Сортировка, доставка и распределение мембранных белков
Coordinated protein sorting, targeting and distribution in polarized cells
Ira Mellman & W. James Nelson Nature Reviews Molecular Cell Biology 9, 833-845 (November 2008) | doi:10.1038/nrm2525
The polarized distribution of functions in polarized cells requires the coordinated interaction of three machineries that modify the basic mechanisms of intracellular protein trafficking and distribution. First, intrinsic protein-sorting signals and cellular decoding machineries regulate protein trafficking to plasma membrane domains; second, intracellular signalling complexes define the plasma membrane domains to which proteins are delivered; and third, proteins that are involved in cell–cell and cell–substrate adhesion orientate the three-dimensional distribution of intracellular signalling complexes and, accordingly, the direction of membrane traffic. The integration of these mechanisms into a complex and dynamic network is crucial for normal tissue function and is often defective in disease states.
Рис.1. | A generic post-translational pathway for protein trafficking to the plasma membrane.
Рис.2. | Superimposing protein sorting demands on the generic trafficking pathway.
Рис.3. | Signalling complexes and scaffolds on the cytosolic face of the membrane define and stabilize membrane domains.
Рис.4. | Roles of signalling complexes on the cytosolic face of the membrane control phosphoinositide distribution and vesicle trafficking.
Рис.5. | Polarized cells form from the hierarchical integration of three fundamental mechanisms.
Все эукариотические клетки обладают общими клеточными аппаратами для пост-трансляционного трафика и компартментализации белков1. Затем клетки могут приобретать разные формы и функции в ответ на специфические физиологические контексты. Напр., во время эмбриогенеза одиночная клетка может изменять свою форму и функцию, т.к. мигрирует в соответствии с морфогенетическими градиентами и может затем реполяризоваться, обнаруживая транскрипционно специфицированные межклеточные взаимодействия2. При болезненных состояниях, таких как рак, эпителиальные клетки теряют полярность (благодаря (EMT)), высвобождаются от многоклеточный взаимодействий, мигрируют и затем реинтегрируют во вторую ткань, в которой они подвергаются структурной и функциональной реорганизации, чтобы приспособиться к новому месту3, 4. Т.о., динамика и пластичность потери и восстановления полярности указывают на общие механизмы мембранного трафика, используемого во все времена, но приводятся в действие они по-разному в зависимости от физиологического контекста.
Controlling protein sorting and trafficking
Общий пост-трансляционный путь доставки мембранных белков в плазматическую мембрану связан с последовательным транспортом белков между разными мембранными компартментами (напр., the endoplasmic reticulum (ER), комплексом Гольджи, эндосомами и плазматической мембраной1). Мембранные белки модифицируются в этих мембранных компартментах, обычно посредством сборки и процессинга комплексов олигосахаридных цепочек (Fig. 1). Транспорт обеспечивается посредством везикулярных промежуточных образований, которые отпочковываются от одного компартмента и сливаются с др. Генетика и in vitro эксперименты по восстановлению идентифицировали три класса белковых комплексов, которые формируют подобные везикулярные промежуточные образования5-7: coatomer protein complex-II () комплексы являются критическими для ER-Golgi переноса; являются критическими для Golgi-ER переноса и для транспорта внутри Гольджи; а adaptor protein (AP)-clathrin комплекс (the ) является критическим для транспорта между Гольджи, плазматической мембраной и эндосомами. Определенные белки из каждого комплекса распознают и избирательно рекрутируют различные белки грузы в транспортные пузырьки (не распознаваемые белки исключаются из пузырьков), тогда как до. белки комплексов деформируют и ваяют мембраны, чтобы создать мембранные пузырьки или трубочки. AP-clathrin комплекс содержит также дополнительные белки, которые модулируют основные функции комплекса, увеличивая сложность стратегии отбора грузов и влияя на кривизну мембран8. Независимо от того как или где формируются транспортные пузырьки, перенос пузырьков между компартментами обеспечивается с помощью актинового и микротубулярного цитоскелета9, а слияние пузырьков с мишенью плазматической мембраной регулируется с помощью органелл-специфических , 10 и 5. Эти общие механизмы являются стержневыми механизмами переноса во всех клетках и модифицируются в поляризованных клетках, чтобы сортировать белки в отдельные домены плазматической мембраны.
Protein sorting in the exocytic and endocytic pathways. Существуют три основных места сортировки белков в экзоцитических и эндоцитических путях: Golgi комплекс, плазматическая мембрана и эндосомы (Fig. 1). В каждом месте белки могут сортироваться по отдельным везикулярным носителям на базе внутренне присущих sorting сигналов и клеточных аппаратов, которые распознают эти сигналы. Основным компонентом сортировки белков во всех трех местах является семейство AP-комплексов, которое не только распознает протеин-sorting сигналы, но и также регулирует сборку clathrin каркасов, которые лепт мембраны, чтобы сформировать пузырьки.
4 AP комплекса (AP-1-4) были идентифицированы, они располагаются в разных мембранных компартментах, комплексе Гольджи, плазматической мембране и эндосомах11. Каждый AP комплекс состоит из двух крупных субъединиц (α, γ, ε, δ или β1-β4; ~100 kDa каждая), одной небольшой субъединицы (σ1-σ4; ~20 kDa) и одной средней субъединицы (μ1-μ4; ~50 kDa). Вместе с др. белками (такими как , (assembly protein of 180 kDa), epsin-1, epsin-2, , beta-arrestin and ARH) , которые взаимодействуют с clathrin, AP субъединицы распознают и связывают специфические аминокислотные мотивы в цитоплазматических доменах мембранных белков и образуют кластеры этих белков в виде пакетов на мембране путем сборки clathrin клетей8, 11. Одним из наиболее изученных является взаимодействие между AP-2-clathrin комплексом и (TfnR), которое происходит на плазматической мембране. Субъединица μ в AP-2 (μ2) распознает сортинг-мотив цитоплазматического домена degenerate тетрапептида (YXXØ; в котором Ø представляет собой любой гидрофобный аминокислотный остаток), приводя к объединению в кластеры TfnR в ямках, покрытых clathrin, на плазматической мембране12. Эти покрытые ямки затем отпочковываются в цитоплазму и доставляются в ранние эндосомы, возможно с помощью AP-1-clathrin комплексов и затем рецепторы возвращаются обратно в плазматическую мембрану с помощью происходящей из эндосом популяции пузырьков11 (Fig. 2).
