Посещений:
Отическая Плакода

Механизмы Образования

The first steps towards hearing: mechanisms of otic placode induction
TAKAHIRO OHYAMA, ANDREW K. GROVES* and KAREEN MARTIN
Int. J. Dev. Biol. 51: 463-472 (2007) doi: 10.1387/ijdb.072320to

The entire inner ear, together with the neurons that innervate it, derive from a simple piece of ectoderm on the side of the embryonic head – the otic placode. In this review, we describe the current state of the field of otic placode induction. Several lines of evidence suggest that all craniofacial sensory organs, including the inner ear, derive from a common “pre-placodal region” early in development. We review data showing that assumption of a pre-placodal cell state correlates with the competence of embryonic ectoderm to respond to otic placode inducing signals, such as members of the fibroblast growth factor (FGF) family. We also review evidence for FGF-independent signals that contribute to the induction of the otic placode. Finally, we review recent evidence suggesting that Wnt signals may act after FGF signaling to mediate a cell fate decision between otic placode and epidermis.

Образование отических плакод является самым ранним видимым морфологическим событием в развитии внутреннего уха. Это простой слой утолщенной эктодермы, лежащий рядом с задним мозгом, а пока ещё не описанный участок кожи дает один из наиболее сложных сенсорных органов тела, продуцируя клеток, такие как механосенсорные волосковые клетки и нейроны vestibulo-acoustic ганглия, который передает слуховую и балансовую информацию в головной мозг. Развитие такой сложной структуры из простейшего источника использует серию изменений в отической эктодерме, которые являются результатом последовательных индуктивных сигналов, исходящих от соседних тканей и внутри самого уха. Образование внутреннего уха т.о. предоставляет прекрасную модель для изучения принципов эмбриональной индукции.
Отическая плакода становится видимой после гаструляции, закладывающей план тела эмбрионов позвоночных, обычно после возникновение первых 5-10 пар сомитов. Плакода затем инвагинирует, чтобы образовать пузырек, отоцист, который будет развиваться в различные компоненты внутреннего уха: улитку, полукружные каналы и ассоциированные с ними сенсорные органы - cristae - и сенсорную maculae в utricle и saccule, вместе с vestibulo-acoustic ганглием. Хотя индукция отической плакоды исследуется давно, ранние исследования получили морфологические доказательства формирования уха, такие как образование отического пузырька и сенсорных органов, которые безусловно наступают после молекулярных и генетических сигнальных событий, которые и индуцируют индукцию. Возникновение молекулярной биологии и генетики сделало возможным более тонкий анализ этого процесса с использованием молекулярных маркеров, ассоциированных с ушными тканями и выявили кандидатов на роль индукторов. Возможность манипулировать эмбрионами и методы экспрессии специфических отических маркеров выявили множественные индуктивные ступени в индукции отических плакод. Предполагается, что сначала происходит образование области компетентной для всех черепно-лицевых сенсорных плакод - т. наз. "pre-placodal domain". Вторая ступень - это индукция "pre-otic field" внутри преплакодного домена, которое последовательно подразделяется на отическую плакоду и окружающий не-отический эпидермис на третьей индуктивной ступени.

Evidence for a pre-placodal domain


Все черепно-лицевые сенсорные органы (нос, хрусталики, уши тройничные и epibranchial ганглии и латеральная линия) возникают из плакодных структур, расположенных на периферии нервной пластинки (reviewed in Baker and Bronner-Fraser, 2001; Brugmann and Moody, 2005). Растут доказательства, подтверждающие идею, что эти плакоды происходят из общего преплакодного домена, состоящего из узкой полоски эктодермы, которая соответствует передней части нервной пластинки, которая возникает в конце гаструляции (Baker and Bronner-Fraser, 2001, Streit, 2004, Brugmann and Moody, 2005, Bailey and Streit, 2006). Современная гипотеза черепно-лицевого развития предполагает, что краниальные плакоды формируются в две ступени. Первая ступень - это приобретение общего плакодного состояния в эктодермальном домене, соседствующем с нейральной эктодермой. Вторая ступень - детерминация качественных особенностей каждой из плакод локальными индуцирующими сигналами (Fig. 1). Streit и др. обсуждают формирование паттерна преплакодного домена. Ни же мы коротко представим доказательства существования преплакодного домена.
Морфологические доказательства: Морфологические исследования на мышах, людях, некоторых видах рыб и амфибий показали присутствие утолщенной непрерывной полоски эктодермы, идущей вдоль передней части нервной пластинки, где будут расположены в последствие плакоды (Platt, 1896, Knouff, 1935, van Oostrom and Verwoerd, 1972, Verwoerd and van Oostrom, 1979, O'Rahilly and Muller, 1985, Braun, 1996, Miyake et al. , 1997). Это утолщение становится ограниченным разными плакодами, когда они дифференцируются. Однако, утолщение всей преплакодной эктодермы, по-видимому, не является универсальным признаком, т.к. оно не наблюдается у видов, таких как эмбрионы кур и рыбки данио (Baker and Bronner-Fraser, 2001, Streit, 2004).
Экспериментальные доказательства: Экспериментальные доказательства преплакодного домена получены в эмбриологических исследованиях, осуществлённых на амфибиях Jacobson в 1960s (rev. Jacobson, 1966). Они были связаны с ротацией полоски эктодермы, лежащей рядом с передней частью нервной пластинки, относительно передне-задней оси (Jacobson, 1963). Если ротации проводили на ст. открытой нервной пластинки, то носовая, хрусталиковая и отическая плакоды формировались в правильном положении, указывая тем самым. что ротированная эктодерма компетентна на ранних стадиях формировать множественные плакоды. Однако, если ротации проводили на более поздних стадиях, то плакоды формировались в несоответствующих местах, т.е. они уже оказывались детерминированными к специфическим плакодным судьбам. Недавно исследования карт судеб у эмбрионов рыб и кур показали, что клетки предшественники для разных плакод первоначально часто перекрываются прежде, чем конвергировать к своему финальному предназначению и дифференцироваться (Kozlowski et al. , 1997, Whitlock and Westerfield, 2000, Streit, 2002, Bhattacharyya et al. , 2004). Недавние исследования развития хрусталика продемонстрировали, что преплакодный домен может быть временно специфицирован, чтобы давать хрусталиковую ткань, позднее же локальные сигналы, такие как FGFs, ограничивают хрусталиковую ткань её специфическим местоположением, индуцируя также обонятельную плакоду (Bailey et al. , 2006).
Молекулярные доказательства: Исследования генной экспрессии показали, что преплакодный домен может быть визуализован как определенная молекулярная единица, характеризующаяся рядом генов. принадлежащих семействам Dlx, Six, Eya, Iro, BMP, Foxi и Msx (Glavic et al. , 2004, Ohyama and Groves, 2004a, Streit, 2004, Brown et al. , 2005). Потеря и избыток функции некоторых из этих генов приводят к расширению или уменьшению преплакодного поля (Brugmann et al., 2004, Glavic et al., 2004, Litsiou et al., 2005); это ассоциирует также с экспансией или ингибированием домена экспрессии некоторых специфичных для плакод генов (Glavic et al., 2004). Остается установить, какие из этих семейств генов или необходимы или достаточны для формирования индивидуальных плакод.

