Fgf8 экспрессируется в проспективных AER клетках формирующегося зачатка конечности и затем по всему AER вплоть до его регрессии⁸. Напротив экспрессия, Fgf4, Fgf9) и Fgf17 наблюдаемая после образования AER, ограничивается задней частью AER и исчезает за день до регрессии AER⁵ (Fig. 1a). Если AER-FGFs элиминируются индивидуально, то только потеря функции Fgf8 нарушает формирование паттерна скелета^5-7,9-11. Др. AER-FGFs, как было предположено существенны, но функционально перекрываются, они компоненты петли позитивной обратной связи между AER и центром формирования паттерна в мезенхиме задней части зачатка конечности, который продуцирует sonic hedgehog (SHH)^5,12,13. Мы проверяли эту гипотезу, делетируя Fgf4 посредством Cre-обусловленной рекомбинации в AER эмбрионов, гомозиготных по нулевым аллелям Fgf9 и Fgf17^10,11 (далее обозначаемых как as F4;9,17-triple knockout (TKO) мутанты; Fig. 1b). Т.к. делеция Fgf4 возникает прежде начала нормальной экспрессии Fgf4⁵ (see Fig. 1a), то зачатки конечностей F4;9,17-TKO не продуцируют FGF4, FGF9 или FGF17. Несмотря на это в F4;9,17-TKO скелетах (n = 6), три классически определяемых сегмента- stylopod (верхние части конечностей), zeugopod (нижние части конечностей) и autopod (wrist/hand или ankle/foot)-образуются в общем-то нормально (Fig. 1c). В соответствии с этим наблюдением и in situ гибридизация (not shown) и quantitative PCR after reverse transcription (qRT-PCR; Fig. 1d) обнаруживают нормальную экспрессию Shh в зачатках F4;9,17-TKO конечностей на embryonic day (E)10.5. Более того, не обнаруживается компенсаторного усиления активности Fgf8 в зачатках F4;9,l 7-TKO конечностей на ст. E10.5 (Fig. 1d). Эти данные демонстрируют, что Fgf8 достаточен для нормального развития конечностей, включая поддерживающую экспрессию Shh и что независимо от того какие позитивные регуляторные взаимодействия происходят между Shh и задними AER-FGF генами, они не существенны для развития нормального скелета конечностей.

Хотя и не нужные, когда присутствует FGF8, но каждый задний AER-FGF (FGF4, FGF9 и FGF 17) могут вносить вклад в развитие конечностей. Такие вклады могут быть обнаружены при инактивации этих генов по одиночке или в комбинации вместе с Fgf8 (refs 14 and 15). Для получения double-knockout (DKO) и TKO мутантов мы использовали Msx2-cre, которые функционируют раньше в зачатках задних конечностей, чем в передних⁵ (see Fig. la). Будучи инактивированным с помощью Msx2-cre, Fgf8is никогда не экспрессируется в зачатках задних конечностей до E9.5; поэтому, Fgf8 knockout (F8-KO) задние конечности более тяжело повреждаются по сравнению с передними⁶. У F8;4-DKO мутантов задние конечности неспособны формировать скелет, тогда как скелет передних конечностей развивается, но отсутствуют многие элементы¹⁴. Сходным образом у F8;4-DKO мутантов, лишенных копии Fgf9 (F8;4-DKO;F9^-/+мутанты), отсутствуют задние конечности, что более тяжело повреждены развивающиеся передние конечности (see below). Компаундные мутантные передние конечности т.о., дают более широкий круг фенотипов для анализа, чем задние конечности.