В целом рециклинг белка из эндосом в плазматическую мембрану может быть сигнал зависимым и сигнал независимым. Трудно обнаружить различия между двумя этими механизмами в неполяризованных клетках, которые обладают одной не дифференцированной плазматической мембраной. Однако ситуация отлична в в поляризованных клетках. Напр., в эпителиальных клетках и нейронах, TfnR и др. хорошо охарактеризованные recycling рецепторы (такие как low-density lipoprotein receptor ()) локализуются в специализированных доменах плазматических мембран: в эпителии и в в нейронах13, 14. В этих случаях распознавание специфической targeting информации в цитоплазматическом домене TfnR является важным для поддержания поляризованной локализации рецепторов в соотв. домене.
Polarity sorting motifs and adaptors for basolateral proteins. В поляризованных клетках сортирующие сигналы в цитоплазматических доменах необходимы не только для эндоцитоза, но они также нужны для поляризованной доставки вновь синтезированных рецепторов и поддержания подвергающихся рециклнигу рецепторов в их соотв. мембранных доменах15, 16 (Fig. 2). Канонические сигналы интернализации играют роль в поляризованном эндоцитозе и рециклинге и им помогают дополнительные сортинг-сигналы и декодирующие адапторные комплексы. LDLR является хорошо изученным примером. Он имеет два Tyr-based сортинг-мотива - проксимальный к мембране мотив и С-терминальный мотив - в его цитоплазматическом домене, они необходимы для post-Golgi доставки и для поддержания LDLR в базолатеральном или соматодендритном доменах13, 14. Проксимальный к мембране мотив является важным для эндоцитоза LDLR, и хотя С-терминальный мотив не нужен для эндоцитоза, он кодирует сигнал для сортировки в базолатеральный или соматодендритный домены13, 14. Многие др. базолатеральные мембранные белки (Table 1) имеют Tyr-based targeting мотивы16, хотя были идентифицированы также diLeu-based сигналы (diLeu мотивы могут быть ответственны за обеспечиваемый клатрином эндоцитоз)17. Др. мотивы, такие как сортинг-мотив в TfnR18, по-видимому, лишены критических Tyr или Leu остатков18, 19.
Наблюдение, что многие базолатеральные белки имеют базирующийся на Tyr или diLeu мотив для базолатеральной полярности позволило предположить, что AP-clathrin комплексы важны для одной или более ступеней в спецификации переноса белка в поляризованных клетках. Лишь один AP комплекс был идентифицирован, который определенно ассоциирует с переносом базолатеральных белков, это специфичный для эпителиальных клеток вариант ассоциированного с клатрином AP-1 комплекса (обозначенный как AP-1B), в котором повсеместно экспрессируемая μ1A субъединица замещена на близко родственную μ1B субъединицу20, 21. AP-1B четко действует, чтобы детерминировать полярность Tyr-based сигналов (и некоторых не-Tyr сигналов, таких что в TfnR), т.к. отсутствие μ1B ведет к не поляризовананной или апикальной локализации белка, сходный эффект от элиминации сортинг-мотива. Однако вряд ли, что все такие сигналы декодируются с помощью AP-1B. DiLeu-based сигналы. напр., программируют базолатеральную полярность, но независимым от AP-1B способом20, 21 (Table 1). Второй AP комплекс, AP-4, также играет роль в базолатеральных поставках, хотя кго груз и сигнал специфичности не установлены22.
AP-1B не экспрессируется в поляризованных клетках, указывая тем самым, что существуют др. адапторы или белок-сортирующие пути. Многие нейроны. напр.. не экспрессируют μ1B, но белковый транспорт в соматодендритный домен плазматической мембраны использует те же самые targeting сигналы. которые используются для транспорта в базолатеральную мембрану в большинстве эпителиальных клеток14. Гепатоциты также не экспрессируют μ1B, но они используют те же Tyr-based сигналы базолатеральных белков (таких как LDLR) как и μ1B-позитивыне эпителиальные клетки23. Качественные особенности этих альтернативных базолатеральных адапторов предстоит выяснить. Действует ли AP-1B или любой из альтернативных адапторных белков совместно с клатрином? Это возможно, но удаление клатрина с помощью small interfering (si)RNA дало неожиданный набор эффектов на сортировку белков базолатеральной мембраны24. Белки, такие как VSVG (основной белок поврехностной оболочки вируса стоматита, который является Tyr-зависимым белком), NCAM (neural cell adhesion molecule, который является Tyr-независимым) и CD147 (который Leu зависим) доставляются в отношении 1:2 на базолатеральную и , тогда как др. доставляются в соотношении 2:1 (TfnR, который Tyr независим), в отношении 3:1 (epithelial (E)-cadherin, который diLeu зависим) или не испытывают влияния (Na+/K+-ATPase). Делеции обоих базлатеральных сортинг-мотивов в LDLR приводят к почти полному нарушению доставки мутантного LDLR в апикальную часть мембраны13. Наблюдение, что некоторые белки менее затрагиваются, чем др. при нокдауне clathrin указывает на то, что существует определенная степень избыточности и перекрывания соргинг-сигналов и декодирующих элементов, лишь некоторые из которых возможно зависят от клатрина. Напр., являются адапторными белками, которые соединяются с субклассами мембранных белков (такими как E-cadherin и Na+/K+-ATPase) и белком цитоскелета 25. Важно, что снижение экспрессии ankyrin B или ankyrin G снижает доставку E-cadherin из Golgi в базолатеральные части мембраны26.