Otic placode induction


Какие же ткани компетентны давать отические плакоды и когда индукция начинается и заканчивается?

Genes expressed in the presumptive otic ectoderm


Чтобы ответить на эти вопросы необходимо иметь панель генов, маркирующих отическую область. Несколько генов было обнаружено, специфически экспрессирующихся в регионе, который был действительно утолщен, чтобы сформировать отическую плакоду. Самым ранним ушным маркером является foxi1 у рыбок данио (Solomon et al., 2003). Однако, ни один из мышиных или куриных генов класса Foxi не экспрессируется в ранних отических плакодах (Ohyama and Groves, 2004a; A. Groves, unpublished observations), хотя мышиный Foxi3 маркирует весь преплакодный домен на чуть более ранней стадии. Вторым из ранних молекулярных маркеров является Pax8, который экспрессируется в презумптивной отической эктодерме у рыб, лягушек и мышей (Pfeffer et al., 1998, Heller and Brandli, 1999, Ohyama and Groves, 2004b). Экспрессия Pax2 появляется вскоре после этого, хотя его домен сначала больше, чем отическая плакода у кур и мышей (Nornes et al., 1990, Krauss et al., 1991, Groves and Bronner-Fraser, 2000) Ряд сигнальных молекул (FGFs, BMP7) и транскрипционных факторов (Eya1, GATA3, Nkx5.1, Gbx2, Sox3, Sox9) экспрессируются в отической эктодерме до инвагинации (George et al., 1994, Rinkwitz-Brandt et al., 1995, Wright et al., 1995, Penzel et al., 1997, Shamim and Mason, 1998, Sahly et al., 1999, Sheng and Stern, 1999, Solloway and Robertson, 1999, Wood and Episkopou,



Fig. 1. The Two-Step model of placode induction. (Step1) A general placodal state (pan-placodal domain) is induced in an ectodermal domain surrounding the neural ectoderm (see accompanying article by Streit in this issue). (Step 2) Different craniofacial placodes are induced in response to specific molecular signals. In the case of the otic placode, some of the inducing signals come from members of the fibroblast growth factors (FGFs).

