Как у большинства плацентарных млекопитающих мыши имеют три моляра, которые развиваются последовательно в течение нескольких дней³¹. Развитие каждого индивидуального зуба перемежается с помощью образования эпителиальных сигнальных ценитров, эмалевых узелков²⁸. Первый эмалевый узелок формируется в начале развития зубной коронки, что сопровождаетсторичными эмалевыми узелками, которые появляются в будущих позициях основных характеристик моляров, в кончиках зубов (cusps). Т.к. мутации, затрагивающие ингибирование эмалевых узелков, могут давать слитые или добавочные cusps и моляры³⁰, поэтому мы постулируем, что первый разивающийся моляр д. ингибировать развитие последующих моляров, эффект, как мы полагаем, усиливается в культуральных условиях. В культуре хотя первый моляр (М1) развивается в основном с той же самой скоростью, как и in vivo , задние моляры часто задерживаются на несколько дней или не развиваются совсем. Культуральные условия, которые участвуют в в вычленении зубного зачатка из окружающей ткани, по-видимому, нарушают влияние мезенхимы на баланс активирующих и ингибирующих молекул, регулирующих развитие моляров (Рис. 1b). Для проверки этих идей мы культивировали зубной зачаток нижнего первого моляра мыши, который экспрессировал green fluorescent protein (GFP; слиты с Cre-recombinase) в локусе Shh (ShhGFP мыши). В развивающихся коронках зубов Shh впервые появляется только в клетках эмалевых узелков; позднее во время дифференцировки экспрессия Shh выявлялась в эмаль-секретирующих амелобластах по всей коронке^28,32. Т.к. эмалевые узелки трудно обнаружить в обычных культуральных условиях, то epifluorescence ShhGFP мышей позволяла точно указывать будущие позиции моляров и cusps in vitro? что позволяло отслеживать последовательность одонтогенезе (Рис.2а). Конструкция ShhGFP является Shh-нулевым аллелем; поэтому мы культивировали гетерозиготные ShhGFP моляры. Мы установили, что развитие зубов и морфология гетерозиготных ShhGFP мышей нормальные. Используя стандартную Trowell культуральную систему³⁴ мы сначала культивировали ShhGFP моляры начиная с Е14, времени, когда формируется первичный М1 эмалевый узелок. Мы культивировали как интактные зародыши зубов и зубы. в которых мы хирургически отделяли развивающийся М1 от его заднего хвоста, предназначенного давать М2 и М3 моляры (Рис. 1 и 2а). Культуры отслеживали ежедневно и инициация каждого зуба реконструировалась с помощью замедленной съемки (Рис.2а). Для культивируемых интактных зародышей зубов результаты показывали. что только 11% эксплантов давали М2 эмалевые узелки спустя два дня культиврования, период эквивалентный времени инициации М2 in vivo (Рис. 2b). Дополнительные интактные импланты формировали М2 во время последующих дней и 54% М2 инициировались после 12 дней культивирования (Рис. 2b). В противположность этой зедержке инициации развития М2, развитие М1 происходило практически с нормальной скоростью и все М1 формировали вторичные эмалевые узелки спустя 3 дня культивирования (Рис. 2а). что соответствовало скорости развития in vivo ²⁸/ Нормальное развитие М1 указывает на то. что питательная недостаточность вряд ли вызывает задержку задних моляров, а подтвержадет гипотезу ингибирования с помощью М1 (Рис. 1b). Для эксплантов, у которы- хвост был отсечен от остального зубного зародыша, 98% отделеных хвостов формировали М2, причем 68% из них появлялись со скоростью in vivo . Следовательно, отделение восстанавливает развитие М2, освобождая от ингибирующего влияния М1. Мы интерпретировали этот результат как исключающий наличие ингибирующего градиента через челюсть и зубы, увеличивающегося спереди к дистальному концу, т.к. в противположном случае мы не могли ожидать эффекта отделения на восстановление М2. Более того, почти половина рассеченных эксплантов инициировала развитие М3, часто раньше. чем инициация М3 in vivo (Рис. 2с). На 14-день, стадия шапочки, когда формировался эмалевый узелок М1, М1 экспрессировал гены, кодирующие некоторые сигнальные молекулы²⁸, включая диффундирующие ингибиторы. Из них, по крайней мере, ectodin (известен также как Sostdc1 и wise? ингибитор BMPs и Wnts, Bmp3 и follistatin,(оба кодируют ингибиторы Activin A и BMPs), строго экспессируются в эмалевом узелке или в передней порции М1 на 14-й день^30,35,36. Следовательно, чтобы протестировать, как раннее освобождение от ингибирования влияет на задние моляры, мы отсекали задние хвосты также на 13-й день, когда первиный эмалевый узелок М1 д. только формироваться. Эти результаты показали, что инициация задних моляров ускоряется: 90% М2 теперь инициируется на день раньше. чем in vivo (Рис. 2b). Инициация роазвития М3 также заметно ускорялась (Рис. 2с). Кроме того, в одном из эксплантов сформировался М4 после 7 дней культивирования. Следует отметить, что даже М3 были слишком малы, чтобы их можно было отделить от М2, инициация моляров всегда была последовательной и никогда не наблюдали одновременной инициации М2 и М3. Т.о., инициация М3 скорее всего ингибируется с помощью М2 и следовательно, ингибирование М4 осуществляется посредством М3. Полученные результаты показывают, что развитие зубов осуществляется с помощью регуляции FGFs³⁷? баланс между активацией и ингибированием эмалевого узелка может быть более важным для инициации зубов, чем абсолютная величина самих сигналов. Первоначально в культуре in vitro наблюдалось снижение уровня мезенхимных активаторов, необходимое для индукции М2, т.к. удаление ингибирующего эффекта М1 восстанавливало индуктивный баланс (Рис. 1, 2) Одним из очевидных предположений, связанных с данной интерпретацией, является то, что культуральные условия уменьшают мезенхимные активаторы, необходимые для формирования эмалевого узелка (Рис. 1b). Чтобы проверить это, мы проверяли эффеткы BMP4 и Activin A, используя белок высвобождающие кусочки. Оба интенсивно экспрессировались в мезенхиме с началом образования первичного эмалевого узелка и оба участвуют в качестве медиаторов событий эпителиально-мезенхимной индукции, ведущих к образованию эмалевых узелков^30,36,38-40. Мы помещали кусочки, испускающие BMP4 и Activin A непосредственно дисталнее интактных зародышей зубов 14-го дня. Результаты показали, что обе молекулы индивидуально способны ускорять образование М2. хотя и не в такой стпени, которая достигается отделением от М1 (Рис. 3). полученные результаты подтверждают. что время инициации задних моляров зависит от предыдущих моляров благодаря динамическому балансу между межмолярным ингибированием и мезенхимной активацией. Из-за важности размеров моляров в эволюции^6,16-29, мы затем попцтались установить. как такая динамика развития может влиять на продукцию фенотипической вариации, пригодной для естественного отбора.