Polarized sorting of apical proteins. Сортирующие мотивы и клеточные аппараты, которые сортируют белки в апикальные части мембраны эпителиальных клеток отличны от тех, которые сортируют белки в базолатеральные части мембраны. В противоположность ориентированному на цитоплазму мотиву базолатеральной сортировки, мотивы апикальной сортировки локализуются во внеклеточных или в трансмембранных доменах белков27 (Table 1). Мотивы внеклеточных доменов содержат N- и O-сцепленные олигосахаридные цепочки (такие как те, что нацдены у p75 (Ref. 28) и 29), хотя пока неясно, распознаются ли эти полисахаридные цепочки непосредственно с помощью аппарата сортировки или они контролируют конформацию белка и, следовательно, обладают сортинг-мотивом в аминокислотном остове белка. в
Ассоциированный с мембраной сигнал могут сам по себе трансмембранным доменом (т.к. появляется в некоторых вмрусных гликопротеинах, таких как haemagglutinin и neuraminidase), но лучше всего описанным сигналом является (GPI) липидный якорь30. GPI-закрепленные белки направляются на апикальный путь в комплекс ольджи. Это происходит за счет GPI-закрепленной олигомеризации белка в 31, которые обогащены glycosphingolipids, sphingomyelin и cholesterol30. Интересно, что крупные кластеры GPI-закрепленных белков не способны формировать lectin-резистентную Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) линию клеток, которая неправильно отсортировывает GPI-закрепленные белки. Это указывает на то. что углеводы участвуют в этом событии образования кластеров и необходимы для апикальной сортировки32. Некоторые др. белки в липидных плотиках могут участвовать в синтезе липидных плотиков (такие как FAPP2 (Ref. 33)) и в стабилизации (такие как MAL30), и в образовании кластеров апикальных белков (такие как белок липидных плотиков galectin-4 (Ref. 34)). Неизвестно, однако, как образование кластеров апикальных белков с помощью липидных платформ или какого-либо др. механизма, приводит к деформации мембраны и к образованию транспортных пузырьков, которые м.могут оставлять свои грузы в апикальную часть плазматической мембраны.
В общем, цитоплазматический домен из апикальных белков, как полагают, не является важным для поставки белков. Белок rhodopsin, однако, целенаправленно направляется в фоторецепторы апикальной мембраны за счет сортирующего детерминанта, который локализуется на его цитоплазматическом С конце35. Этот детерминант сортировки взаимодействует с dynein36. Важно, что неправильная сортировка rhodopsin ведет к пигментному ретиниту (Box 1). в
Базолатеральные (и somatodendritic) сортирующие сигналы часто доминируют над апикальными сортирующими сигналами. Др. словами, если присутствуют функциональные базолатеральный и апикальный сигналы, то гарантируется базолатеральная доставка. мембранных белков из базолатерального в апикальный домен может происходить, если базолатеральный сигнал инактивируется и вновь синтезированные белки включаются в транспортные пузырьки, направляющиеся базолатерально (Fig. 2); трансцитоз связан с эндоцитозом из одного мембранного домена, доставкой в эндосомы, повторной сортировкой и доставкой в др. мембранный домен. Напр., adhesion-signalling белок нейронов-глии (Ng)-CAM содержит Tyr-содержащий, AP-1B-зависимый сигнал базолатеральной доставки, который инактивируется за счет фосфорилирования по достижении базолатеральной поверхности. В отсутствие функционального базолатерального сигнала, Ng-CAM не захватывается с помощью AP-1B в эндосомы после интернализации, а вместо этого переносится на апикальную поверхность37. Вариации этой простой темы, по-видимому, объясняют др. примеры трансцитоза (напр., полимерного Ig рецептора38).
Sorting in the trans-Golgi network and recycling endosomes. Сортировка белков плазматической мембраны в соотв. места их предназначения, по-видимому, зависит от генеральных стержневых механизмов, обнаруженных на эндоцитическом и секреторном путях, но сортировка белков является предметом для незначительных модификаций в поляризованных клетках. Во всех клетках эндоцитические и секреторные пути обладают множественными сайтами сортировки. В большинстве клеток, однако места сортировки, которые наиболее подходят для генерации и поддержания полярности - (TGN) и - обнаруживаются в околоядерной цитоплазме (Fig. 2). Очень вероятно, что сигналы для апикальной или базолатеральной сортировки распознаются или обоими этими сайтами, так что TGN обеспечивает сортировку вновь синтезированных белков в секреторный путь и рециклинг-эндосомы, ответственные за поляризованный рециклинг или трансцитоз после эндоцитоза37, 38. Также, по-видимому, вполне возможно, что вновь синтезированные мембранные белки могут проходить через рециклинг-эндосомы после того, как покинут Golgi и до того как достигнут поверхности39. Т.о., рециклинг-эндосомы могут быть общим местом для сортировки белков; вообще-то адапторные комплексы в таких эндосомах отбирают груз для включения его в транспортные пузырьки, которые предназначены для специфических доменов плазматической мембраны..