1999, Xu et al., 1999, Groves and Bronner-Fraser, 2000, Liu and Joyner, 2001, Sanchez-Calderon et al., 2002).
Роли некоторых генов, экспрессирующихся во время отической индукции исследованы у рыбок данио. Нарушения foxi1 у мутантов hearsay приводят к тяжелым дефектам или отсутствию образования отических плакод (Solomon et al., 2003). Отическая экспрессия ранних маркеров, pax8, pax2a и dlx3b также редуцируется или отсутствует у foxi1 мутантов (Nissen et al., 2003, Solomon et al., 2003). Нокаутные по Foxi1 мыши были получены и в противоположность рыбам не обнаруживали дефектов раннего образования отических плакод, хотя более позднее развитие уха было аномальным (Hulander et al., 1998, Hulander et al., 2003). У рыбок данио гены dlx3b и dlx4b экспрессируются в презумптивной отической эктодерме вскоре после foxi1, но раньше pax2a. Их участие в формировании отических плакод впервые было продемонстрировано на b380 мутантах, содержащих крупную делецию, которая удаляла несколько генов, включая dlx3b, dlx4b и sox9a (Liu et al., 2003). Мутанты b380 полностью лишены отических узелков (Solomon and Fritz, 2002). Morpholino нокдаун dlx3b и dlx4b дает менее выраженный фенотип, чем у b380 мутантов с серьёзными дефектами образования отоциста, а также с отсутствием экспрессии pax2a (Solomon and Fritz. 2002). Целенаправленное нарушение dlx3b, dlx4b и sox9a приводит к полной потере отической ткани, воспроизводя фенотип, наблюдаемый у мутантов b380 (Liu et al., 2003). В отличие от foxi1 мутантов, morpholino нокдауны dlx3b и dlx4b всё ещё экспрессируют pax8. Итак, эти результаты подтверждают модель, согласно которой foxi1 д. участвовать в индукции pax8, тогда как dlx3b и dlx4b д. участвовать позднее в индукции pax2 (Hans et al., 2004, Solomon et al., 2004). Потеря или pax8 или pax2 у рыб, а также мышей не влияет на индукцию отических плакод (Torres et al., 1996, Mansouri et al., 1998, Riley et al., 1999, Whitfield et al., 2002, Hans et al., 2004). Напротив, pax2a мутанты, обработанные pax8 morpholinos неспособны формировать отическую плакоду (Hans et al., 2004, Mackereth et al., 2005), это указывает на то, что их функции, по крайней мере, у рыб перекрываются. Не описано двойных мутантов Pax2 и Pax8 у мышей. Растет количество работ по взаимодействиям между foxi1, dlx3b, dlx4b, pax2 и pax8 у рыбок данио, суммированы Solomon and colleagues (Solomon et al., 2004), Riley and Phillips (Riley and Phillips, 2003) и Hans and colleagues (Hans et al., 2004). Однако, необходимы дальнейшие эксперименты для выявления, могут ли взаимодействия в этой сети транскрипционных факторов быть применены и к др. видам.

Which tissues are competent to respond to otic inducing signals?


Компетентность ткани определяется по её способности приобретать специфическую судьбу в ответ на соотв. индуктивные сигналы. Простейшим эмбриологическим тестом являются трансплантации ткани из разных мест в область, которая обычно становится отической плакодой и тестирование, будет ли трансплантат обнаруживать плакодные характеристики. У эмбрионов кур эктодерма, лежащая вдоль нервной пластинки в голове и передней части туловища компетентна экспрессировать ушные специфические маркеры и формировать отический пузырек, если трансплантируется в место будущей отической плакоды (Groves and Bronner-Fraser,2000). Эта компетентность наблюдалась в области эмбриональной эктодермы с конца гаструляции и уменьшалась с возрастом вплоть до ст. 10-12 пар сомитов у эмбрионов кур, после этого эктодерма становилась рефрактерной к отическим индуцирующим сигналам. Сходные результаты были получены на эмбрионах амфибий (Gallagher et al., 1996).

When is ectoderm specified to form the otic placode?


Ткань специфицируется, если она уже получила индуцирующие сигналы и может экспрессировать отические маркеры в отсутствие каких-либо дополнительных сигналов. Спецификация отической ткани является т.о. операционным определением для старта индукции внутреннего уха. У эмбрионов кур разработаны методы по экспрессии отических маркеров Pax2 и BMP7 (Groves and Bronner-Fraser,2000). В таких экспериментах кусочки презумптивной отической эктодермы были собраны на разных возрастах и помещались в культуру с минимальной средой в отсутствие индуктивных сигналов, таких как ростовые факторы или сыворотка. Презумптивная отическая эктодерма специфицируется, чтобы экспрессировать Pax2 на ст. 5-6 сомитов (ss), а BMP7 на 7-8ss. Спецификация Pax2 и BMP7 происходит приблизительно в то же самое время, когда они появляются in vivo, 5ss и 7ss соотв. Эти эксперименты позволяют приблизительно подсчитать начало индукции отических плакод, хотя важно отметить, что др. ещё не идентифицированные гены у кур могут быть индуцированы раньше Pax2.

When is ectoderm committed to form the otic placode?


Ткань, скажем, детерминирована к определенной судьбе, если она принимает эту судьбу независимо от своего окружения. Тест на отическую детерминацию заключается в трансплантации кусочка презумптивной отической эктодермы

Fig. 2. Only the ectoderm within the pre-placodal region can induce Pax2 in response to FGF2. (A) Anterior epiblast from HH stage 3+-4 chick embryos is unable to induce Pax2 when cultured in presence of FGF2. (B) Lateral ectoderm (outside the pre-placodal domain) from 0-4ss chick embryos does not express Pax2 when treated with FGF2. (C) Presumptive trigeminal ectoderm (within the pre-placodal domain) from 0-4ss chick embryo expresses Pax2 only when cultured in the presence of FGF2.

разных возрастов в эктопическое окружение и проверки эктопической экспрессии ушных маркеров или образования отического пузырька. Такой подход операционно определяет конец индукции отической плакоды. У эмбрионов кур отическая эктодерма оказывается детерминированной к экспрессии Pax2 и формирует пузырек на 9-10ss (Groves and Bronner-Fraser, 2000). Исследования на амфибиях обнаруживают вариации в начале детерминации от вида к виду (Ginsburgt, 1995). Важно отметить, что для спецификации, время, при котором ткань, скажем, становится детерминированной, зависит от используемых маркеров и может рассматриваться только как предварительный показатель, т.к. никогда нельзя быть уверенным, что детерминированная ткань была подвергнута действию всех возможных сигналов.

Which tissues have otic inducing properties?


