is discussed. Careful examination of the spatiotemporal expression patterns of different FGFs during inner ear induction reveals that the sequential appearance of FGF members in the endoderm and/or mesoderm is followed by expression in the posterior hindbrain in all vertebrate species analysed to date. Experimental manipulations have demonstrated the sufficiency and/or necessity of some FGFs during different steps of inner ear induction in vitro and in vivo. Combining the advantages of the molecular tools and approaches available in different experimental systems such as zebrafish, chicken or mouse will eventually lead to a complete understanding of how FGFs control inner ear induction in vertebrates.
Индукция внутреннего уха инициируется уже во время гаструляции с помощью endomesodermal ткани, которая лежащей под компетентной эктодермой. Во время нейруляции, второй индуцирующий нейральный сигнал от презумптивного заднего мозга подкрепляет и поддерживает индукцию внутреннего уха. Первоначальные классические эмбриологические эксперименты, исследовавшие необходимость и достаточность различных тканей во время индукции внутреннего уха, в последнее время были скомбинированы с молекулярными зондами и инструментами, чтобы начать построение молекулярной сети, объясняющей различные ступени индукции внутреннего уха (Baker and Bronner-Fraser, 2001; Noramly and Grainger, 2002; Groves, 2005). Члены семейства генов Fibroblast growth factor (FGF) находятся среди первых кандидатов, контролирующих индукцию внутреннего уха, т.к. они обнаруживают пространственно-временной паттерн экспрессии, согласующийся с выполняемой ролью во время этого процесса. Во-вторых, их индуктивные способности и необходимость во время формирования эмбрионального паттерна и формирования различных систем органов подчеркивает их потенциал. участвовать также в ранних фазах образования внутреннего уха (Reuss and von Bohlen und Halbach, 2003; Bottcher and Niehrs, 2005; Thisse and Thisse, 2005a).

Expression of FGFs during inner ear induction


Согласно экспериментальным доказательствам, что первый индуктивный сигнал для образования отической плакоды присутствует в эндомезодерме, поэтому мы обозначаем эту фазу как инициация индукции (Fig. 1A,D). Вторая фаза процесса индукции - это инициация с помощью нейрального сигнала из развивающегося заднего мозга и завершается с началом образования плакод (Fig. 1B,E). Наконец, мы полагаем, что FGFs экспрессируются в момент, когда отическая плакода завершает свое формирование и начинается её инвагинация (Fig. 1C,G). Во время индукции внутреннего уха у эмбрионов кур эти три фазы грубо соответствуют периодам до (Fig. 1A) и после (Fig. 1B) спецификации части преплакодного домена, чтобы сформировать отическую плакоду и после детерминации отической судьбы (Fig. 1C; Groves and Bronner-Fraser, 2000; Bailey and Streit,2006)

Chicken FGF expression


Во время инициации внутреннего уха у эмбрионов кур FGF8 и FGF19 являются первыми членами семейства FGF, выявляемыми на 0 somite stage (ss, ст. HH6 по Hamburger and Hamilton, 1992; Ladher et al. , 2000; Ladher et al. , 2005). Fgf8 экспрессируется в энтодерме, тогда как Fgf19 выявляется в мезодерме, которая лежит под преплакодной эктодермой (Fig. 1A). Точная временная последовательность экспрессии обоих FGFs пока неясна, хотя в одном исследовании установили, что начало экспрессии Fgf19 происходит чуть позже в 1ss (HH7; Kil et al., 2005). На ст. HH7 впервые выявляется и экспрессия Fgf3 в мезодерме, где она ко-экспрессируется с Fgf19 (Fig. 1A; Kil et al ., 2005). На этой стадии транскрипты Fgf3 были также описаны в несегментированном заднем мозге непосредственно впереди первого сомита (Mahmood et al. , 1995), хотя этот домен может соответствовать Fgf3 гибридизационному сигналу от подлежащей мезодермы (Kil et al. , 2005). Экспрессия Fgf8, Fgf3 и Fgf19 поддерживается в энтодерме и мезодерме, соотв. во время последующей фазы индукции вплоть до 7ss (HH9) примерно на стадии, когда отическая плакода впервые может наблюдаться (Fig. 1B; Ladher et al., 2000; Karabagli et al., 2002; Brown et al., 2003; Kil et al., 2005). Во время этого периода выявляются дополнительные домены экспрессии для Fgf3 и Fgf19 в энтодерме и развивающемся заднем мозге. В фарингеальной энтодерме Fgf8 сопровождается почти одновременно экспрессией Fgf3 (5ss)и Fgf19 (6ss) (Mahmood et al., 1995; Wright et al., 2004; Ladher et al., 2005). Даже ещё раньше Fgf3 четко выявляется в заднем мозге, начиная с 3-4ss и далее и т.о. включается прежде самого раннего из описанных маркеров отической плакоды, Pax2, специфицирующегося на ст. 4-5ss (Groves and Bronner-Fraser, 2000; Kil et al. , 2005). После морфогенеза rhombomeres (r) заднего мозга на ст. 7ss, экспрессия Fgf3 наблюдается в r4 и r5 (Mahmood et al., 1995). Наконец, со ст. 5ss по 9ss, Fgf19 временно обнаруживается в задней части вентральной стороны заднего мозга (Ladher et al. , 2000; Wright et al. , 2004; Kil et al. , 2005). Интересно, что экспрессия членов семейства FGF выявляется в преплакодной эктодерме также (Fig. 1B). Когда отическая плакода формируется и начинает инвагинировать, до домен экспрессии Fgf3 в заднем мозге сохраняется, но даже расширяется, чтобы захватить r6 на ст. 10ss (Fig. 1C, Mahmood et al., 1995). Скорее всего на этой же стадии экспрессия Fgf3, Fgf8 и Fgf19 всё ещё обнаруживается в фарингеальной энтодерме (Hidalgo-Sanchez et al., 2000; Ladher et al., 2000; Adamska et al., 2001; Karabagli et al., 2002; Stolte et al., 2002; Wright et al., 2004). Более того отические плакоды сами по себе теперь обнаруживают многочисленные транскрипты Fgf10, а также более слабую экспрессию Fgf8 (Adamska et al. , 2001; Karabagli et al., 2002).