Getting to, and staying in, membrane domains
Сортировка белков во время выхода из Golgi или рециклинг-эндосом является одним уровнем адаптивного механизма для генерации распределений разных белков в поляризованных клетках. Однако молекулярная сортировка д. быть связана с механизмами, которые специфицируют доставку и слияние пузырьков с разными доменами плазматической мембраны. Эти механизмы используют цитоскелет для доставки пузырьков на длинные расстояния и (на короткие расстояния) белковых комплексов в домены плазматической мембраны, которые специфицируют захват и слияние пузырьков. в
The cytoskeleton in vesicle trafficking. Большинство поляризованных клеток имеет специализированные организации из актина и цитоскелет из микротрубочек. Сетчатые структуры из коротких актиновых филамент располагаются под всей плазматической мембраной и могут обеспечивать сцепления посредством ankyrin-spectrin комплексов с мембранными белками25. Актиновый цитоскелет может выполнять несколько ролей в клеточной полярности и доставке белков40, т.к. он регулируется с помощью . CDC42 участвует в нескольких критических контрольных точках, которые регулируют клеточную полярность, включая миозиновые моторные белки, которые могут регулировать доставку пузырьков и ankyrin-spectrin комплексов. В самом деле, нокдаун ankyrin приводит к потере области поверхности латеральной мембраны41, в общем-то за счет снижения доставки белков из Golgi или за счет структурной дестабилизации базолатеральной мембраны способом, который аналогичен делеции spectrin в эритроцитах. в
Массивы микротрубочек обычно организованы в фибробластах с динамичными плюс концами в кортексе и минус концами вблизи центросом, рядом с ядром. В поляризованных клетках микротрубочки обычно собраны в пучки вдоль длинной оси клетки (апико-базально в эпителии, soma-axon в нейронах) со всеми плюс концами в основании клетки или в конце аксона, соотв.42, 43. Микротрубочки, по-видимому, регулируют скорее эффективность, чем точность доставки пузырьков в апикальные и базолатеральные части мембраны эпителиальных клеток44. Кинезиновые моторы на плюс концах микротрубочек участвуют в доставке апикальных белков (напр., в доставке белка p75 protein, но не GPI-закрепленных белков)45 и обычно участвуют в доставке базолатеральных46 и аксональных мембранных белков47 (see the review by Li and Gunderson in this issue). в
Controlling vesicle fusion at plasma membrane domains. Слияние пузырьков с правильными мембранными доменами является критической ступенью в генерации полярности. Два взаимосвязанных механизма регулируют инициальное прикрепление пузырьков к мембране и последующее слияние пузырьков с доменом мембраны-мишени. Члены семейства Rab из малых GTPases, по-видимому, контролируют многие стадии присоединения и слияния пузырьков10. Комплексы, закрепляющие пузырьки, обнаруживаются на многих стадиях экзоцитического пути и, как полагают. увеличивают эффективность и специфичность доставки пузырьков (Fig. 2). На плазматической мембране , по-видимому, регулирует присоединение субнабора пузырьков, включая базолатеральные пузырьки в эпителиальных клетках48, в выросты нейритов и домены сборки аксональных синапсовs49. Экзоцист является крупным комплексом, по крайней мере, из 6 белков, некоторые из которых локализованы на мишенях плазматической мембраны, а др., которые располагаются в транспортных пузырьках, вместе с Rab семейством GTPase и которые помогают контролировать сборку комплексов прикрепления (RAB8 на базолатеральных пузырьках эпителия; RAB3 на синаптических пузырьках)50, 51. Это указывает на то, что присоединение пузырьков к плазматической мембране может происходить посредством сборки exocyst holocomplex. Др. тип комплексов закрепления пузырьков представлен annexins и присутствует на др. плазматических мембранах, таких как апикальные мембраны эпителиальных клеток. Annexins соединены с мембранами phosphatidylinositol-3,4-bisphosphate (PtdIns(3,4)P2)-зависимым и Ca2+-зависимым способом и само-агрегируют. Как и в случае компонентов комплекса экзоциста, annexins могут присутствовать как на пузырьках, так и на мембранах мишенях52. Доставка некоторых из апикальных белков в эпителиальных клетках (напр., доставка sucrase-isomaltase53) нуждается в annexin II, но полный репертуар белков, которые необходимы annexins для доставки в плазматическую мембрану, неизвестен.
Слияние пузырьков с мишенью плазматической мембраны обеспечивается комплексом SNARE, который представлен vesicle (v)-SNAREs (такие как ассоциированный с пузырьками мембранный белок ()) и target (t)-SNAREs (syntaxins)5. В поляризованных эпителиальных клетках апикальные и базолатеральные пузырьки содержат различные v-SNAREs (такие как tetanus-insensitive (Ti)-VAMP и VAMP8, соотв.54) и разные t-SNAREs , локализованные на апикальной (syntaxin-3) и базолатеральной (syntaxin-4) части плазматических мембран55, 56 (Fig. 2). Потеря функции или неправильная локализация SNAREs ведет к одновременному нарушению доставки апикальных и базолатеральных пузырьков в плазматическую мембрану54, 57-59.
Protein retention and molecular fences. Поляризованные мембран-белок локализации могут также достигаться с помощью асимметричной стабилизации доменов плазматической мембраны. Избирательная стабилизация может происходить в отсуствие прямой сортировки в экзоцитические и эндоцитические пути60 возможно в качестве механизма для будущей очистки белков, которые отсортировываются в эти пути61. Несколько классов мембранных белков соединяется с цитоплазматическим поддерживающим комплексом из ankyrin-spectrin, включая транспортеры ионов и каналы (такие как anion exchanger, Na+/K+-ATPase, voltage-gated Na+ channel и Na+/Ca2+-exchanger), рецепторы (такие как Ins(1,4,5)P3 receptor, ryanodine receptor и N-methyl-D-aspartate receptor ()) и белки клеточной адгезии (такие как E-cadherin, L1 (Ng-CAM) и CD44)25. В эпителиальных клетках и нейронах ankyrin-spectrin комплексы дифференциально локализуются на базолатеральной мембране62 на аксонах и дендритах, соотв. 63. Соединения с этими каркасами могут рекрутировать мембранные белки, которые участвуют в тех же самых биологических процессах (такие как образование кластеров T-tubule из Na+/K+-ATPase, IP3R и Na+/Ca2+-exchanger)25 и могут секвестрировать мембранные белки из эндоцитического пути, увеличивая тем самым их время пребывания и накопления60. в
Др. важным свойством развития и поддержания полярности является барьер диффузии, который разделяет мембранные домены, которые во всем остальном являются частью непрерывного липидного бислоя. В эпителиальных клетках этот барьер локализуется на границе между апикальной и базолатеральной частями мембраны и представлен плотными соединениями, которые действуют как молекулярная ограда, для предупреждения свободной диффузии белков из одного домена в др.64; регулируемый везикулярный транспорт (transcytosis) следовательно, необходим, чтобы обойти барьер. Диффузионные барьеры не всегда зависят от межклеточного контакта и могут быть сконструированы в одиночных клетках за счет отложения цитоскелетных каркасов, которые избирательно рекрутируют высокие концентрации мембранных белков, препятствуя тем самым перемещению свободно диффундирующих мембранных белков. Такой барьер возникает в сегменте инициации аксона в нейронах и ограничивает перемещение белков аксональной мембраны в таковую тела и наоборот65. Такая молекулярная загородка использует локализованные ряды actin и ankyrin и может формировать основу диффузионных барьеров в др. типах клеток25. Др. цитоскелетные массивы могут ограничивать диффузию мембранных белков в др. системах (таких как те, что в , на границе между отпочковывающейся и материнской дрожжевой клеткой и в ассоциированных с мембранами цитозольных 'ожерельях' , которые обнаруживаются в основании реснички).