Эти фенотипы передних конечностей (суммированы в Supplementary Table 1) можно расположить в порядке усиления тяжести. F8-KO (n = 10), F8;17-DKO (n = 8) и F8-KO;F9^-/+ (n = 6) мутанты обнаруживают сходные средней тяжести фенотипы с присутствием всех скелетных элементов за исключением одного пальца и легкой гипоплазии stylopod и zeugopod (Fig. 2a, b; data not shown; ref. 6). Сходные дефекты наблюдались у F8;9-DKO (n = 16) и F8;9,17-TKO (n = 8) мутанитов, задний элемент zeugopod (ulna) был короче, а передний элемент (radius) отсутствовал (Fig. 2c; data not shown). Zeugopod задних конечностей был поврежден сходным образом у этих мутантов, но более значительно был поврежден задний элемент zeugopod (fibula) , который отсутствовал (not shown). Метод экспрессии Sox9, который маркирует конденсации, что развиваются в скелетных элементах¹⁶, показал, что эти дефекты формирования паттерна обнаружимы на ст. E12.5 (Fig. 2h-j; data not shown), демонстрируя, что AER-FGFs являются важными для установления скелетного паттерна конечностей на стадии почки. Более тяжелые фенотипы наблюдались у F8;4-DKO мутантов ( n = 5), у которых zeugopod передних конечностей состоит только из гипопластичной ulna и все элементы autopod отсутствуют за исключением одной или двух фалангs (Fig. 2d; ref. 14). Удаление одной копии Fgf9 ещё больше утяжеляло фенотип (n= 14 mutants; Fig. 2e, f); когда обе копии были удалены, то, F8;4;9-TKO мутанты (n = 9) оказывались лишенными всех скелетных элементов передних конечностей (Fig. 2g). в

Простейшим объяснением этих данных является то. что индивидуальные AER-FGFs являются функционально эквивалентными¹⁷, но они отличаются по степени. с которой они вносят вклад в AER-FGF сигнал, отражая. по-видимому, различия в их профилях временной и пространственной экспрессии, уровнях экспрессии и специфичности связывания с FGF рецепторами в мезенхиме зачатков конечностей. Если это так, тогда ранги скелетных фенотипов, наблюдаемые, когда удаляются специфические комбинации AER-FGFs, отражают изменения в уровне итогового AER-FGF сигнала. В подтверждение этой гипотезы, мы нашли, что на E10.5 размер и интенсивность экспрессии домена Dusp6 (нижестоящей мишени в передаче сигналов AER-FGF¹⁸) негативно коррелирует с тяжестью мутантного фенотипа (Fig. 21-o). Всё это указывает на то, что Fgf8 вносит самый большой вклад в AER-FGF сигнал, подкрепляемый Fgf4, Fgf9 и Fgf17. Более того наши данные указывают, что существует критический порог в передаче сигналов AER-FGF, ниже которого скелетные элементы не формируются.

Фенотип F8;4-DKO;F9^-/+ передних конечностей особенно показателен: stylopod (humerus) присутствует, но часто меньше обычного и усечен дистально с элементами одиночного пальца, непосредственно дистальнее его. Наиболее дистальный элемент обычно имеет заостренный кончик терминальной фаланги иногда с покрывающим его ногтем (Fig. 2e, f; data not shown). Иногда обнаруживается существенная недостача между плечевой костью и элементами фаланги (Fig. 2f and Supplementary Table 1). Полное отсутствие zeugopod и большей части autopod подтверждено методом экспрессии Sox9 на E12.5 (Fig. 2k; see Supplementary Fig. 1 for data on Hoxall expression). Единственным возможным объяснением этого фенотипа является то, что тяжелая редукция передачи сигналов AER-FGF вызывает гибель большей части предшественников autopod и zeugopod в зачатках ранних конечностей. Однако в соответствии с предыдущими сообщениями^14,15, гибель мезенхимных клеток у F8;4-DKO;F9^-/+ мутантов обнаруживается в проксимальной дорсальной области на E10.5, а не в дистальной (Fig. 3c), где располагаются предшественники autopod и дистальных частей zeugopod¹⁹. Клеточная гибель остается проксимально ограниченной вплоть до E11.5, после чего она больше не выявляется (not shown). В зачатках конечностей мутантов с более высоким уровнем передачи сигналов AER-FGF домен клеточной гибели занимает меньший процент объеме зачатка конечности (Fig. 3a-d; data not shown). Т.к. погибающие клетки локализованы проксимально, то вряд ли возможно, что гибель клеток предшественников autopod или zeugopod является главной причиной наблюдаемых фенотипов.