Mouse FGF expression


У эмбрионов мышей Fgf8 выявляется уже на 7-й эмбриональный день (E7) в кардиальной мезодерме, лежащей под нервной пластинкой (Ladher et al. , 2005), хотя значение этого домена экспрессии Fgf8 для отической индукции неопределенно (Fig. 1D). На E8 (0ss) экспрессия Fgf8 выявляется в спланхнической мезодерме, на ст. 3ss вся мезенхима, находящаяся ниже преплакодной эктодермы обнаруживает транскрипты Fgf8 (Ladher et al., 2005). Потенциальное влияние этого домена экспрессии на отическую индукцию подчеркивается находками, что экспрессия Fgf10 также обнаруживается в этой мезенхиме со ст. 0ss (Fig. 1D; Alvarez et al., 2003; Wright and Mansour, 2003a). На ст. E8, экспрессия Fgf10 поддерживается в мезенхиме, тогда как транскрипты Fgf8 теперь также временно обнаруживаются в преплакодной эктодерме и фарингеальной энтодерме с 4 по 8ss (Fig. 1E; Crossley and Martin, 1995; Ladher et al., 2005). Примерно в то же самое время (3ss),



Fig. 1. Expression of FGFs during otic placode induction in chick and mouse. Schematic sections of embryos taken at the level where inner ear induction takes place in chicken and mouse. The presence of the different FGF members is indicated by the colour code at the bottom of the figure. (A,D) Expression of Fgfs in the endoderm and/or mesoderm is observed during the first phase of induction. (B,E) A second phase of induction is defined by the onset of Fgf expression in neural tissue together with the initiation of otic placode formation in the surface ectoderm. (C,F) Finally, a third phase is characterized by the completion of placode formation and the initiation of placode invagination, a period when expression of some Fgfs expressed during placode induction is still maintained whilst other Fgfs initiate their expression in the placode itself or in the endoderm. For details, see text. Abbreviations: e, endoderm; m, mesoderm; n, neural tube; op, otic placode; pp, preplacodal ectoderm.

впервые выявляется экспрессия Fgf3 в заднем мозге и преплакодной эктодерме (Wright and Mansour, 2003a). Экспрессия Fgf3 первоначально обнаруживается в виде полоски в презумптивной задней части заднего мозга, но со ст. 5ss и далее расширяется рострально и достигает уровня r1 (Mahmood et al. , 1996; McKay et al. , 1996; Alvarez et al. , 2003; Wright and Mansour, 2003a; Powles et al. , 2004). Во время этого периода экспрессия Fgf10 впервые наблюдается в нервной ткани в вентральной задней части заднего мозга (Fig. 1E; Alvarez et al., 2003).
По мере формирования плакод Fgf8 исчезает из плакодной эктодермы, но некоторые транскрипты всё ещё обнаруживаются на вентральной поверхности эктодермы, фарингеальной энтодерме и и находящейся между ними мезодерме между 8 и 12ss (Fig. 1F; Ladher et al., 2005; Park et al., 2006). Незадолго до инвагинации плакод на ст. 10ss, транскрипты Fgf3 теперь также обнаруживаются в фарингеальной энтодерме (Mahmood et al., 1996; McKay et al. , 1996). В нейральном домене, имеющем отношение к индукции внутреннего уха, Fgf3 сохраняется в развивающемся заднем мозге с очень высокой экспрессией, наблюдаемой в r5 и r6, тогда как она оказывается подавленной в отической плакоде, когда она начинает инвагинировать около ст. 12ss-13ss (Fig. 1F; McKay et al., 1996; Wright and Mansour, 2003a). Во время этого периода экспрессия Fgf10 инициируется в инвагинирующей плакоде и фарингеальной энтодерме, в последнем случае она сопровождается также экспрессией Fgf3 и Fgf8 (Pirvola et al. , 2000; Alvarez et al. , 2003; Wright and Mansour, 2003a). В то время как транскрипты Fgf10 в мезенхиме уменьшаются, экспрессия Fgf10 в вентральной части r5 и r6, которая фланкирует инвагинирующую плакоду, всё ещё обнаруживается (Alvarez et al., 2003; Wright and Mansour, 2003a).
Мышиный FGF15 был идентифицирован как ортолог куриного FGF19. В отличие от Fgf19, Fgf15 не экспрессируется в мезодерме, а в нейроэктодерме с 0ss и во все остальные фазы отической индукции и формирования плакод. Более того, она обнаруживается в преплакодной эктодерме с 8ss и фарингеальной энтодерме с 13ss и далее (Wright et al., 2004).

Zebrafish, Medaka and Xenopus FGF expression


В противоположность ситуации у кур и мышей, где несколько Fgfs экспрессируются динамическим образом в разных тканях, участвующих в отической индукции, у рыбок данио только два члена FGF обнаруживаются во время этого процесса, Fgf3 и Fgf8 ко-экспрессируются в некоторых тканях, участвующих в отической индукции. При 50% epiboly Fgf3 экспрессируется в зародышевом кольце (germring) при 75% epiboly в прехордальной пластинке, сопровождаемая экспрессией в зачатке r4 и параксиальной цефалической мезодерме при 80% epiboly и на ранних ст. сегментации (Phillips et al., 2001; Maroon et al., 2002; Nechiporuk et al. , 2007). Fgf8 обнаруживает очень сходный паттерн экспрессии с Fgf3 в зародышевом кольце и r4, но не обнаруживается в прехордальной пластинке вплоть до 6ss (Phillips et al., 2001; Maves et al., 2002; Walshe et al., 2002). Слабая экспрессия Fgf8 в параксиальной цефалической мезодерме выявляется при 80% epiboly, сопровождаемая строгой экспрессией во время ранней сегментации (Reifers et al. , 2000; Thisse et al., 2001; Nechiporuk et al., 2007; Nikaido et al., 2007). Домены пространственно-временной экспрессии Fgf3 и Fgf8 были графически очерчены в детеалях Phillips et al. (2001) и Whitfield et al. (2002). Т.к. не было получено доказательств для экспрессии Fgf10 и Fgf19 во время ранней отической индукции, то оба эти FGFs были выявлены в самих отических плакодах (Miyake et al., 2005; Thisse and Thisse, 2005b).
У Medaka, Fgf3 и Fgf8 также ко-экспрессируются в полоске задней части заднего мозга с конца гаструлы (ст. 18) вплоть до ст. 6ss (ст. 21, Hochmann et al. , 2007). У Xenopus,экспрессия Fgf3 обнаруживается с поздней гаструлы (ст. 12,5) и в ходе всей нейруляции в r3, r4 и r5 (Lombardo et al., 1998). Экспрессия Fgf8 не skf описана в задней части заднего мозга во время нейруляции, но присутствует в подковообразной полоске, соответствующей преплакодной области нейроэктодермы рядом с развивающейся нервной трубкой (Christen et al. , 2003; Fletcher et al. , 2006).

