Клеточная полярность возникает из векторизации оси, которая управляет внутренней организацией клетки и обнаруживается в большинстве дифференцированных типов клеток метазоа и у одноклеточных организмов, таких как дрожжи, реснитчатые простейшие и даже прокариоты. Наблюдаемая в разных формах в разных типах клеток и видов клеточная полярность определяется двумя фундаментальными признаками: асимметричным накоплением мобильных элементов (часто регуляторных молекул) между противоположными полюсами клетки; и ориентированной организацией прирожденных полярных цитоскелетных филамент (в частоности актина и микротрубочек) вдоль оси полярности (Box 1).

Помещение прирожденных полярных объектов внутри симметричного образования нарушает симметрию хозяина. Актиновые филаменты ( или микрофиламенты) и микротрубочки являются полярными полимерами, которые состоят соотв. из глобулярного актиновых (G-actin) субъединиц, которые связывают и гидролизуют АТФ, и α- and β-tubulin гетеродимерных субъединиц, которые связывают и гидролизуют ГТФ. Полярность возникает в результате ассоциации белковых субъединиц головка-хвост, в результате возникает полимерная решетка, в которой все субъединицы располагаются в одном и том же направлении, а два их конца отличаются структурно (Box 1). Актин и микротрубочки являются также динамичными полимерами, у которых каждый из концов или полимеризуется или деполимеризуется и рост сети зависит от концентраций свободных субъединиц^{1, 2}. Константы скорости, которые управляют ростом и укорочением, отличаются на противоположных концах полимеров благодаря структурным отличиям двух концов. Такие динамические отличия усиливаются за счет гидролиза нуклеотидов с помощью актиновых и тубулиновых субъединиц. Способность подвергаться быстрому обмену и сборке позволяет актину и микротрубочкам быстро и локально реорганизовываться в ответ на сигналы полярности. Клетки в дальнейшем извлекают выгоду из внутренней полярности и динамики актина и микротрубочек посредством большого количества белков, ассоциированных с цитоскелетом, которые переводят асимметрию в структуре и динамике полимеров в поляризованные функции. Промежуточные филаменты, однако , являются неполярными и в целом не вовлекаются в генерацию клеточной полярности³. Это обобщение может быть не окончательным, т.к. недавние исследования показали, что члены septin family, которые образуют неполярные полимеры, которые напоминают промежуточные филаменты, являются важными для клеточной полярности у рада типов клеток^4-6.

Класс белков, ассоциированных с цитоскелетом, которые являются особенно важными для клеточной полярности, это моторные белки. Эти мощные однонаправленные перемещения вдоль актиновых филамент или микротрубочек за счет необратимого движения от одной прочно закрепленной конформации к др., за счет использования энергии гидролиза АТФ ( rev. Refs 7-10). Миозины являются моторными белками для актина и большинство членов сверхсемейства миозинов (за исключением myosin-VI) перемещаются в направлении колючих (barbed) концов актина (Box 1). Некоторые миозины, такие как myosin-V, двигаются поступательно вдоль актиновых филамент (т.е. они движутся за счет многочисленных последовательных ступеней, прежде чем отсоединиться от филаменты) и таким образом пригодны для транспорта на длинные расстояния. Др. миозины, в частности myosin-II, обладают низкой поступательностью (processivity), но могут генерировать сократительные движения, благодаря скольжению актиновых филамент. Микротрубочковые моторы состоят из kinesins и dynein. Большинство кинезинов движутся в направлении плюс концов микротрубочек с разной степенью поступательности, тогда как dynein движется поступательно в направлении минус конца микротрубочки в присутствии dynactin комплекса¹¹ (Box 1). В принципе, молекулы груза или органеллы могут переноситься моторными белками в специфические места клеток, как только клетка устанавливает ориентированные ряды актина и микротрубочек.