Эмбриональная индукция была описана как "an interaction between an inducing and responding tissue that alters the path of differentiation of the responding tissue" (Gurdon, 1987, Jacobson and Sater, 1988). Отвечающая ткань уже была охарактеризована экспериментами, описанными выше, индуцирующие ткани еще предстоит определить. Сегодня имеются четкие доказательства вклада заднего мозга и мезодермы в индукцию отических плакод. Первые исследования их потенциальной роли пришлись на первую половину 20 века, хотя большинство из этих экспериментов было проделано, когда молекулярные маркеры ещё были недоступны и базировались на формировании морфологически определяемых структур как указание индукции. Идентификация молекулярных маркеров для отических плакод, вместе с функциональными подходами по избыточной и недостаточной экспрессии предоставили множество информации относительно специфической роли заднего мозга и мезодермы в индукции уха. Напр., некоторые мутанты рыбок данио рерио характеризуются дефектами развития мезодермы, а именно cyclops и one-eyed pinhead (oep) мутанты (Zhang et al., 1998, Gritsman et al., 1999). Эти рыбки обнаруживают задержку формирования отических пузырьков. Однако, эти мутанты представлены рядом др. фенотипов, которые также касаются формирования ушей, поэтому трудно отнести задержку индукции за счет исключительно отсутствия мезодермы. Индукция oep-специфических morpholino у эмбрионов рыбок данио также давало маленькие отические пузырьки (Phillips et al., 2001, Leger and Brand, 2002). Тот факт, что отические пузырьки всё ещё формируются в отсутствие мезодермы указывает на то, что эта ткань необязательна для отической индукции у рыб. Недавно роль мезодермы в индукции отических плакод у эмбрионов кур исследовали с использованием удаления и трансплантационных экспериментов. Удаление краниальной параксиальной мезодермы, лежащей в основе презумптивной отической эктодермы, или её замещение мезодермой из более передних или задних мест предупреждает индукцию отической плакоды (Kil et al., 2005). В этом исследовании была также протестирована роль заднего мозга в индукции отической плакоды, используя по витамину А дефицитных эмбрионов, у которых отсутствовали 5 и 6 ромбомеры и имелся увеличенный 4-й ромбомер. У таких эмбрионов отические пузырьки обычно формируются нормально, указывая тем самым, что задняя часть заднего мозга не нужна для индукции отических плакод у птиц. Описаны мутантные рыбы с дефектами заднего мозга, такие как valentino, которые затрагивают развитие ромбомеров 5 и 6, или мутанты Pbx2 и 4, у которых задний мозг приобретает характеристики ромбомера 1 (Waskiewicz et al.,2002). Отические пузырьки всё ещё формируются у этих мутантов, хотя последующее развитие уха аномально (Kwak et al., 2002). Задний мозг, следовательно, не является необходимым для формирования отических пузырьков, однако, он может быть необходим для более поздних аспектов



Fig. 3. Competence to respond to otic inducing signals correlates with expression of pre-placodal genes. Anterior epiblast from HH stage 3+-4 chick embryo is unable to induce Pax2 when cultured in FGF2, but it can form an otic vesicle expressing Pax2 when grafted for 24 hours into the presumptive otic region of a 0-4ss chick embryo. Quail anterior epiblast grafted into the pre-placodal region of a 0-4ss chick embryo for only two hours does not upregulate pre-placodal markers and will not subsequently express Pax2 when cultured with FGF2. In contrast, the same epiblast expresses pre-placodal makers when grafted for 8 hours in the pan placodal region and is able to express Pax2 in response to FGF2

формирования паттерна уха. Напр., у эмбрионов кур Lmx1 транскрипционный фактор нуждается в сигналах от заднего мозга, чтобы экспрессироваться, хотя роль Lmx1 в формировании уха пока неизвестна (Giraldez, 1998).
Наконец, было показано, что энтодерма также вовлекается в индукцию внутреннего уха у птиц (Ladher et al., 2005). Удаление энтодермы приводит к потере эпителиального утолщения со стороны удаления, а также к потере экспрессии Pax2. В этом случае очевидно, что роль энтодермы косвенная, за счет действия энтодермы на мезодерму, которая затем индуцирует непосредственно развитие уха. Итак, эти данные указывают на то, что и мезодерма и задний мозг участвуют в развитии отических плакод, хотя их специфические роли, по-видимому, варьируют от вида к виду.

What are the molecular inducers of the otic placode?