Functional analysis of FGFs during inner ear induction


Экспериментальные доказательства участия членов FGF во время раннего развития внутреннего уха обсуждаются ниже. Ключевые эксперименты и их результаты суммированы в Table 1.

TABLE 1

KEY EXPERIMENTS ADDRESSING FGF FUNCTION DURING INNER EAR INDUCTION






Functional analysis of FGFs in chicken inner ear induc- tion


Членами семейства FGF, которые как было показано, действуют первыми во время индукции внутреннего уха у эмбрионов кур, являются FGF8 и FGF19. Функциональное значение доменов их в энтодерме и мезодерме. соотв.. и и их взаимодействия было изучено Ladher et al. (Ladher et al. , 2000; Ladher et al., 2005). FGF8, как было установлено, способен индуцировать FGF19 в мезодерме, изолированной на ст. HH5 (Ladher et al., 2005). Vice versa, электропортация siRNA, направленной против Fgf8 у HH4 эмбрионов приводила к потере экспрессии Fgf19 на HH7 , а также к потере экспрессии Pax2 и плакодной ткани на HH12-14. Потеря экспрессии Pax2 может быть возмещена за счет FGF19 в культурах эксплантов, происходящих от эмбрионов, электропортированных с помощью siRNA, направленными против Fgf8. Следовательно, экспрессия Fgf8 в энтодерме достаточна и необходима для экспрессии Fgf19 в мезодерме и указывает на то, что FGF8 действует посредством FGF19 во время отической индукции.
Участие передачи сигналов FGF между 0-4ss (HH6-8) тестировалось также путем блокирования FGF рецепторов с помощью SU5402, что приводило к потере некоторых (напр., Pax2), но не всех отических маркеров (Martin and Groves, 2006). Напротив, FGF2, который способен активировать некоторые изоформы 4-х FGF рецепторов, индуцирует отические маркеры в изолированной не-отической эктодерме на этой стадии. Наоборот FGF19 сам по себе не способен индуцировать отические маркеры в презумптивной отической или не-отческой областях на этих стадиях, но делает это в присутствии нервной ткани (Ladher et al. , 2000; Martin and Groves, 2006). Fgf3 присутствует в мезодермальной и нервной ткани во время отической индукции и индуцируется с помощью FGF19, но его способность индуцировать отические маркеры на этих стадиях еще не тестировалась (Ladher et al., 2000; Kil et al. , 2005).
Wnt8c экспрессируется в нейроэктодерме, лежащей поверх мезодермы, экспрессирующей Fgf19 на ст. HH7 и индуцируется с помощью FGF19 в неспецифицированной эктодерме ст. 5. Wnt8c, с др. стороны, индуцирует Fgf3 и слабую экспрессию отических маркеров в изолированной презумптивной отической эктодерме на ст. HH7, тогда как комбинация Wnt8c и FGF19 индуцирует строгую экспрессию отических маркеров (Ladher et al. , 2000). Исходя из этих результатов было предположено, что FGF19 из мезодермы и Wnt8c из нервной ткани действуют как синергичные сигналы для отической индукции. Влияние экспрессии Fgf3, Fgf19 и Wnt8c на отическую индукцию недавно исследовали vitamin A deficient (VAD) перепелах (Kil et al., 2005). В этой экспериментальной системе экспрессия Fgf3 и Fgf19 всё ещё присутствует в мезодерме, тогда как задняя часть заднего мозга теряет и экспрессию Fgf3, Fgf19, а экспрессия Wnt8c сдвигается каудально. Т.к. отические плакоды всё ещё индуцируются в данных условиях, то было сделано заключение, что экспрессия этих генов в задней части заднего мозга необязательна во время отической индукции, в то время как экспрессия Fgf3 и Fgf19 в мезодерме может быть необходимой. Тем не менее задняя часть заднего мозга всё ещё обладает индуцирующей активностью, стимулирующей образование плакод, т.к. VAD имеют каудально расширенные отические плакоды, что возможно обусловлено каудальным сдвигом доменов экспрессии Fgf3, Fgf19 и Wnt8c в соседней нервной трубке (Kil et al. , 2005). Учитывая всё это, альтернативная интерпретация исследований Ladher et al. (2000) может быть связана с вовлечением FGF19 и FGF3, при этом FGF3 д. индуцироваться с помощью FGF19 и Wnt8c, как факторами ответственными за инициальную отическую индукцию. Однако, достаточна ил и необходима экспрессия Fgf3 в мезодерме для отической индукции ещё неясно. Сходным образом необходимость в Fgf19 во время отической индукции ещё предстоит проанализировать путем непосредственного блокирования его экспрессии мезодерме, используя, напр., siRNA-обусловленный нокдаун гена.
Роль FGF3 во время раннего развития внутреннего уха была, однако, исследована на слегка более поздней стадии HH8 (5ss). На этой стадии предшественники плакод, которые первоначально специфицированы как хрусталики на ст. HH6 (Bailey et al. , 2006) уже приобретают отические характеристики, и происходит спецификация отических плакод, на что указывает экспрессия Pax2 (Groves and Bronner-Fraser, 2000). Во-первых, необходимость в экспрессии Fgf3 в нервной трубке для ранней информации внутреннего уха была исследована с помощью siRNA-обусловленного нокдауна Fgf3 in vivo (Zelarayan et al., 2007). На HH8 наблюдается строгая экспрессия Fgf3 в задней части заднего могза (Mahmood et al., 1995) и нокдаун его экспрессии блокиарует переход от отической плакоды к отическому пузырьку (Zelarayan et al., 2007). Эти результаты подтверждают, сходные наблюдения, когда экспрессия Fgf3 блокировалась в эксплантах на ст. HH10 (Represa et al., 1991). На этой стадии отические плакоды уже завершают свое образование и детерминированы формировать отический пузырек (Groves and Bronner-Fraser, 2000). Инвагинация отической плакоды блокировалась антителами, которые были приготовлены против эпитопа, присутствующего в белке FGF3 эмбрионов кур (Represa et al. , 1991). Сходные результаты были получены в присутствии анти-смысловых олигонуклеотидов, направленных против Fgf3, хотя используемые последовательности базировались на человеческом FGF3 и поэтому содержали некоторые несовпадения (Mahmood et al., 1995). Тем не менее теперь имеются важные доказательства, что экспрессия Fgf3 в заднем мозге, начиная со ст. HH8 и далее, по-видимому, необходима для инвагинации отических плакод. Сходным образом результаты эктопической избыточной экспрессии Fgf3 в поверхностной эктодерме и нервной трубке на ст. HH8 in vivo у интактных эмбрионов подтверждают эту гипотезу (Vendrell et al. , 2000; Zelarayan et al., 2007). Эти эксперименты приводили к увеличению размеров эндогенных отических плакод и кроме того к образованию эктопических отических плакод и пузырьков в широкой области поверхностной эктодермы (Vendrell et al. , 2000), что отражает широко распространенную компетентность отвечать на FGF3. Хотя эти эксперименты не исключают непрямого действия FGF3 на образование отических плакод посредством др. сигналов, напр., из соседней мезодермы, они скорее всего воспроизводят действие FGF3 из его натуральных источников на этой стадии (напр., задняя часть заднего мозга) путем стимуляции образования дополнительных отических плакод в компетентной поверхностной эктодерме. Интересно, что изолированная не-отическая эктодерма на ст. HH8 и ещё раньше (0-4ss) индуцирует отические, но не нейральные или мезодермальные маркеры после воздействия FGF2, что также подтверждает непосредственное действие FGF сигнала на эктодерму (Martin and Groves, 2006). Наконец, нокдаун Fgf3 в фарингеальной энтодерме на ст. HH8 также блокирует инвагинацию плакод (Zelarayan et al., 2007). Т.о., FGF3, производные заднего мозга и энтодермы, необходимы для этого процесса.
Потенциал FGF3 сигнала подчеркивается также избыточной экспрессией FGF2, FGF8 или FGF10 на ст. HH8 в поверхностной эктодерме интактного эмбриона, который неспособен индуцировать эктопические плакоды (Vendrell et al., 2000; Y. Alvarez and T.S., unpublished observations). Однако, имплантация кусочков FGF2 в мезодерму вблизи будущих отических плакод на ст. HH8 in vivo вызывает образование маленьких эктопических плакод с низкой частотой (V. Vendrell and T.S., unpublished observations). Сходным образом FGF2 индуцирует маленькие эктопические плакоды вблизи эндогенного отического пузырька после имплантации кусочков на ст. HH10 HH11 (Adamska et al. , 2001). Эта активность снова может отражать способность FGF2 активировать изоформы всех 4-х FGF рецепторов и тем самым способствовать также образованию эктопических отических плакод, хотя в меньшей степени, чем FGF3. FGF2 и FGF8 кусочки имплантированные в мезодерму также повышают экспрессию генов отических маркеров и размер нормального отического пузырька (Adamska et al. , 2001). Эти результаты могут отражать паттен-формирующую функцию передачи сигналов FGF в отическом пузырьке, что было также подтверждено на рыбках данио (Leger and Brand, 2002).