Чтобы облегчить сравнение функции актина и микротрубочек, мы разделим процесс образования клеточной полярности на процесс 'symmetry breaking' и 'maintenance of polarity' . Термин нарушение симметрии выбран из-за подчеркивания 'установления полярности' быстро, за счет решающих клеточных переходов от симметричного распределения соотв. составляющих к асимметричному распределению вдоль определенной оси клетки. Во многих хорошо изученных системах, таких как дрожжи и нейтрофилы, нарушение симметрии происходит как стохастический процесс, который управляется внутренними клеточными механизмами. В др. системах, таких как зиготы Caenorhabditis elegans нарушение клеточной симметрии может зависеть от инициального внешнего сигнала (напр., вхождения спермия). Следует отметить, что имеется важный вклад составных частей мембран, особенно phosphoinositides (напр., Ref. 12), и кооперативной сборки сигнальных комплексов (напр., Ref. 13) как для нарушения симметрии, так и поддержания полярности.

Forming polarized cytoskeletal arrays

Цитоскелетным полимерам, чтобы осуществлять поляризованную доставку или локальные функции за счет динамики своих концов, актин и микротрубочки д. собираться в организованные построения. Скорость-ограничивающей ступенью для спонтанной полимеризации актина и микротрубочек является ядрообразование (nucleation) - образование небольших олигомеров. которые могут быстро удлиняться^{14, 15}. Ключевым механизмом при сборке поляризованных актиновых массивов является активация actin-nucleation факторов, таких как actin-related protein-2/3 (Arp2/3) комплекс и белки семейства formin, в определенных местах¹⁶ (Fig. 1a). В клетках, которые используют передвижение ползком, Arp2/3 complex-nucleated актиновые филаменты формируют разветвленную актиновую сеть в lamellipodium, с колючими концами филамент, обращенными к мембране ведущего края^{17, 18}. Такая поляризованная организация актина детерминируется не только за счет внутренней топологии Arp2/3 комплексами обусловленного ветвления актина, но и также за счет ассоциированных с плазматической мембраной белков, которые контролируют активацию комплекса Arp2/3 и регулируют элогнацию и оборот нуклеинованных филамент. Связанное с мембраной Rho-семейство GTPases активирует факторы нуклеации актина или непосредственно (в случае formins) или косвенно посредством факторов, способствующих нуклеации (NPFs)¹⁹. Посредством этих вышестоящих регуляторных факторов Arp2/3 комплексом- или formin-обусловленная нуклеация актина происходит максимально близко к мембране в местах активации Rho GTPase.

В то время как нуклеация является принципиальным механизмом, который регулирует актин во время клеточной поляризации, нуклеация микротрубочек обычно происходит вблизи центра клетки на центросомах (или др. microtubule-organizing centres (MTOCs)), это делает её дистальнее по отношению к происходящим от мембран сигналов, которые стимулируют клеточную полярность. Следовательно, инициальные события, которые локализуют и ориентируют микротрубочки во время поляризации клеток, в основном связаны с факторами, которые регулируют динамику плюс концов микротрубочек. Одним из часто используемых механизмов во время клеточной поляризации является залавливание микротрубочек с помощью кортикальных факторов, которые увеличивают стабильность плюс концов и/или генерируют тянущие силы для микротрубочек^{20, 21} (Fig. 1b). Др. механизмы включают альтерации в свойствах сборки микротрубочек и увязывание в пучки микротрубочек.

Кортикальный захват обычно использщует взаимодействие двух классов белков: белков, которые специфически ассоциируют с плюс концами микротрубочек (наз. +TIPs), и кортикальных факторов, которые контролируются с помощью Rho GTPases и др. membrane-proximal сигнальных факторов (Table 1). +TIPs включают белки, которые в первую очередь ассоциируют с плюс концами микротрубочек, напр., end-binding protein-1 (EB1), и др. белки, такие как цитоплазматический dynein, который также обнаруживается в др. сайтах клетки. В зависимости от факторов, которые активируются, кортикальный захват приводит к диапазону стабилизации от временного увеличения образования пауз в микротрубочках, которые длятся от сек. до минут, до долговременного захвата микротрубочек, сохраняющегося часы. Захват микротрубочек увеличивает локальную плотность микротрубочек и создает способ для увеличения доставки грузов к специфическим местам. Наилучшим примером доставки являются Schizosaccharomyces pombe, у которых временно остановленные микротрубочки на клеточных полюсах доставляют tip elongation aberrant protein-1 (Tea1; a kelch-repeat белок) и Tea4 (an SH3-domain белок ), чтобы регулировать актиновые филаменты посредством рекрутирования formin For3 (Ref. 22). В клетках млекопитающих длительное время (более 10-30 мин) стабилизированные микротрубочки оказываются пост-трасляционно модифицированными и это, как известно, усиливает kinesin-зависимую подвижность в ряде случаев.