Intrinsic membrane domain orientational cues
Хотя асимметрия в локализации белков плазматической мембраны достигается за счет внутренне присущих механизмов сортировки, остается неясным, как эти пути купированы с общей орентацией клеток в контексте многоклеточности. Ниже обсудим доказательства, что внутриклеточные комплексы (partitioning defective (PAR), Crumbs и Scribble комплексы) обеспечивают сигнал ориентации, который специфицирует общую клеточную полярность, форму и др. функциональные специализации (Figs 3, 4). в
The role of the PAR complex. Поляризация в одиночной клетке и в многоклеточных организмах может быть внесена за счет пути, который использует Ser/Thr kinase и опухолевой супрессор (ортолог у млекопитающих PAR-4, один из шести PAR белков, которые необходимы для установления полярности в раннем развитии Caenorhabditis elegans66; see below). Активация LKB1 в эпителиальных клетках приводит к апикально-базальной поляризации одиночных клеток даже в отсутствие клеточной адгезии67; инактивация LKB1 в нейронах ингибирует образрование аксонов in vitro и in vivo68. Мы рассмотрим роль PAR-4 (LKB1) и др. PAR белков в клеточной полярности в контексте многоклеточности. в
Среди субстратов для LKB1 находятся члены семейства AMP-activated protein kinase (AMPK), которые выполняют многие роли в клетках69. Помимо того, что они являются сенсорами глюкозы и энергии, AMPKα и AMPKβ фосфорилируют киназу легкой цепи не-мышечного миозина, активность которой необходима для формирования соединительных комплексов у Drosophila melanogaster70. Члены AMPK обладают несколькими функциональными гомологиями: киназа synapses of amphids defective (SAD), Ser/Thr kinase PAR1 и семейство ELKL-motif kinases (EMKs; также известных как microtubule affinity-regulating kinases (MARKs)), которые дестабилизируют микротрубочки71. Эти функциональные гомологии играют важные роли в ориентации полярности нейронов и эпителиальных клеток69.
Избыточная экспрессия (известной также как EMK1 и MARK2) в MDCK клетках приводит к частичной переориентации апикальной плазматической мембраны в межклеточные просветы в домене латеральной мембраны, одинаково с ориентацией апикальной (желчных каналов) мембраны в гепатоцитах72. Переориентация MDCK апикальной плазматической мембраны сопровождается изменениями в организации микротрубочек, такими как то, что минус концы микротрубочек локализуются в межклеточных просветах вместо того, чтобы быть на вершине клетки. Кроме того, перенос post-Golgi транспортных пузырьков на апикальную поверхность перенаправляется на окольный путь (пузырьки сначала появляются в базолатеральном домене и затем подвергаются трансцитозу в апикальный домен), это же происходит в гепатоцитах73. Из-за индукции трансцитического пути транспорт апикальных пузырьков происходит независимо из-за реорганизации микротрубочек, PAR1 , по-видимому, затрагивает сортировку апикальных белков в пузырьки или доставку пузырьков в плазматическую мембрану. Интересно, что PAR1 гомологи в почкующихся дрожжах, Kin1 и Kin2, взаимодействуют с аппаратом закрепления пузырьков (Rab белки и exocyst комплекс) и слияния с мембраной (SNAREs)74. Т.о., PAR1 и PAR4 могут регулировать, по крайней мере. две ключевые контрольные точки по доставке post-Golgi пузырьков: по ремоделированию и ориентации микротрубочек и, следовательно, направленность транспорта post-Golgi пузырьков; и присоединение и слияние пузырьков с плазматической мембраной. Действительные механизмы, с помощью кот орых эти киназы осуществляют свои эффекты, неясны, т.к. мутанты D. melanogaster, которые дефектны по AMPK или LKB1, обнаруживают генерализованные дефекты полярности как апикальных, так базолатеральных доменов70.