Functional analysis of FGFs in mouse inner ear induc- tion


Достаточность FGFs из развивающегося заднего мозга для индукции эктопических отических плакод тестировалась на трансгенных мышах (Alvarez et al. , 2003). Разные члены семейства FGF эктопически экспрессировали в r3 и избыточно экспрессировали в r5 со ст. 3ss (Theil et al., 1998; Alvarez et al., 2003). Неправильная экспрессия Fgf3, чье эндогенное начало экспрессии в заднем мозге совпадает с этой стадией (Wright and Mansour, 2003a) обнаруживала лишь очень ограниченную способность индуцировать эктопические отические пузырьки (Alvarez et al., 2003). Напротив, неправильная экспрессия Fgf10, чье эндогенное начало экспрессии в заднем мозге происходило чуть позднее на ст. 5ss, приводило соответственно к образованию эктопических пузырьков рядом с r3-r5, которые также экспрессировали некоторые отические маркеры (Alvarez et al., 2003). Интересно, что сравнительно недавний анализ этих трансгенных животных показал, что эктопическая экспрессия Fgf8 сопровождает неправильно экспрессирующих Fgf10 эмбрионов, но не следует за эктопической экспрессией Fgf3, указывая тем самым на позитивную роль FGF8 во время индукции эктопических отических плакод (Zelarayan et al., 2007). Однако, эктопическая экспрессия Fgf8 в r3 и r5 ведет к ранней эмбриональной летальности и тем самым препятствует анализу трансгенных эмбрионов во время отической индукции (Alvarez et al., 2003 and unpublished observations). Сходным образом нулевые мутанты по Fgf8 выявили существенную роль для этого гена во время гаструляции и поэтому обнаруживающего раннюю эмбриональную летальность (Meyers et al., 1998). Т.о., поскольку трудно оценить специфическую роль раннего паттерна экспрессии Fgf8 в мезодерме и энтодерме на ст. E7-E8 во время отической индукции (Ladher et al. , 2005). Мутантные мыши, несущие гипоморфный или условный аллель, который инактивируется мозаично, начиная с E7 и далее, рядом с Fgf8 нулевым аллелем, формируют отические пузырьки (Ladher et al., 2005; Zelarayan et al., 2007). Следовательно, пока не получены доказательства уникальной потребности в FGF8 во время индукции внутреннего уха. Ткане-специфическая инактивация Fgf8 в мезодерме или энтодерме может обходить раннюю летальность и показывать уникальную потребность в FGF8 в этих тканях во время индукции внутреннего уха.
Нулевые мутанты по Fgf3 или Fgf10 формируют отические пузырьки, хотя и уменьшенных размеров (Ohuchi et al. ,2000; Alvarez et al. , 2003; Wright and Mansour, 2003b). Fgf3 м. также обнаруживать более вентрально локализованные отические пузырьки и альтерации в экспрессии отических маркеров разными способами (Wright and Mansour, 2003a; Ladher et al. , 2005). У людей гомозиготные мутации FGF3, которые являются скорее всего результатом нефункциональных белков ассоциированы с новой формой синдромальной глухоты, характеризующейся агенезом внутреннего уха (Tekin et al. , 2007). Обусловленные отсутствием структур внутреннего уха у пациентов, что указывает на то, что нарушено развитие внутреннего уха на очень ранней стадии.
Мышиные мутанты по изоформе FGF receptor 2 IIIb, с которой соединяются FGF3 и FGF10 с высоким сродством, также формируют маленькие отические пузырьки (Pirvola et al., 2000). Наконец, хотя мышиный FGF15 достаточен для индукции отических маркеров на ст. 4/5 в ростральной эктодерме кур, Fgf15 нулевые мутантные эмбрионы мышей формируют нормальные отические пузырьки (Wright et al., 2004). Сходным образом, фенотипы внутреннего уха отсутствуют у нулевых мутантов FGF рецептору 4, с которым соединяется FGF15 с высоким сродством (Weinstein et al., 1998).
В противоположность мутантным мышам, которые лишены одного из членов семейства FGF генов, FGF двойные мутанты являются более информативными по демонстрации роли FGFs во время индукции внутреннего уха, так выявляется значительное перекрывание между членами семейства. Гомозиготные нулевые мутантные эмбрионы по Fgf3 и Fgf10 или целиком лишены отических пузырьков или обнаруживают образование микропузырьков (Alvarez et al., 2003; Wright and Mansour, 2003a). Более того, формируемые микропузырьки вентрализованы и локализованы более удаленно от нервной трубки по сравнению с контрольными эмбрионами (Figure 2A,C; Alvarez et al., 2003; Wright and Mansour, 2003a). Некоторые из микропузырьков экспрессируют отические гены, тогда как др. обнаруживают уменьшение или отсутствие окраски на отические маркеры, включая Pax2 и Dlx5 (Alvarez et al. , 2003; Wright and Mansour, 2003a). Изредка развитие этих микропузырьков продолжается до поздней стадии развития внутреннего уха, при этом обнаруживаются дефекты в дорсальной



Fig. 2. Inner ear phenotypes of Fgf3-/-/Fgf10-/- and Fgf3-/-/Fgf8flox/d2,3; Mox2Cre/+ mutant mouse embryos. Sections through the developing inner ear of wild-type (A,B), Fgf3-/-/Fgf10-/- (C,D) and Fgf3-/- /Fgf8flox/d2,3 ; Mox2Cre/+ mutants (E,F) around E9-10 and E12-13. (A,C) Compared to wild-type embryos the otic vesicle is smaller and in a more ventral and distal position from the neural tube (nt) in Fgf3-/-/Fgf10-/- mutants. (B,D) During otic vesicle differentiation Fgf3-/- /Fgf10-/- embryos only form a single semicircular canal (c) whereas the posterior (pc), lateral (lc) and anterior semicircular canals (not shown) are observed in wild-type embryos. (E,F) Fgf3-/- /Fgf8flox/d2,3 ; Mox2Cre/+ mutants form microvesicles that are often found in a dorsal position in close proximity to the neural tube (nt).