Члены семейства fibroblast growth factors, как было установлено, играют критическую роль в индукции внутреннего уха у некоторых видов. Их экспрессия в развивающемся заднем мозге по соседству с презумптивной отической тканью или в подлежащей мезодерме подтверждает роль членов семейства FGF как возможного индуктора уха. Передача сигналов FGF, как было показано, необходима для индукции отической плакоды у рыб, кур и мышей. У рыбок данио воздействие ингибитора FGF рецептора SU5402 приводит к полной потере отических пузырьков, а также к потере экспрессии некоторых ушных маркеров, pax2a и dlx3b (Leger and Brand, 2002, Maroon et al., 2002). У эмбрионов кур будущая ушная эктодерма неспособна экспрессировать Pax2 и EphA4, если культивируется в присутствии SU5402 (Martin and Groves, 2006). У рыб fgf3 и fgf8 участвуют в качестве главных кандидатов на роль FGF-зависимой передачи индуктивных сигналов уха. Оба экспрессируются вблизи пре-отического домена во время индукции плакоды (Reifers et al., 1998, Furthauer et al., 2001, Phillips et al., 2001, Maroon et al., 2002). Потеря fgf3 или fgf8 у morpholino-обработанных или мутантных рыб ассоциирует с уменьшением домена экспрессии pax2a и dlx3b, а также с маленькими пузырьками. Когда затронуты оба fgf3 и fgf8, то отические пузырьки не образуются (Phillips et al., 2001, Leger and Brand, 2002, Maroon et al., 2002, Liu et al., 2003). У мышей FGF3 и FGF10 рассматриваются как потенциальные индукторы, при этом FGF3 экспрессируется в ромбомерах 5 и 6 заднего мозга. а FGF10 в мезодерме, подлежащей под презумптивной плакодой (Mahmood et al., 1995, McKay et al., 1996, Wright and Mansour, 2003). FGF10 мутантные мыши дают очень маленькие отические пузырьки (Ohuchi et al., 2000), тогда как FGF3 формируют отические плакоды, хотя позднее дифференциация уха очень аномальна (Mansour et al., 1993). Мутанты по FGF3 и FGF10 неспособны формировать отические пузырьки или формируют микропузырьки, а Pax2 отсутствует в ушной ткани, тогода как экспрессия Pax8 и Gbx2 снижена (Alvarez et al., 2003, Wright and Mansour, 2003). FGF8 также участвует в индукции плакод у эмбрионов кур и мышей, хотя его роль, по-видимому, непрямая. Он экспрессируется в краниальной энтодерме и необходим для мезодермальной экспрессии FGF19 у эмбрионов кур и FGF10 у мышей (Ladher et al., 2005). Исследования описанные выше, выявляют центральную роль передачи сигналов FGF в индукции отических плакод у всех исследованных видов, хотя характеристики и источники индуцирующих FGFs варьируют от вида к виду. Важно отметить, что некоторые аспекты индукции отических плакод являются FGF-независимыми. Напр., у рыбок данио индукция foxi1, dlx4 и sox9b не затрагивается у мутантов, лишенных и fgf3 и fgf8 (Solomon et al., 2004). В самом деле, foxi1, как было предположено, действует как фактор компетентности у рыб, позволяя эктодерме отвечать на передачу сигналов FGF, но не сам отвечает на FGFs (Hans et al., 2004, Hans et al., 2007), хотя Phillips and colleagues показали, что эктопическая экспрессия fgf8 индуцирует эктопические домены экспрессии foxi1 (Phillips et al., 2004). Кроме того, dlx3b рыбок данио , как сообщалось, FGF-независим в некоторых исследованиях, но не в др. (Leger and Brand, 2002, Maroon et al., 2002, Liu et al., 2003, Solomon et al., 2004). Факторы, ответственные за экспрессию foxi1, dlx3b, dlx4b и sox9a неизвестны, хотя недавно было предположено, что передача сигналов BMP может служить кандидатом на роль индуктора foxi1 и dlx3b (Hans et al., 2007). Доказательства FGF-независимых путей индукции отических плакод получены в работе с эмбрионами кур, где индукция двух отических маркеров, Dlx3 и BMP7, не затрагивалась воздействием ингибитора рецепторов FGF SU5402 (Martin and Groves, 2006). Эктопическая экспозиция разных членов семейства FGF также подтверждает их роль в индукции отических плакод. FGF кусочки, имплантированные в заднюю часть эктодермы эмбрионов Xenopus или рядом с отической тканью у эмбрионов кур д. индуцировать эктопические отические пузырьки (Lombardo et al., 1998, Lombardo and Slack, 1998, Adamska et al., 2001). Сходные результаты наблюдались у эмбрионов кур, когда FGF3 эктопически экспрессировали в не-отической ткани (Vendrell et al., 2000). Хотя результаты, полученные на лягушках и курах подтверждают индуктивные свойства FGF, они ничего не говорят, действует ли FGF3 прямо или опосредованно. Возможно, что передача сигналов FGF д. индуцировать др. молекулы в соседней ткани, которые сами по себе д.быть ответственны за формирование эктопического отического эпителия. Напр., FGF19 индуцирует Pax2 в компетентной эктодерме только, если эктодерма ко-культивируется с нервной тканью или когда FGF19 применяется в сочетании с Wnt8c (Ladher et al., 2000). Авт. описывают модель индукции плакод, в которой FGF19 д.

Fig. 4. Pax2+ cells give rise to both otic placode and epidermis. Pax2- Cre mice are crossed with reporter mice that express GFP in a Cre- inducible fashion. All Pax2-expressing cells and their descendants will express GFP in embryos derived from such crosses (left). GFP-positive cells are observed not only in the otic vesicle (OV), but also in the epidermis at E9.5, while no cells are GFP-positive in reporter mice alone (right).

сначала индуцировать экспрессию Wnt8c в нейральной эктодерме, а затем индуцировать некоторые аспекты индукции отических плакод вместе с Wnt8c. Недавнее исследование на эмбрионах кур показало, что кусочки компетентной эктодермы отвечают относительно быстро на воздействие FGF2 (Martin and Groves, 2006). Ряд отических маркеров, Pax2, Pax8, EphA4, Dlx3, активируется самое раннее спустя 6 ч после воздействия и индукция происходит без индукции нейральных или мезодермальных маркеров, подтверждая, что FGF скорее всего действует непосредственно, индуцируя отическую эктодерму. Интересно, что отический маркер BMP7 никогда не индуцируется при любой концентрации FGF, что снова демонстрирует существование FGF-независимых путей отической индукции.