Помимо PAR1 и PAR4, комплекс PAR представлен тремя каркасными белками или с множественными (PAR3 и PAR6) или с homology (PAR5), и 75, 76 (PAR2) (Fig. 3). Биохимические исследования показали, что PAR3, PAR6 (которые также связывают активный CDC42 (Ref. 77), see below) и atypical protein kinase C (aPKC) формируют субкомплекс (Fig. 4) , который локализуется в в поляризованных эпителиальных клетках78, 79 и на кончиках аксонов нейронов80. Генетические исследования показали, что PAR3-PAR6-aPKC субкомплекс вносит вклад в становление и поддержание апико-базальной полярности в эмбриональных эпителиальных клетках79, 81 и в формирование аксонов нейронов80, 82 (see the review by Iden and Collard in this issue). в
The role of Scribble and Crumbs complexes. Субкомплекс PAR3-PAR6-aPKC взаимодействует функционально с двумя др. комплексами, которые контролируют клеточную полярность: Scribble и Crumbs комплексами (Fig. 3). Scribble комплекс также представлен lethal giant larvae (LGL) и discs large (DLG), регулирует качественные особенности базолатеральной мембраны и локализуется ниже апикального соединительного комплекса и вдоль мембраны в межклеточных контактах79, 81. Crumbs комплекс представлен PDZ-домен-содержащими белками PALS1 (protein associated with LIN-7)-1 (также известный как stardust (STD)) и PATJ (PALS1-associated tight-junction protein)83. Crumbs регулирует качественные особенности апикальной мембраны81 и локализуется на апикальной стороне соединительного комплекса в поляризованных эпителиальных клетках81. Потеря функции или Crumbs или Scribble комплексов ведет к дефектам эпителиальной полярности, которые обусловлены уменьшением области поверхности доменов апикальной и базолатеральной частей мембран, соотв. 79, 81. Как комплексы Crumbs и Scribble регулируют качественные особенности апикальной и базолатеральной мембран, неизвестно.
PAR, Crumbs и Scribble комплексы действительно регулируют локализацию и активность др. др. (Fig. 3). Генетический арнализ показал, что aPKC необходима для раннего развития D. melanogaster , чтобы поддерживать присутствие Crumbs комплекса на апикальной мембране, вообще-то за счет прямого фосфорилирования84 или за счет связывания Crumbs посредством его PDZ-interaction домена с PAR6 (Ref. 85). В более позднем развитии Crumbs необходим для стабилизации PAR3-PAR6-aPKC комплекса на апикальном соединительном комплексе79, 81. aPKC может также фосфорилировать PAR3, снижая сродство PAR3 к aPKC и указывая тем самым, что ассоциация PAR3 с PAR6-aPKC является динамичной86. Это в дальнейшем было подтверждено находкой, что член семейства AMPK PAR1 фосфорилирует PAR3, заставляя PAR3 связывать PAR5 и тем самым ингибировать ассоциацию PAR3 на базолатеральной мембране87 (Fig. 3). Интересно, что PAR1 сам фосфорилируется с помощью aPKC, это заставляет PAR1 соединяться с PAR5 и ведет к ингибированию ассоциации PAR1 с кортексом апикальной мембраны88. Наконец, член комплекса Scribble, LGL, также является мишенью для фосфорилирования с помощью aPKC, а фосфорилирование LGL ингибирует его локализацию в апикальном кортексе89. Активности aPKC, PAR1 и PAR5 оказывают общий эффект 'защиты' качественных особенностей доменов апикальной и базолатеральной мембраны. Это достигается поддержанием апикальной активности Crumbs (и PAR) комплекса путем блокирования вторжения компонентов комплекса Scribble (LGL) и vice versa. Позиционирование комплекса PAR3-PAR6-aPKC в критическом апикально-базолатеральном соединении позволяет ему быть арбитром фосфорилирования компонентов, таких как LGL (предупреждая его апикальную ассоциацию) и PAR3, и предупреждать PAR комплекс от вторжения слишком далеко в базолатеральный домен.
PAR комплекс и Crumbs-3, изоформа Crumbs90, 91, также колокализуются в первичной ресничке поляризованных эпителиальных клеток позвоночных. Первичная ресничка участвует во многих онтогенетических путях у позвоночных и в тканевом гомеостазе92. Crumbs-3 и комплекс PAR непосредственно соединяются через PAR6 и PAR5, также присутствующими в комплексе90. Локализация комплекса в ресничке требует ассоциации с микротубулярным моторным белком KIF3A и интактной микротрубочкой90. Делеция Crumbs-3 ингибирует цилиогенез90, тогда как делеция PAR3 или ингибирование aPKC приводят к снижению длины реснички91. Хотя неизвестно, влияет ли локализация Crumbs-3-PAR комплекса в первичной ресничке на клеточную полярность, но дефекты в генах для сборки или функции первичной реснички ассоциируют со многими генетическими нарушениями, которые характеризуются дефектами роста и полярности эпителиальных клеток, включая поликистозную болезнь почек, дефекты лево-правосторонней асимметрии и 92 (Box 1).
Extrinsic membrane domain orientational cues
Хотя прирожденные клеточные механизмы, описанные выше, регулируют сортировку, доставку и разделение белков по разным доменам мембраны, важно отметить, что эти домены не организованы произвольно на клеточной поверхности, а скорее являются топологически упорядоченными в трехмерном пространстве. Рассмотрим, как внеклеточные сигналы создают матрицу, которая ориентирует внутриклеточные механизмы спецификации доменов и сортировки белков. Клеточная адгезия, как с субстратом (ECM) , так и с др. клетками, важна для установления поляризованной ориентации клеток.
В целом, индивидуальные эпителиальные клетки. которые растут в суспензии - т.е. в отсутствие межклеточных и клетка-ECM адгезии - не формируют полярности, а вместо этого подвергаются запрограммированной клеточной гибели (anoikis). Однако когда растут на поверхности, то каждая одиночная эпителиальныя клетка формирует апикально-базальную ось полярности. Если эта поверхность имеет биологическое значение, такое как поверхность laminin-содержащего ECM, то нейроны специфически формируют аксоны93, одиночные эпителиальные клетки млекопитающих избирательно секретируют beta-casein с апикальной поверхности94, а 3D эпителиальные кисты поляризуются правильно95. Таким образом, слипчивость клетка-субстрат связана не только с пост-трансляционным контролем мембранного трафика и реорганизацией цитоскелета, но и также контролирует транскрипционную активность, которая специфицирует функцию возникающих в результате поляризованных типов клеток96.