вестибулярной части внутреннего уха (Fig. 2D; Zelarayan et al. 2007). Сходные дефекты могут наблюдаться у мутантных эмбрионов, гомозиготных по нулевой мутации Fgf3 и несущих один мутантный нулевой аллель Fgf10 (Zelarayan et al., 2007). Образование плакод и экспрессия маркеров отических плакод были проанализированы на E8 у Fgf3-/-/Fgf10-/- двойных мутантов (Alvarez et al. , 2003; Wright and Mansour, 2003a). Ткань плакод и некоторые маркеры отических плакод всё ещё обнаруживаются у этих мутантов. Однако, дорсальная часть плакодной эктодермы неспособна формироваться и т.о., экспрессия отических маркеров, включая Pax2 или Dlx5 отсутствует в этой области или в некоторых случаях отсутствует целиком во всей плакоде (Alvarez et al., 2003; Wright and Mansour, 2003a).
Двойные мутанты по Fgf3 и Fgf8 дают сходный фенотип ч двойными мутантами to Fgf3-/-/Fgf10-/- (Ladher et al., 2005; Zelarayan et al., 2007). Мутантные эмбрионы, несущие гипоморфный и нулевой аллель Fgf8 на гомозиготном нулевом мутантном Fgf3 фоне (Fgf3-/-/Fgf8neo/neo) не образуют отических пузырьков и лишены экспрессии отических маркеров в дорсальной части плакодной эктодермы (Ladher et al., 2005). Интересно, что эти мутантны обнаруживают также подавление экспрессии Fgf10 в мезодерме во время индукции внутреннего уха, указывая тем самым, Fgf3 и Fgf8 перекрываются в своей необходимости для нормальной экспрессии Fgf10. Сходным с Fgf3-/-/Fgf8neo/neo мутантами образом эмбрионы, несущие нулевой аллель и мозаично делетированный условный аллель Fgf8 на гомозиготном нулевом Fgf3 мутантном фоне ( Fgf3-/-/Fgf8flox/d2,3;Mox2Cre/+) также обнаруживают тяжелый фенотип, который возникает в результате образования микропузырьков, которые находятся в аномальном дорсальном положении вблизи нервной трубки (Fig. 2E; Zelarayan et al., 2007). Эти микропузырьки обнаруживают отсутствие или аномальную экспрессию отических маркеров. На более поздних стадиях эти микропузырьки неспособны дифференцироваться или полностью теряют отическую ткань (Fig. 2F; Zelarayan et al., 2007). Всё это вместе со сравнением фенотипов Fgf3-/-/Fgf10-/- и Fgf3/Fgf8 двойных мутантных комбинаций, указывает, что последние мутанты имеют несколько более тяжелые фенотипические изменения во внутреннем ухе (Ladher et al., 2005; Zelarayan et al., 2007). Это подтверждает более выраженную роль FGF8 скорее, чем FGF10 во время индукции внутреннего уха, возможно благодаря более ранней и более широко распространенной экспрессии Fgf8 в некоторых тканях, участвующих в отической индукции. Инактивация и Fgf8 и Fgf10 д. приводить к ещё более тяжелому фенотипу, т.к. Fgf8 и Fgf10 экспрессируются прежде Fgf3 и скорее всего, чтобы инициировать отическую индукцию в качестве ранних энтодермальных и/или мезодермальных сигналов.
Проверка заднего мозга у Fgf3-/-/Fgf10-/- and Fgf3-/-/Fgf8neo/neo мутантных эмбрионов показала отсутствие изменений в экспрессии маркеров заднего мозга, указывающее, что FGFs не действуют непосредственно на отическую индукцию посредством котроля за формированием паттерна заднего мозга, как это предполагается у рыбок данио (Wright and Mansour, 2003a; Ladher et al. , 2005). Т.к. рецепторы высокого сродства для FGF3 и FGF10 экспрессируются в преплакодной эктодерме, то по крайней мере, эти два FGFs могут действовать непосредственно, чтобы устанавливать экспрессию отических маркеров в будущей отической плакоде (Wright and Mansour, 2003a). Интересно, что более недавние исследования выявили. что эктопическая экспрессия Fgf10 из заднего мозга достаточна, чтобы нормализовать развитие отических пузырьков у Fgf3-/-/Fgf10-/- мутантных эмбрионов (Zelarayan et al., 2007). Это указывает на то, что FGF сигнал из нервной ткани (заднего мозга) может инструктировать по-новому плакодную эктодерму у этих мутантов, чтобы формировать отические пузырьки. Т.к. формирование плакодной ткани лишь частично нарушается у мутантных Fgf3-/-/Fgf10-/- эмбрионов, то инициальные ступни индукции плакод д. поддерживаться за счет экспрессии Fgf8, который присутствует в различных тканях во время ранней отической индукции (Ladher et al. , 2005). Fgf3 и Fgf10 т.о., возможно, усиливают и поддерживают индукцию внутреннего уха, инициируемую с помощью Fgf8.