From pre-placode to placode: testing a two step model of otic placode induction


В предыдущем разделе были представлены доказательства существования общего преплакодного домена и было высказано предположение, что локальные индуцирующие сигналы действуют в ограниченных областях преплакодного домена, чтобы индуцировать специфические краниальные плакоды. В случае отических плакод передача сигналов FGF от заднего мозга и краниальной параксиальной мезодермы, лежащей под презумптивной плакодой, является строгим кандидатом на роль отического индуктора. Индукция краниальных плакод происходит в две ступени - индукция преплакодной области является обязательным условием для последующей индукции специфических плакод. Имеются косвенные доказательства такой двухступенчатой модели отической индукции. Напр., краниальная эктодерма, взятая из преплакодной области, быстро экспрессирует отические маркеры, если культивируется с FGF2, тогда как эктодерма того же самого уровня, но лежащая латеральнее преплакодного региона остается нечувствительной к FGF2 (Martin and Groves, 2006). Более того, передняя часть молодого эпибласта, не экспрессирующая преплакодных генов легко формирует отоцист, если трансплантируется в презумптивную отическую область, но не может экспрессировать отические маркеры, если культивируется в присутствии FGF2 (Groves and Bronner-Fraser, 2000; Martin and Groves, 2006; Figures 2 and 3).
Недавние эксперименты проверяли гипотезу, что приобретение преплакодных характеристик необходимо для последующей индукции отических плакод с помощью передачи сигналов FGF. Исходная ткань эпибласта способна позитивно регулировать преплакодные гены (такие как члены семейств Eya и Dlx) между 4 и 8 ч после трансплантации в преплакодную область эмбрионов кур. Важно. что если такие транплантаты удаляются до экспрессии ими преплакодных генов, то они не отвечают на FGF сигналы, тогда как те же самые трансплантаты отвечают с готовностью, если сталкиваются с FGF после того как они начали экспрессировать преплакодные гены (Martin and Groves, 2006; Fig. 3). Т.о., компетентность отвечать на передачу сигналов FGF коррелирует с экспрессией преплакодных генов в отической индукции. Существует множество отличающихся путей, в которых преплакодные характеристики д. обеспечивать компетентность отвечать на сигналы FGF в презумптивной отической эктодерме. Многие из этих генов, как известно, экспрессируются в преплакодном домене, являются транскрипционными факторами из семейств Dlx, Six, Eya, Dach и Foxi (Streit, 2004, Groves, 2005) и возможно, что некоторые из этих генов действуют индивидуально или сочетанно как "competence factors", как это было предположено для foxi, dlx3b и dlx4b у рыбок данио (Hans et al., 2004, Hans et al., 2007). Неясно, действуют ли эти факторы компетентности иерархически ниже передачи сигналов FGF или же они сами по себе облегчают передачу сигналов FGF, что происходит, напр., путем позитивной регуляции сигнального пути FGF. У Xenopus, избыточная экспрессия Six1 вызывает экспансию преплакодного поля, тогда как потеря функции Six1 ведет к уменьшению этого домена (Brugmann et al., 2004). Остается определить, могут ли эти результаты быть обобщены для др. видов и являются ли эти или др. пока не идентифицированные факторы достаточны для обеспечения компетентности отвечать на передачу сигналов FGF.

Revising the two-step model: insights from fate map- ping


Простая двухступенчатая модель индукции плакод, описанная выше, предусматривает, что клетки соседние к нервной трубке, получают сигналы, которые активируют преплакодные гены как необходимое условие для индукции специфических плакод с помощью локальных индуцирующих сигналов. Однако, из исследований по картированию судеб ясно, что предшественники разных краниальных плакод могут быть перемешаны до своей дифференцировки. Напр., Kozlowski и др. установили, что при 50% epiboly у рыбок данио имеются области, соседние с презумптивным отическим регионом, которые дают не только отический пузырек, но и др. сенсорные области, такие как хрусталик, обонятельный эпителий и тройничный ганглий (Kozlowski et al., 1997). Во втором наборе исследований, Streit

Fig. 5. Wnt signals mediate a placode-epidermis fate decision. In normal mice (left), the canonical Wnt signaling pathway is activated (light blue) in the Pax2 + pre-otic field by Wnts from the hindbrain (HB). Cells receiving high levels of Wnt signals differentiate as otic placode (magenta), while those receiving lower or no Wnt signals differentiate as epidermis (grey). In the absence of Wnt signaling in the pre-otic field (center), epidermis is expanded at the expense of the otic placode. When -catenin is stabilized in the pre-otic field (right), it activates Wnt-responsive genes in the entire pre-otic field, thus expanding the otic placode at the expense of epidermis. Modified from Ohyama et al., (2006).