Межклеточные контакты обеспечиваются рядом белков клеточной адгезии и интимно связаны с поляризацией клеток97. Напр., эпителиальная межклеточная адгезия в культуральной суспензии индуцирует сегрегацию белков базолатеральной части мембраны в межклеточные контакты и индуцирует доставку апикальных белков на свободную поверхность98. Вообще-то наиболее важным белком для межклеточной слипчивости и клеточной поляризации является E-cadherin, который необходим для эпителиальной организации в раннем эмбриональном развитии99. Гомотипические взаимодействия E-cadherin необходимы для формирования соединительных комплексов, которые поддерживают барьер диффузии между апикальным и базолатеральным доменами эпителиальных клеток. Они также необходимы для локализации комплекса экзоциста48 и для гарантии, что базолатеральные пузырьки будут доставляться100 к сайтам межклеточной адгезии и в латералный домен мембраны. Хотя межклеточные контакты могут помогать контролировать дифференцировку эпителиальных клеток 101, межклеточная слипчивость недостаточна для запуска полной апико-базальной полярности в эпителии , а набор сигналов д. быть приложен вследствие адгезии к ECM.
Integrating extrinsic and intrinsic polarity cues
Мы обсудили три основных слоя регуляции, которые контролируют клеточную полярность. Прирожденные механизмы сортируют мембранные белки в разные пузырьки (сортинг-мотивы и декодирующий аппарат) и доставляют эти пузырьки в разные мембранные домены (цитоскелетом-направляемая доставка, прикрепление пузырьков посредством комплекса экзоциста и annexins) для слияния их с мембраной (SNARE белки). Белковые комплексы на плазматической мембране (PAR, Crumbs и Scribble комплексы) контролируют качественные особенности и распределение функционально и структурно уникальных доменов плазматической мембраны с цитозольной стороны. Внешние сигналы, обеспечиваемы за счет адгезии клеток с ECM и с др. клетками, контролируют ориентацию клеточной полярности. Но как эти разные уровни регуляции клеточной полярности интегрируются в одиночную сеть (Fig. 5)?
Localization of PAR, Scribble and Crumbs complexes. Комплексы PAR3-PAR6-aPKC локализуются в местах, которые важны для решений клеточной полрности: граница между апикальной и базолатеральной частями мембраны эпителиальных клеток (демаркируется с помощью апикального соединительного комплекса), ресничка и кончик аксона у нейронов (Fig. 3). Локализация комплексов PAR3-PAR6-aPKC в этих местах может вызывать прямое соединение с комплексами клеточной адгезии или косвенно рекрутироваться с помощью др. комплексов, которые локально активируются адгезией с этими сайтами (Fig. 5). Генетические исследования на D. melanogaster указывают на то, что PAR3 действует выше сигнала межклеточной адгезии, который обеспечивается с помощью D. melanogaster E-cadherin102, но мембранные белки, которые рекрутируют PAR3 на апикальные соединительные комплексы у D. melanogaster, не идентифицированы. Напротив, в клетках млекопитающих PAR3 соединяется непосредственно с белками межклеточной адгезии JAM-A103 и nectin104, оба из которых колокализуются с E-cadherin на апикальных соединительных комплексах. Межбелковые взаимодействия между PDZ-домен-содержащими белками из комплекса Crumbs (PALS1 и PATJ) и белками PAR комплекса (PAR3 и PAR6) обеспечивают связи, которые в принципе позволяют рекрутировать совместно PAR и Crumbs комплексы в преспецифицированными доменами плазматической мембраны83 (Fig. 4a). PALS1 также необходим для доставки E-cadherin в плазматическую мембрану и тем самым для локализации комплекса экзоциста на плазматической мембране105, показывая тем самым, что сложные механизмы обратной связи участвуют в организации этих белковых комплексов в местах межклеточной адгезии. Интересно, что нарушение одной из субъединиц комплекса экзоциста, EXO84, ведет к потере Crumbs с поверхности эпителиальной клетки ранних эмбрионов D. melanogaster106. Это указывает на то, что х экзоциста играет роль в регуляции белков организации полярности апикального соединительного комплекса. Механизмы, участвующие в локализации комплекса Scribble на доменах цитоплазматической мембраны изучены плохо.
Локальная доставка PAR и Scribble комплексов на плазматическую мембрану происходит вследствие активации, обусловленной клеточной адгезией, CDC42 и RAC1 с помощью сложной регуляторной сети107 (Fig. 4a). CDC42 и RAC1 являются членами семейства Rho малых GTPases. Хотя точные механизмы неясны, потеря активности RAC1 и CDC42 ингибирует обычную поляризацию нейронов и эпителиальных клеток благодаря отсутствию аксональной дифференцировки82 и неправильной ориентации апико-базальной оси95, 108, соотв. Этот признак безусловно отражает тот факт, что компоненты комплекса PAR связаны с локальной регуляцией активности CDC42: CDC42 связывает и рекрутирует PAR6 в кортекс77, 109; PAR3 связывает RAC1 guanine nucleotide-exchange factor (GEF) T-cell-lymphoma invasion and metastasis-1 (TIAM1)110; потеря PAR3 ингибирует CDC42-индуцируемую активацию RAC1 в нейронах82. Т.о., локализация и активность комплекса PAR , CDC42 и RAC1, и вообще соединительный комплекс сам по себе регулируется с помощью позитивной петли обратной связи (Fig. 4a).
The role of phospholipids in defining membrane domains. Локальные асимметрии в содержании фосфолипидов в доменах плазматической мембраны также влияет на локализацию CDC42 и клеточную полярность (Fig. 4a). Локальные изменения в синтеза фосфолипидов детерминируются с помощью относительной активности phosphoinositide 3-kinase (PI3K) и phosphatase and tensin homologue (PTEN). PI3K генерирует phosphatidylinositol-3,4,5-trisphosphate (PtdIns(3,4,5)P3), а PTEN удаляет 5' фосфат из PtdIns(3,4,5)P3 , чтобы генерировать PtdIns(3,4)P2. Ингибирование активности PI3K влияет на обычную поляризацию нейронов, из-за отсутствия дифференцировки аксона80, и эпителиальных клеток из-за неправильной ориентации апико-базальной оси111. PtdIns(3,4,5)P3 локализуется на кончике аксона нейрона80. В поляризованных эпителиальных клетках, PtdIns(3,4,5)P3 концентрируются в базолатеральной плазматической мембране111 и отсутствуют в апикальной мембране, в которой много PtdIns(3,4)P2112 (Fig. 4a).