Functional analysis of FGFs in zebrafish, medaka and Xenopus inner ear induction


Эффекты потери FGF3 или FGF8 на индукцию внутреннего уза у рыбок данио были тестированы у мутантов и с помощью morpholino нокдауна. Используя оба подхода, наблюдали уменьшение размеров отических пузырьков вместе с уменьшением или потерей отических маркеров (Phillips et al., 2001; Leger and Brand, 2002; Maroon et al., 2002; Liu et al., 2003). Размеры отических пузырьков у Fgf8 morphants выглядели несколько меньшими, чем у Fgf3 morphants, возможно из-за непрекрываемой потребности в FGF8 во время формирования паттерна заднего мозга, влияющего на отическую индукцию (Wiellette and Sive, 2004). Центральная роль заднего мозга во время индукции внутреннего уха также подчеркивается тем фактом, что только клетки заднего мозга дикого типа восстанавливают экспрессию Pax2 у Fgf8 мутантных эмбрионов в экспериментах с трансплантациями клеток (Leger and Brand, 2002).
Более того эктопическая экспрессия Fgf3 или Fgf8 индуцирует отические маркеры и формирование эктопических отических пузырьков у рыбок данио, Medaka и Xenopus (Lombardo et al. , 1998; Phillips et al. , 2001; Bajoghli et al. , 2004; Hans et al. , 2004; Phillips et al. , 2004; Solomon et al., 2004). Первоначально косвенный способ для эктопической экспрессии и Fgf3 и Fgf8 был достигнут обработкой рыбок данио дикого типа ретиноевой кислотой (Phillips et al., 2001). Это приводило к экспансии доменов экспрессии Fgf3 и Fgf8 и отического маркера Pax8 и приводило к образованию эктопических пузырьков. Однако, обработка ретиноевой кислотой может оказывать плейотропные эффекты в таких экспериментах, т.к. нервная пластинка posteriorized и область заднего мозга расширяется (Phillips et al. , 2001).
Более недавние эксперименты были использованы для демонстрации, что FGF-зависимая отическая индукция с помощью ретиноевой кислоты может также происходить без нарушения формирования паттерна нервной пластинки (Hans et al. , 2007). Сходным образом, плазмидой обусловленная эктопическая экспрессия Fgf3 или Fgf8 на 8-клеточной стадии ведет к эктопической или расширенной экспрессии отических маркеров Pax8, Pax2a и Dlx3b без экспансии нервной пластинки (Phillips et al., 2004; Solomon et al., 2004). Чтобы лучше контролировать время эктопической экспрессии FGF во время отической индукции у эмбрионов, использовали индуцируемые теплом промоторы для Fgf8 у Medaka и недавно у рабок данио (Bajoghli et al. , 2004; Hans et al. , 2007). В последнем случае ранняя эктопическая экспрессия Fgf8 вплоть до ст. средней гаструлы, как было установлено, действительно редуцирует количество отической ткани, возможно из-за её эффектов на формирование дорсо-вентрального паттерна, что негативно влияет на экспрессию Foxi1 и Dlx3b, которые необходимы в качестве факторов компетентности для FGF-зависимой отической индукции. Напротив, более крупные отческие пузырьки получались, когда эктопическая экспрессия Fgf8 осуществлялась между концом гаструлы и ранними стадиями сегментации, возможно благодаря индукции более крупной области компетентной эктодермы, чтобы принять отическую судьбу (Hans et al., 2007). Эксперименты по выявлению перекрываемости FGF3 и FGF8 при формировании отических плакод продемонстрировали это в некоторых исследованиях (Phillips et al., 2001; Leger and Brand, 2002; Maroon et al., 2002; Liu et al. , 2003). Все исследования согласуются, что мутанты или морфанты рыбок данио, лишенные FGF3 и FGF8 обнаруживают тяжелую потерю или отсуствие отических тканей и маркеров. Однако, существуют некоторые расхождения относительно присутствия или отсутствия самых ранних маркеров, указывающих на отическую судьбу, Pax8, у Fgf3/Fgf8 двойных мутантов. В то время как большинство исследований описывает тяжелую редукцию или отсутствие этого маркера (Phillips et al., 2001; Leger and Brand, 2002; Liu et al., 2003) в одном исследовании сообщается, что поддержание нормальной экспрессии Pax8 снижено наполовину у двойных мутантных эмбрионов (Maroon et al., 2002). В сходном эксперименте эти авт. продемонстрировали также неизменную экспрессию Pax8 после блокирования передачи сигналов через FGF рецепторы с помощью SU5402. Напротив, Leger and Brand (2002) отмечали отсутствие экспрессии Pax8 при использовании даже более низких концентраций SU5402, чем у Maroon et al. (2002). Больше согласуются оба исследования относительно отсутствия отического маркера Pax2 после обработки SU5402 до сегментации, но отличаются опять же по эффектам SU5402 на поддержание Pax2 на более поздних стадиях (Leger and Brand, 2002; Maroon et al., 2002). Оставшаяся отическая ткань у некоторых Fgf3/Fgf8 двойных мутантов, как было показано, согласуется только с немногими рассеянными плакодными клетками, указывая, что способность формировать плакодный эпителий потеряна (Liu et al., 2003). В случае двойных мутантных эмбрионов, у которых экспрессия Pax8 не обнаруживалась, не наблюдались и морфологические признаки образования отических плакод, поэтому можно сделать вывод, что достигается полная потеря индукции отической плакоды.