В захвате микротрубочек, в котором участвует dynein, тянущие силы, которые направлены в направлении кортикальных сайтов, могут влиять на позиции центросомы или MTOC, а значит и на места нуклеации микротрубочек (Fig. 1b). Первоначально описанные в делящихся клетках Saccharomyces cerevisiae и в асимметрично делящихся ранних эмбрионах C. elegans^{23, 24}, позиционирование dynein-зависимых центросом происходит также в поляризованных мигрирующих клетках и в Т клетках, которые взаимодействуют с мишенями. Тянуobt микротрубочки силы также возникают в результате захваченных микротрубочек, которые подвергаются контролируемому укорочению, хотя этот механизм, как известно, происходит только в делящихся S. cerevisiae²⁵ и у одноклеточных эмбрионов C. elegans²⁶.

Cellular symmetry breaking

Исторически цитоскелет и его моторы рассматривались, как находящиеся под пассивным инструктажем регуляторных молекул, которые локализовались с помощью предсуществующих пространственных сигналов. Однако результаты анализа многих модельных систем заставили пересмотреть это мнение, что цитоскелет не только обеспечивает нижестоящие функции поляризующих сигналов, но и, что более важно, также управляет нарушением процесса симметрии путем локализации ключевых регуляторных молекул на специфических кортикальных сайтах посредством моторных белков и динамической сборки действительно эксклюзивных структур.

Symmetry breaking through a processive myosin. Почкующиеся дрожжи S. cerevisiae переключаются с изотропного на поляризованный рост, чтобы сформировать почку во время вегетативной пролиферации, или во время формирования проекций для спаривания в ответ на феромоны. Два типа актиновых структур участвуют в росте поляризованных дрожжей: actin канаты, которые служат в качестве направляемых сайтами роста транспортных путей для грузов, таких как секреторные пузырьки, комплексы протеин-РНК и различные органеллы; и участки кортикального актина, которые являются эндоцитическими структурами, которые концентрируются в генеральной области сайта роста²⁷. Актиновые кабели состоят из параллельных рядов актиновых филамент, которые нуклеируются двумя форминами , Bni1 и Bnr1, и собираются в длинные пучки благодаря стабилизирующих и связывающих в пучек эффектов tropomyosins и fimbrin, соотв.^28-31. Образование ориентированных актиновых кабелей базируется на локализованной активации Bni1 и/или Bnr1. В свою очередь подобная активация базируется на активных Rho GTPases, т.к. это делают др. diaphanous (Dia)-related formins. Такие Rho GTPases включаютCdc42 и четыре из Rho белков³². Cdc42 является мастером регулятором клеточной полярности у дрожжей, а также у большинства др. эукариот³³ (see also the review by Iden and Collard in this issue). Cdc42 соединяется с N-терминальнымl Rho-связывающим доменом в Bni1 и является необходимым для поляризованной ориентации актиновых кабелей³⁴. Однако генетический анализ указывает на то, что Rho белки могут быть первичными GTPases, которые контролируют активацию formin, тогда как Cdc42 играет пока неизвестную роль в локализации этого процесса на полярном коректсе^{35, 36}.