Как могут различные фосфолипиды генерировать клеточную полярность? Интересно, что annexin II, предположительно каркасный белок, который необходим для доставки sucrase-isomaltase в апикальную мембрану53, также связывает PtdIns(3,4)P2 (Ref. 113). Искусственно вызванное накопление PtdIns(3,4)P2 на базолатеральной мембране заставляет апикальные мембранные белка и annexin II неправильно располагаться в этом мембранном домене; при этом первоначальна апикальная мембрана разрушается112. Annexin II может в свою очередь рекрутировать др. белки, индуцирующие полярность, такие как CDC42 и aPKC (возможно посредством CDC42 как части комплекса PAR3-PAR6). Однако это не может быть единственным механизмом, участвующим в позиционировании CDC42 и aPKC. Активный CDC42 также может быть исключен из межклеточных контактов с помощью гомолога PAC-1, Rho (RhoGAP), который инактивирует CDC-42 межклеточных контактов у ранних эмбрионов C. elegans114. Интересно, однако, что PAR3 связывает также PTEN115, 116 (Fig. 4a). Это указывает на более сложную локальную регуляцию синтеза фосфолипидов на любой стороне апикального соединительного комплекса.
Как асимметрия фосфолипидов связана с полярностью мембранных белков, неясно. Напр.. неизвестно, играют ли роль различия в распределении PtdIns(3,4)P2 и PtdIns(3,4,5)P3 в верности присоединения и слияния транспротных пузырьков. происходящих из Golgi и эндосом(Fig. 4a). CDC42 и RAC1 активируют повсеместно распределенную Wiskott-Aldrich syndrome protein нейральную изоформу N-WASP и WASP family verprolin-homologous protein-1 (WAVE1), соотв. , а вместе эти белки регулируют полимеризацию актина с помощью actin-related protein-2/3 (ARP2/3) комплекса117. Субъединица экзоциста млекопитающих EXO70 ассоциирует с плазматической мембраной путем связывания PtdIns(3,4)P2 и PtdIns(3,4,5)P3. Эта мембранная ассоциация необходима для рекрутирования др. компонентов экзоциста в комплекс и присоединения и слияния post-Golgi базолатеральных транспортных пузырьков с плазматической мембраной118. Scribble также взаимодействует с белками, которые локально регулируют CDC42 и RAC1 и регулируют экзоцитоз пузырьков. Scribble соединяется с PAK-interacting exchange-factor-beta-G protein-coupled receptor kinase-interactor (βPIX-GIT) комплексом119 (Fig. 4b), в котором βPIX zdkztncz GEF для CDC42 и RAC1 (Ref. 120), а GIT является GAP121. комплекс βPIX-GIT регулирует Ca2+-зависимое присоединение и слияние пузырьков с плазматической мембраной, а βPIX-GIT функция нуждается в её GEF активности и локализации на мембране с помощью Scribble119 (Fig. 4b). Важно, что мутации Scribble в ЦНС вызывают накопление пузырьков на синаптических бутонах и снижают высвобождение пузырьков, указывая тем самым, что Scribble важен для присоединения и слияния пузырьков с синаптическими мембранами122. Управляет ли комплекс Scribble-LGL-DLG локальным прикрепление слиянием пузырьков посредством локальной регуляции активности CDC42 и RAC1 и посредством рекрутирования родственного t-SNAREs, пока неясно. Т.о., контроль доставки пузырьков с помощью экзоциста, полимеризация актина, индуцируемая с помощью CDC42, и комплексы, такие как Scribble и βPIX-GIT l, усиливать в общем-то поляризованный фенотип, который индуцируется с помощью комплекса PAR.
Такой механизм показывает, как прирожденный клеточный аппарат для спецификации клеточной полярности, интимно связан с внешними пространственными сигналами; эти сигналы предоставляют матрицу, которая координирует развитие сложной тканевой организации в трехмерном пространстве. В самом деле, очень возможно, что даже одиночная поляризованная клетка, использует тот же самый врожденный аппарат для разных целей в зависимости от того, генерирует ли клетка полярность de novo или поддерживает ранее поляризованный фенотип. Это в свою очередь может просто отражать тот факт, что пространственный сигналы, определяемые во время и после индукции полярности являются, само собой, разными.
Conclusions
Three major layers of regulation that control cell polarity have been identified on the basis of genetic, biochemical and cell biological criteria (Fig. 5). Intrinsic mechanisms sort membrane proteins into different post-Golgi or endosomal vesicles and deliver those vesicles to different membrane domains for membrane fusion. Protein complexes at the plasma membrane (the PAR, Crumbs and Scribble complexes) control the identity of plasma membrane domains. Extrinsic cues that are provided by cell adhesion to the ECM and to other cells control the orientation of cell polarity.
Although the basic biochemical rules that govern protein sorting in the exocytic or endocytic pathway have been described, and important signalling complexes that control cell polarity have been identified, many of the details remain poorly understood. How are apical vesicles formed? What is the full repertoire of adaptor proteins that is required for basolateral protein sorting? How are intrinsic protein sorting and trafficking pathways integrated with functions of the Crumbs, PAR and Scribble complexes in specifying membrane-domain identity? How are extrinsic cell-adhesion orientational cues linked to the intracellular machineries that define membrane-domain organization? Answers to these questions will shed new light on many fundamental aspects of normal development and on the mechanisms that underlie the induction and progression of many diseases, such as cancer.