меченные клетки в области презумптивной отической эктодермы эмбрионов кур на ст. поздней гаструлы и ранней пост-гаструлы, было установлено, что отическая плакода возникает из более широкой области эпибласта и что её предшественники перемешаны с клетками, дающими эпидермис, epibranchial плакоды, клетки ЦНС и нервного гребня (Streit, 2002). Др. исследования подтвердили сходное перемешивание клеток предшественников для хрусталиковых и обонятельных плакод (Whitlock and Westerfield, 2000, Bhattacharyya et al., 2004).
Хотя эти исследования по картированию судеб предоставили убедительные доказательства перемешанности предшественников разных плакод, они не предоставили информации о том, когда индивидуальные предшественники вычленяются для определенной судьбы. Недавно картирование судеб показало, что такой отбор может происходить даже после экспрессии ранних плакодных генов. Напр., хотя Pax2 обычно является одним из самых ранних маркеров отических плакод, исследования на эмбрионов кур и мышей показали, что Pax2-экспрессирующие клетки могут становиться эпидермальными, а также воспринимать судьбу отической плакоды. В Streit's клональном анализе у кур, клетки в области из домена экспрессии Pax2 на ст. ранней головной складки в основном дают как отические плакоды, так и не-плакодную эктодерму, а домен Pax2+ грубо подразделяется на плакодную и неплакодную территории (see Fig. 3D and E in Streit, 2002). Для дальнейшего тестирования судеб Pax2-экспрессирующих клеток, генетически метили Pax2+ эктодерму у мышей и отслеживали производных этих клеток, используя Cre-loxP рекомбинационную систему. Когда Pax2-Cre трансгенные мыши скрещивались с loxP репортерными мышами, то Pax2+ клетки постоянно метились продуктом репортерного гена за счет необратимой Cre-loxP рекомбинации. У потомков от таких скрещиваний reporter-позитивные клетки локализовались как в отических плакодах, так и в эпидермисе (Ohyama and Groves, 2004b), указывая тем самым, что Pax2-экспрессирующие клетки еще не детерминированы относительно отической судьбы, и могут давать также эпидермис.
Как можно согласовать эти результаты с ранее описанными наблюдениями роли передачи сигналов FGF в индукции отических плакод? Несколько линий доказательств указывают на то, что передача сигналов FGF необходима и достаточна для индукции ранних отических маркерных генов, таких как Pax2 (Phillips et al., 2001, Leger and Brand, 2002, Maroon et al., 2002, Ladher et al., 2005, Martin and Groves, 2006). В свете наших исследовании по картированию судеб становится ясно, что передача сигналов FGF индуцирует область Pax2-экспрессирующих клеток, которая дают отическую плакоду, но которая может дифференцироваться и как эпидермис. Мы описали этот домен, маркированный генами ранних отических маркеров, таких как Pax2 и Pax8, как 'pre-otic field', отличающееся от отической плакоды. Т.о., наша двухступенчатая модель теперь нуждается в третьей ступени, на которой передача сигналов FGF необходима для индукции Pax2+ пре-отического поля, и дополнительные сигналы необходимы для подразделения пре-отического поля на отическую плакоду и эпидермис.

Wnt signaling and the induction of the otic placode


Ladher с коллегами предоставили первые доказательства участия передачи сигналов Wnt в индукции отической плакоды. Они культивировали презумптивную отическую эктодерму кур с кусочками, смоченными FGF19 или Wnt8c. Они наблюдали более строгую индукцию генов отических маркеров, таких как Pax2 при воздействии FGF19 и Wnt8c, чем только FGF19. Они предположили, что Wnt8c индуцируется в заднем мозге с помощью происходящего из мезодермы FGF19 и что он синергично индуцирует отические гены с FGF19 (Ladher et al., 2000). некоторые наблюдения поставили под вопрос эту гипотезу - напр., Wnt8 экспрессируется в головном мозге некоторых видов после того, как Pax2 и Pax8 индуцируются в презумптивной отической эктодерме (Hume and Dodd, 1993, Bouillet et al., 1996, Lekven et al., 2001). Более того, исследования с помощью Phillips и др. на рыбках данио показали, что после деплеции передачи сигналов Wnt8 с помощью morpholino нокдауна или Wnt антагониста dickkopf (Dkk1), отоцист всё ещё формируется, хотя его размер меньше (Phillips et al., 2004). Возможно, однако, что др. молекулы Wnt компенсируют потерю функции Wnt8, а экспрессия Dkk1 в этих экспериментах не полностью блокирует передачу сигналов Wnt. Несмотря на эти противоречивые наблюдения, тем не менее ясно, что презумптивная отическая эктодерма подвергается действию сигналов Wnt. TCF/Lef-lacZ трансгенные репортерные мыши, которые обнаруживают активность канонического сигнального пути Wnt (Mohamed et al., 2004), обнаруживают репортерную активность в субнаборе пре-отического поля, с клетками ближайшими к нервной трубке, обладающими высокими уровнями репортерной активности, а более латеральная эктодерма обладала меньшей или не обнаруживала репортерной активности (Ohyama et al., 2006). Чтобы протестировать, модулирует ли передача сигналов Wnt выбор судьбы плакода-эпидермис, β-catenin, нижестоящая молекула, необходимая для канонического сигнального Wnt пути, была функционально инактивирована или активирована в пре-отическом поле, используя Pax2-Cre мышей (Ohyama et al., 2006). у β-catenin условных нокаутных мышей отическая плакода существенно уменьшалась в размере. Напротив, условная стабилизация β-catenin вызывала экспансию плакода-подобного утолщения за счет неплакодной эктодермы (Fig. 5). Эти результаты строго указывают, что каноническая передача сигналов Wnt играет критическую роль в обеспечении выбора судьбы плакода-эпидермис внутри пре-отического поля, с клетками, получающими мало или не получающими сигналы Wnt, дифференцирующимися в эпидермис. Кстати имеются косвенные доказательства роли специфических членов семейства Wnt в этом выборе судьбы плакоды или эпидермиса. У мышей Wnt6 экспрессируется на задней поверхности эктодермы на ст. E7.5 (T.O. and C. Jayasena, unpublished observations). Wnt8a экспрессируется в ромбомере 4 на E8.0 (Bouillet et al., 1996) и чуть позднее Wnt1 и Wnt3a начинают экспрессироваться в дорсальных частях нервных складок (Gavin et al., 1990). Экспрессия др. компонентов сигнального Wnt пути в преотическом поле не была изучена детально. Однако, один из Wnt рецепторов, frizzled-8 и нижестоящий транскрипционный фактор Tcf3, по-видимому, экспрессируются в передней части эктодермы на ст. E7.5 (Lu et al., 2004, Merrill et al., 2004). Путь Wnt8-Tcf3 обеспечивает формирование оси тела (Popperl et al., 1997, Merrill et al., 2004) и вряд ли Lef1 или Tcf1, Tcf3 действует как рецептор (Merrill et al., 2001). Т.о., сходные механизмы могут модулировать выбор судеб плакода-эпидермис в пре-отической области.