Даже если биохимические ступени между Cdc42 и поляризованной сборкой актиновых кабелей неуловимы, ясно, что образование актиновых кабелей является важной мишенью для Cdc42, чтобы контролировать поляризованный транспорт. Однако недавние исследования на дрожжах показали, что актин, в свою очередь, воздействует на локализацию Rho GTPase благодаря своей транспортной функции^{37, 38}. Такое взаимодействие в виде петли обратной связи позволяет актину выполнять активную роль в нарушении процесса симметрии, что ведет к поляризованному распределению активной GTPase. Это лучше всего оценено в экспериментальной системе, в которой не поляризованные в G1 арестованные дрожжевые клетки могут поляризоваться спонтанно на индукцию постоянно активной Cdc42 (Fig. 2a). Блокирование поляризации актина или предупреждение myosin-V транспорта препятствует Cdc42-GTP-индуцированной спонтанной поляризации, указывая тем самым, что актин не пассивно отвечает на нижестоящую Cdc42 (Ref. 37). Математическое моделирование показало. что петля позитивной обратной связи, которая состоит из Cdc42-направляемого формирования актиновых кабелей и актиновыми кабелями обусловленного транспорта Cdc42 в плазматическую мембрану оказывается достаточным, теоретически, чтобы превратить первоначально случайное распределение Cdc42-GTP на кортексе в стабильную кортикальную локализацию Cdc42, в направлении которой и ориентируются актиновые кабели. Вклад этого механизма нарушения симметрии в физиологическую поляризацию был продемонстрирован позднее³⁹. Вместе с этим в более раннем исследовании¹³ был также установлен параллельный независимый от цитоскелета механизм нарушения симметрии, который может использовать кооперативную сборку сигнального комплекса, который регулирует активацию Cdc42 .

Symmetry breaking through a contractile myosin. Клеточная полярность является критической для асимметричных клеточных делений, онтогенетический механизм которых необходим для диверсификации клеточных судеб. В зиготе C. elegans асимметричные клеточные деления происходят вдоль плоскости, которая перпендикулярна anterior-posterior (A-P) оси полярности, которая устанавливается вскоре после оплодотворения²⁴. A-P полярность предопределяется за счет локализации определенных наборов PAR proteins (partitioning defective proteins) на противоположных кортикальных полушариях зиготы: сильно законсервированные белки PAR-3, PAR-6 и atypical protein kinase C (aPKC) локализуются в передней части кортекса. Это асимметричное формирование паттерна кортикальных детерминант необходимо для корректной ориентации и позиционирования веретена первого митотического деления, которое в свою очередь предопределяет плоскость первого деления клетки.

Локализация передних детерминант достигается актин- и миозин-зависимым способом. Однако в противоположность механизму у дрожжей процесс транспорта подкрепляется myosin-II^40-42. Вхождение спермия в ооцит локально ослабляет actomyosin сеть на презумптивном заднем полюсе, это ведет к серии контракций сети в переднем направлении (Fig. 2b). PAR-3 и PAR-6 локализуются в точечных структурах, которые драматически ассоциируют с кортикальным актином и перемещаются вдоль контрактильной сети. Истощение myosin-II , используя RNA interference (RNAi) предупреждает концентрацию этих белков в направлении передней части кортекса⁴². Однако , PAR-3 и PAR-6 белки не являются пассивными грузами контрактильной сети, т.к. контрактильные движения сильно снижены у эмбрионов, лишенных этих белков⁴². Локализованный в задней чати кортекса PAR-2, ингибирует, однако кортикальную потребность в миозине и в направленных кзади контрактильных движениях во время фазы поддержания. PAR-2 и локализованная впереди PAR-3-PAR-6-aPKC когорта также противодействуют способности один другого ассоциировать с кортексом^{43, 44}. Эта сеть взаимодействий (Fig. 2b) может сильно умножить небольшую инициальную асимметрию в контрактильных силах, которая индуцируется вхождением спермия, приводя к стабильной сегрегации PAR белков и тем самым к хорошо известной полярности клетки.

Интересно, что эта система нарушения симметрии, по-видимому, нуждается в пространственном сигнале, который предоставляется местом вхождения спермия, в то время как остальные события поляризации пространственных сигналов ориентируют ось полярности, но могут быть не нужны для нарушения симметрии per se⁴⁵. Сигнал спермия, по-видимому, затрагивает активацию Rho GTPase^46-48, которая осуществляет двойной контроль за сборкой актомиозиновой сети: Rho-GTP стимулирует активацию myosin-II и сборку филамент путем обеспечения фосфорилирования myosin-II regulatory light chain (MRLC), а также активирует formin белки, чтобы нуклеировать полимеризацию актина⁴⁹. Было бы интересно установить, вообще-то с помощью математического моделирования, способна ли система зиготы C. elegans к спонтанному нарушению симметрии за счет петель обратной связи в сети, которая соединяет PAR белки м контрактильность actomyosin.