Др. возможным объяснением отсутствия zeugopod и большей части autopod в передних конечностях F8;4-DKO;F9^-/+ является то, что AER-FGFs участвуют в спецификации судеб дистальных клеток и когда передача сигналов AER-FGF заметно снижается, то меньшее количество клеток специализируется как дистальные. Эта гипотеза может быть проверена тестированием эффектов снижения передачи сигналов AER-FGF на экспрессию генов, существенных для P-D спецификации. Meis1, который кодирует гомеобоксный транскрипционный фактор, является потенциально одним из таких генов, т.к. эктопическая экспрессия Meis1 индуцирует дистально-пролксимальные трансформации в зачатках конечностей кур²⁰. Первоначально экспрессия Meis1 обнаруживается по всей мезенхиме формирующегося зачатка конечности; затем возникает Meis1-негативный дистальный домен и увеличивается в размере по мере увеличения зачатка конечности²⁰. Это согласуется с ролью FGFs в спецификации дистального домена, имплантация FGF-смоченных кусочков и исследования по хим. ингибированию показали, что передача сигналов FGF может репрессировать экспрессию Meis1²¹. Более того ранее нами было показано, что размер домена Meis1-негативной экспрессии уменьшается в F8;F4-DKO зачатках конечностей¹⁴. Однако т.к. зачатки конечностей F8;F4-DKO существенно меньше, чем в контроле, то не возможно знать, является ли наблюдаемый эффект вторичным по отношению к уменьшению размера зачатка конечности

Мы оказались способны проверить эффекты уменьшения передачи сигналов AER-FGF на экспрессию Meis1 независимо от её эффектов на размер зачатка конечности, т.к. различные AER-FGF компаундные мутантные зачатки конечностей хотя и меньше, чем в норме, но были удивительно сходны по общему размеру на ст. E10.5 (Fig. 3e-h; data not shown). Единственное объяснение этой находки то, что их размер на E10.5 отражает элиминацию клеток, которые погибают в результате инактивации Fgf8, который экспрессируется ~ со ст.E9.0 и инактивируется ~E9.5, в то время как эффекты потери функции Fgf4 и Fgf9 на выживших клетках ещё не доказаны, т.к. их экспрессия начинается позднее, чем экспрессия Fgf8. На ст. E11.5, оэ различия в размерах становятся очевидными среди компаундных мутантов; это обусловлено обширной клеточной гибелью и возможно негативным эффектом на клеточную пролиферацию после E10.5. Эти различия в размерах коррелируют с уменьшением передачи сигналов AER-FGF и, следовательно, с тяжестью скелетного фенотипа (Fig. 2h-k and data not shown). Метод для Meis1 на E10.5, когда размер зачатка конечности сходен, показал, что Meis1-негативный, дистальный домен существенно уменьшен у F8;9-DKO и ещё больше уменьшается в зачатках F8;4-DKO;F9^-/+ передних конечностей (Fig. 3i-l). Кстати эти данные предоставляют первые генетические доказательства того, что AER-FGFs репрессируют экспрессию гена, предположительно участвующего в спецификации качественных особенностей проксимальных клеток. Итак, мы пришли к выводу, что передача сигналов AER-FGF служит, по крайней мере, двум целям во время развития конечностей; чтобы способствовать выживанию клеток и чтобы специфицировать судьбу дистальных клеток.

Важный вопрос, как наши данные согласуются с существующими моделями формирования P-D паттерна. Модель 'progress zone' ²² постулирует, что P-D паттерн развивается постепенно, так что клетоки мезенхимы дистальной части зачатка конечности прогрессивно приобретают всё более дистальную позиционную информацию со временем и что сигналы AER не являются инструктивными для формирования P-D паттерна, но являются 'permissive', удерживая дистальные клетки лабильными и способными менять позиционные значения за счет неизвестного механизма. Однако наши данные показывают, что передача сигналов AER-FGF необходима, чтобы регулировать экспрессию Meis1, указывая тем самым что она функционирует как инструктивный сигнал скорее, чем пермиссивный сигнал в развивающихся конечностях. Более того, фенотипы скелета мутантов AER-FGF (напр., F8;4-DKO;F9 передние конечности, которые содержат элементы stylopod и autopod, но не элементы zeugopod) не могут быть объяснены моделью прогрессивной зоны^1,14, которая описывает формирование паттерна конечностей, как прогрессивный процесс, причем дистальные части специфицируются только после проксимальных.