How do the Wnt and FGF signaling pathways interact to generate the otic placode?


Некоторые исследования подтвердили потенциальное взаимодействие между путями Wnt и FGF. Напр., куриный Sox2, который экспрессируется в эпибласте (Avilion et al., 2003), имеет энхансер задней части нервной пластинки, который синергично активируется с помощью FGFs и Wnts. Энхансерная область Sox2 содержит сайт связывания Lef1 и FGF-чувствительные элементы, а с помощью репортера было показано, что Wnt-зависимая активация существенно усиливается в присутствии FGFs, тогда как FGF сам по себе активирует энхансер на низком уровне (Takemoto et al., 2006). Более того, несколько линий доказательств показали, что усиление фосфорилирования GSK3 с помощью передачи сигналов FGF (возможно посредством Akt) усиливает стабилизацию β-catenin (Hashimoto et al., 2002, Holnthoner et al., 2002, Israsena et al., 2004, Dailey et al., 2005). Эти результаты подтверждают, что передача сигналов Wnt может только влиять на выбор судьбы между плакодной и эпидермальной в присутствие передаси сигналов FGF. Возможно также, что др. недиффундирующие сигналы, такие как передача сигналов NotchЮ являются важными для предопределения границы между плакодой и эпидермисом. Martinez-Arias и др. предложили модель, согласно которой передача сигналов Wnt действует как фильтр транскрипционного шума (Arias and Hayward, 2006). Они также показали, что Notch модулирует передачу сигналов Wnt путем регуляции активности β-catenin (Hayward et al., 2005, Hayward et al., 2006). Более того, в эпидермисе мышей Notch лиганд Jagged1, как было показано, нацелен на β-catenin (Estrach et al., 2006). Т.о., взаимодействие между Wnt и др. сигналами может быть необходимо для предопределения соответствующего размера отической плакоды. Возможно также, чт передача сигналов FGF и Wnt действуют независимо во время индукции отических плакод. Напр., наши исследования показали, что активация передачи сигналов Wnt репрессирует специфичный для эпидермиса транскрипционный фактор Foxi2, тогда как потеря передачи сигналов Wnt вызывает экспансию экспрессии Foxi2 (Ohyama et al., 2006). Передача сигналов Wnt может, следовательно, действовать как пермиссивный фактор, который предопределяет размер отической плакоды путем репрессии Foxi2, обеспечивая тем самым свободу действий для FGF, чтобы индуцировать отические гены в Foxi2-негативном домене.

From ectoderm to otic placode: three steps and more?


Исследования, описанные выше, начинают предлагать более детальное описание того, как исходная эктодерма индуцируется, чтобы сформировать специфические черепно-лицевые плакоды. Во-первых, эктодерма понуждается к экспрессии преплакодных генов в ответ на сигналы от передней части мезодермы (включая кардиальную мезодерму), которые включают FGFs вместе с BMP и Wnt антагонистами (Litsiou et al., 2005; see article by Streit and colleagues in this issue). Во-вторых, подтверждено, что все преплакодные клетки временно специфицируются, приобретая хрусталиковые характеристики (Bailey et al., 2006), с последующими сигналами, ограничивающими хрусталиковые качественные особенности только небольшой областью преплакодного домена. Эти две ступени делают эктодерму компетентной отвечать на сигналы, индуцирующие плакоды - напр., преплакодные характеристики необходимы для эктодермы. чтобы отвечать на FGFs и индуцировать маркеры пре-отического поля, такие как Pax2 (Martin and Groves, 2006). Эта индукция компетентной преплакодной области скорее всего также необходима для индукции и др. плакод - напр., реакцией на FGF является индукция носовой плакоды (Bhattacharyya et al., 2004) , а происходящие из нервной трубки факторы участвуют в индукции плакоды тройничного нерва (Baker et al., 1999). Наконец, Pax2+ пре-отическое поле расщепляется на эпидермис и предетерминированную ткань отической плакоды благодаря действию передачи сигналов Wnt (Ohyama et al., 2006). Нерешенной проблемой остается, как сходные сигналы, развертывающиеся в разное время во время индукции плакод дают разные результаты. Напр., передача сигналов FGF является критической для индукции преплакодных генов (Litsiou et al., 2005), но она позднее также необходима для индукции носовой плакоды (Bhattacharyya et al., 2004), пре-отического поля (Martin and Groves, 2006) и epibranchial плакод у рыбок данио (Nechiporuk et al., 2005, Nechiporuk et al., 2007, Nikaido et al., 2007, Sun et al., 2007). Тем не менее использование молекулярной биологии и генетики преображает исследования индукции отических плакод и позволяет дать детальное молекулярное описание генеза одного из сложнейших сенсорных органов тела.
Сайт создан в системе uCoz