Вовлечение контрактильной сети actomyosin в поляризацию клеток может быть не уникальным для зигот C. elegans, как показали недавние находки на эпителиальных клетках. Эпителиальные клетки в своем дифференцированном состоянии обладают апикально-базальной полярностью, которая определяется богатым микроворсинками апикальным доменом и базально-латеральным доменом, который обеспечивает межклеточное и клетка-матрикс прикрепление⁵⁰. Имеются строгие доказательства роли межклеточных и клетка-матрикс контактов в установлении и поддержании апикально-базальной полярности. Однако неожиданно было установлено, что эктопическая активация kinase LKB1 в эпителиальных клетках индуцирует спонтанные нарушения симметрии и установление четких апикального и базо-латерального доменов в отсуствие межклеточных контактов⁵¹. LKB1 является белком опухолевого супрессора, который гомологичен C. elegans PAR-4, который необходим для спецификации задней части кортекса⁵². Недавно было установлено, что в этой модели полярности, мишенью для LKB1 является AMP-activated kinase AMPK, активация которой отвечает также на потерю энергии^{53, 54}. По крайней мере, одним из субстратов для AMPK при индукции клеточной полярности является MRLC. Удивительно, что экспрессия постоянно фосфорилированной (активной) формы MRLC достаточна для индукции нарушения симметрии в др. не поляризованных эпителиальных клетках. Хотя механические детали этого процесса неясны, существует соблазн спекуляций, что механизм, который участвует в активации базирующейся на myosin-II контрактильности, и который сходен с тем, что описан для C. elegans, может быть ключом для установления полярности эпителия, учитывая что PAR-3, PAR-6 и aPKC необходимы для установления эпителиальной полярности⁵⁵.

Symmetry breaking through competitive actin assembly. Поляризация является важной первой ступенью в клеточной миграции, посредством которой клетки устанавливают фронт выпячиваний (ведущий край) и сократимый тыл. Хотя оба богаты актином, но филаменты этих клеточных доменов организованы в разные структуры¹⁸. Ведущий край является выступающей богатой актином структурой, в которой филаменты организованы в ветвящиеся (в ламелиподиях) или параллельные (в filopodia) построения. Актиновые филаменты ламеллиподий скорее всего генерируются благодаря нуклеации с помощью Arp2/3 комплекса, хотя в одном из исследований было предположено, что актин ламеллиподий также может собираться Arp2/3-независимым способом⁵⁶. Др. актин-связывающие белки, такие как ADF или cofilin (hereafter referred to as ADF/cofilin) и capping белок, контролируют динамику актина на клеточном фронте⁵⁷. Актин в тылу мигрирующих клеток организован в контрактильные структуры, которые богаты myosin-II, белком. который в основном отсутствует в выпячивающихся ламеллиподиях. Контрактильные актиновые филаменты часто покрыты tropomyosins, семейства длинных двухспиральных (coiled-coil) полипептидов, которые обеспечивают взаимодействия голова-хвост вдоль актиновых филамент⁵⁸, это может влиять на механохимию myosin-II⁵⁹ и может также облегчать полимеризацию актина с помощью форминов⁶⁰. в

Относительно их сборки эти два типа актиновых структур действительно взаимоисключительны как на структурном уровне, так и на регуляторном уровне. In vitro биохимия показала, что декорированные tropomyosin филаменты не могут ветвиться с помощью Arp2/3 комплекса, чтобы сформировать ветвещиеся структуры⁶¹, возможно благодаря перекрыванию между сайтами связывания тропомиозина и сайтов связывания Arp2/3 на актине⁶². Актиновые филаменты, которые связаны с определенными изоформами тропомиозина также защищены от разделения и деполимеризации с помощью ADF/cofilin^{63, 64}. Кроме того, эти два типа актиновых структур могут конкурировать за актиновые мономеры во время своей сборки. Arp2/3-обеспечиваемая нуклеация актина стимулируется с помощью Rac, тогда как Rho способствует сборке контрактильных актомиозиновых сетей^{19, 49}. В свою очередь, protrusive актин и myosin-II позитивно влияют на активацию своих вышестоящих GTPases^{65, 66}. Активные Rho и Rac GTPases кроме того действительно ингибируют др. др. ^67-70 (rev.Collard in this issue).