Напротив модель 'early specification' ²³ постулирует, что клетки вдоль P-D оси конечности специфицируются, чтобы сформировать сегменты конечности stylopod, zeugopod и autopod на стадии ранней почки конечности. Хотя исходно и не рассматривается здесь, но одна из моделей, которая может объяснить, как происходит ранняя спецификация, это 'two-signal model'. Согласно ей клетки зачатка конечности первоначально подвергаются воздействию проксимального сигнала из мезодермы, окружающей зачаток конечности, возможно ретиноевой кислоты, а затем противоположного дистального сигнала (FGF) из AER, которые и устанавливают проксимальный и дистальные домены соотв.^2,21. Образование третьего (среднего) домена может затем происходить как результат взаимодействия между клетками на границе между проксимальным и дистальным доменами со временем, создавая таким образом три домена, из которых и развиваются сегменты stylopod, zeugopod и autopod (see Fig. 4a). Дополнительные домены внутри autopod, из которых развиваются элементы запястья, метакарпальные кости и пальцы, скорее всего формируются как результат межклеточных взаимодействий на границах домена. Эта концепция согласуется с интеркаляционной моделью, предложенной для объяснения регенерации конечностей амфибий^24,25. Ранняя спецификация д. быть, т.о., 'dynamic' процессом, который участвует совместно с ростом зачатка конечности. Наши данные подтверждают эту модель, предоставляя генетические доказательства, что AER-FGFs функционирует как инициальный дистальный сигнал на ранних стадиях развития конечностей.

Такая модель двух-сигнальной спецификации может легко объяснить скелетные аномалии передних конечностей, описанные здесь, исходя из наших находок, что AER-FGFs выполняет двойную функцию в развитии конечностей. Т.о., мы предполагаем, что у AER-FGF мутантов дистальный сигнал редуцируется пропорционально снижению AER-FGF сигнала. Т.к. теперь имеется меньше оппозитного дистального сигнала, то проксимальный сигнал, который продуцируется на нормальном уровне, распространяется более дистально, чем в норме. специфицируя клетки, которые обычно формируют дистальные элементы, чтобы стать проксимальными и тем самым подвергать риску развитие autopod и zeugopod. Однако stylopod не является аномально длинным, т.к. проксимальные клетки погибают у мутантов AER-FGF (Fig. 4b-d; see Supplementary Fig. 2a, b). Эта модель двойной функции AER-FGF может также объяснить дефекты скелета конечностей, наблюдаемые в др. исследованиях на мутантных мышах^6,7,14 и на облученных зачатках конечностей кур²⁶, у которых stylopod сильно редуцируется, но дистальные элементы затронуты в меньшей степени (see Supplementary Fig. 2c). в

В настоящее время не возможно оценить, когда происходит спецификация сегментов и критические тесты этой модели не могут быть осуществлены, т.к. нет молекулярных маркеров для предшественников разных сегментов. Многообещающий путь идентификации таких маркеров недавно открыт демонстрацией, что клетки в проксимальных и дистальных регионах ранних зачатков конечностей кур различимы благодаря своему поведению сортировки in vitro²⁷. Важно определить, могут ли FGFs, продуцируемые в AER участвовать в установлении этих различий.

NADIA MERCADER, LICIA SELLERI, LUIS MIGUEL CRIADO, PILAR PALLARES, CARLOS PARRAS, MICHAEL L. CLEARY and MIGUEL TORRES Ectopic Meis1 expression in the mouse limb bud alters P-D patterning in a Pbx1-independent manner Int. J. Dev. Biol. 53: 1483-1494 (2009) doi: 10.1387/ijdb.072430nm