Потеря FGF3 и FGF8 затрагивает также развитие задней части заднего мозга (Maves et al. , 2002; Walshe et al. , 2002), где мишени для передачи сигналов через FGF рецепторы подавлены в заднем мозге и отической области (Maroon et al. , 2002). Следовательно, область заднего мозга, где ко-экспрессируются Fgf3 и Fgf8 играет важную роль в индукции внутреннего уха у рыбок данио. Однако, оба FGFs экспрессируются также в др. тканях, участвующих в индукции внутреннего уха, таких как цефалическая параксиальная мезодерма (Mendonsa and Riley, 1999; Phillips et al., 2001; Thisse et al. , 2001; Nechiporuk et al. , 2007). Мутанты или морфанты рыбок данио по one-eyed pinhead (oep), которые лишены мезоэнтодермальной ткани, расположенной под отической плакодой, обнаруживают потерю Fgf3 и Fgf8 из их мезоэнтодермальных доменов экспрессии (Phillips et al. , 2001; Leger and Brand, 2002; Nechiporuk et al., 2007). В обоих случаях экспрессия в заднем мозге Fgf3 и Fgf8 не затрагивалась во время индукции внутреннего уха. Однако, всё же в одном исследовании сообщается о нормальной экспрессии отических маркеров, включая Pax8 (Leger and Brand, 2002), Phillips et al. (2001) показали, что экспрессия этого отического маркера снижена, что указывает на возможную потребность в FGF3 и/или FGF8 для индукции внутреннего уха у заднего мозга.
Следовательно, сегодня неясно, какие домены экспрессии Fgf3 и Fgf8 необходимы для индукции внутреннего уха у рыбок данио. Модель, которая рассматривает передачу сигналов FGF в кооперации с Wnt8 во время индукции отических плакод, первоначально была предложена при анализе эмбрионов кур была детализирована на рыбках данио(Ladher et al. , 2000; Phillips et al. , 2004). Эктопическая экспрессия Fgf3 или Fgf8, как было показано, достаточна для индукции эктопических отических плакод в отсутствие Wnt8. Однако, глобальная эктопическая экспрессия Wnt8 также индуцирует эктопическую отическую ткань, но этот эффект, как было установлено, зависит от экспансии доменов экспрессии Fgf3 и Fgf8. Наконец, отическая индукция и экспрессия Fgf3 и Fgf8 оказывалась задержанной у морфантов Wnt8. Напротив, экспрессия Wnt8 в заднем мозге также была редуцирована у двойных мутантов Fgf3/Fgf8, это позволяет постулировать существование позитивной петли обратной связи, которая гарантирует своевременную экспрессию Fgf3 и Fgf8 в заднем мозге, которая затем действует непосредственно на преплакодные клетки, индуцируя отические судьбы(Phillips et al., 2004).
В некоторых исследованиях были проанализировано взаимодействие передачи сигналов FGF3 и FGF8 с транскрипционными факторами, экспрессирующимися во время индукции внутреннего уха в преплакодной поверхностной эктодерме. Foxi1, как было показано, необходим для индукции экспрессии Pax8, обеспечиваемой с помощью передачи сигналов FGF (Hans et al. , 2004; Solomon et al. , 2004; Hans et al. , 2007). Foxi1 поэтому был назван как фактор компетентности для FGF3 и FGF8, который делает возможным приобретение отической судьбы преплакодыми клетками, что демонстрируется экспрессией Pax8 (Nissen et al. , 2003; Hans et al., 2004; Solomon et al., 2004; Hans et al. , 2007). С др. стороны, Pax8 morphants обнаруживают более выраженные дефекты во время индукции внутреннего уха на Fgf8 мутантном фоне, чем в присутствии Fgf3 morpholinos, снова указывая на более доминантную роль FGF8 по сравнению с FGF3 (Wiellette and Sive, 2004; Mackereth et al. , 2005). Вторая пара факторов компетентности для передачи сигналов FGF, Dlx3b и Dlx4b, необходима для собственно инициации экспрессии Pax2a на более поздних стадиях (Hans et al., 2004; Mackereth et al., 2005). Экспрессия Sox9a, как установлено, зависит от передачи сигналов FGF посредством экспрессии Pax8, а позднее поддержание экспрессии Sox9a зависит от Pax2a (Hans et al. , 2004). Наконец, у рыбок данио Atoh1b, гомолог Atoh1, который необходим для дифференцировки волосковых клеток у мышей (Woods et al., 2004), как недавно было показано, необходим в преплакодной эктодерме рыбок данио (Millimaki et al. , 2007). Atoh1b ко-экспрессируется с Pax8 в преплакодной эктодерме во время ранней сегментации и нуждается в передаче сигналов FGF. Более детальные схемы взаимодействия транскрипционных факторов и предачи сигналов FGF во время отической индукции можно найти в исследованиях Hans et al., (2004), Solomon et al. (2004) и Millimaki et al. (2007).
У Xenopus, экспрессия доминантно негативного FGF рецептора выявляет редукцию экспрессии Sox9 (Saint-Germain et al. , 2004). Morpholinos, направленные против Sox9 ведут к отсутствию экспрессии Pax8, а отические пузырьки не образуются. Это привело к предположению, что Sox9 может быть иерархически выше Pax8, но это можно объяснить и позитивной петлей обратной связи между генами, чтоб поддерживать экспрессию один другого (Liu et al. , 2003; Hans et al. , 2004).

Summary and outlook


The expression studies of different FGF members during inner ear induction confirm their sequential presence in endomesodermal and neural tissue during inner ear induction. Direct evidence for the necessity of a single FGF member during the initiation of inner ear induction (before otic specification) only currently exists for FGF8 in the chicken endoderm (Ladher et al., 2005). Moreover, the sufficiency and necessity of FGF8 to induce FGF19 in the overlying mesoderm indicates that this event represents an important step during chicken inner ear induction. However, at present direct evidence for the necessity of FGF19 for inner ear induction is lacking. Since Fgf3 is induced by FGF19 and both are coexpressed in the mesoderm (Ladher et al. , 2000; Kil et al. , 2005) the necessity and sufficiency of FGF3 in the mesoderm for the early phase of inner ear induction is certainly worth testing.
The significance of the early mesodermal and/or endodermal expression of Fgf8 together with Fgf10 in mouse or Fgf3 in zebrafish during inner ear induction has not yet been directly addressed. Tissue-specific inactivation of Fgf8 or Fgf10 in a Fgf3 homozygous null mutant background during this phase will pro- vide useful information on the necessity of these expression domains for otic induction in the mouse. The second phase of inner ear induction (after otic specification and before otic commit- ment) is clearly defined by the conserved expression of Fgf3 in the developing hindbrain in all vertebrates. Since in the mouse, Fgf3 expression is not present in endoderm or mesoderm at or before this stage, the effects on inner ear induction seen in Fgf3-/-/Fgf10-/- and Fgf3/Fgf8 double knockout mice have to be attributed entirely to the loss of hindbrain Fgf3 expression. Interestingly, at this stage Fgf10 and Fgf19 which are initially expressed in the mesoderm are now present in the ventral part of the hindbrain in mouse and chicken, respectively, from where they may partici- pate in otic induction (Ladher et al., 2000; Alvarez et al., 2003). Knockdown of Fgf3 in chick hindbrain interferes with placode invagination but more severe phenotypes may be obtained upon inactivation at an earlier stage (Zelarayan et al., 2007).
Fgf3/Fgf8 double mutants in zebrafish have a more severe phenotype than both Fgf3-/-/Fgf10-/- and Fgf3/Fgf8 double mutants in mouse. While the zebrafish mutants often completely lack placodal tissue (Phillips et al. , 2001; Leger and Brand, 2002), mouse mutants usually still form some placodal ectoderm or microvesicles (Alvarez et al., 2003; Wright and Mansour, 2003a; Ladher et al. , 2005). These phenotypes may be caused by a complete loss of Pax8 expression in the zebrafish double mu- tants, whereas this marker is reduced but still present in the double mouse mutants. In contrast, Pax2 expression which is activated after Pax8 expression during otic development, is more consistently absent from placodal tissue in both zebrafish and mouse FGF double mutants. The residual Pax8 expression at (and possibly before) E8 in mouse FGF double mutants may be sufficient for the formation of some placodal tissue. However, by analogy to the zebrafish, absence of Pax2 and Dlx genes then may also lead to the loss of responsiveness to FGF signalling in the murine otic placode and thus to the formation of microvesicles or complete absence of otic tissue at later stages.
It has been suggested that the ventral part of the placodal ectoderm, which continues to express some otic genes in FGF double mouse mutants, may contribute to the epibranchial pla- codes (Groves, 2005). In zebrafish it has recently been shown that Sox3 defines the common primordium of the otic and epibranchial placodes (Sun et al. , 2006; Nikaido et al. , 2007). This Sox3-positive primordium then segregates into a Pax2a-positive medial area and a Pax2a-negative lateral area, giving rise to the otic and epibranchial placodes, respectively. Disruption of FGF signalling in FGF zebrafish mutants or by using SU5402 leads to a loss of Sox3 expression and a failure to form the epibranchial placodes (Sun et al., 2006; Nechiporuk et al., 2007; Nikaido et al., 2007). It will thus be interesting to further define the differential requirements for the induction of the otic placode versus the epibranchial placode, for example by examining expression of Sox3 and the formation of the epibranchial placode in mouse FGF double mutants.
Сайт создан в системе uCoz