В нейтрофилах, взаимное исключение путей сборки фронтального и тылового актина является критическим для поляризации и направленной подвижности в ответ на хемоаттрактанты^{71, 72} (Fig. 2c). Ингибирование Rho или её нижестоящих мишеней, таких как myosin-II, индуцирует множественные выпячивающиеся актиновые структуры и вызывает неспособность устанавливать уникальную ось клеточной полярности. Напротив, ингибирование сборки protrusive актина ведет к распространению активного RhoA, который обычно ограничен тылом клетки. Математическая модель, базирующаяся только на взаимных ингибирующих взаимодействиях между фронтальным и тыльным путями, показала, что эта сеть достаточна для управления нарушением симметрии и для стабильного расхождения фронтального и тылового доменов цитоскелета⁷³. Эта модель может также объяснить способность механически индуцировать контракции неполяризованных клеток, чтобы создать устойчивую фронт-тыл полярность и инициировать миграцию⁷⁴.

Symmetry breaking through microtubules. Нейроны являются высоко поляризованными клетками, которые обычно имеют одиночный длинный, тонкий отросток (аксон) для передачи информации и множественные короткие и толстые отростки (дендриты) , чтобы получать информацию. Исследования культивируемых эмбриональных нейронов гиппокампа грызунов предоставили информацию о факторах, которые участвуют в спецификации полярности нейрональных клеток^{75, 76}.Культивируемые нейроны гиппокампа сначала выпячивают многочисленные, морфологически неотличимые, недифференцированные нейриты. Эта симметрия нарушается, когд один из нейритов начинает быстро расти и приобретает маркеры аксона (такие как дефосфорилировнный tau, a microtubule-associated protein (MAP)), тогда как остальные нейриты остаются короткими. Со временем короткие нейриты в культуре начинают расти и дифференцироваться в дендриты, приобретая маркеры дендритов (такие как MAP2).

Давно известно, что микротрубочки в нервных отростках более стабильны, чем динамические микротрубочки в пролиферирующих клетках, что демонстрируется их резистентностью к агентам, деполимеризующим микротрубочки, и их высокими уровнями пост-трансляционно модифицированных тубулинов^77-79. В недавнем исследовании нейронов гиппокампа определение количественного соотношения ацетилированного тубулина к тотальному тубулину показало увеличенное соотношение в аксонах по сравнению с недифференцированными нейритами. Важно, что стабилизация микротрубочек оказывается достаточной, чтобы индуцировать формирование аксона, т.к. локальная стабилизация микротрубочек в недифференцированных нейритах за счет фотоактивации аналога taxol вызывает сильную склонность обработанных нейритов становиться аксонами (Fig. 3).

Поэтому важно определить, как нейроны первоначально стабилизируют микротрубочки в аксоне. Большое количество факторов участвует в регуляции стабильности микротрубочек в аксонах, включая kinases (напр., glycogen synthase kinase-3 (GSK3), PAR1 или SAD, LKB1 и aPKC), адапторы (напр., collapsin response mediator protein-2 (CRMP2)) и MAPs (tau, adenomatous polyposis coli (APC) и MAP1B)^{75, 76}. Однако все-ещё неизвестно, какой из этих факторов участвует в инициальной стабилизации микротрубочек в аксоне и как они может быть ограничены презумптивным аксоном. Одна возможность заключается в том, что центросомы могут увеличивать доставку одного или более из этих факторов в презумптивный аксон, хотя роль позиции центросом в спецификации аксона противоречива^{81, 82}. Альтернативно, может участвовать дестабилизация локального актина, которая может стимулировать вырост аксона^{83, 84}.

Процессы, затрагиваемые усилением стабилизации микротрубочек в аксоне, неясны. Известно прецендентное увеличение доставки мембранных грузов в аксон посредством kinesin-зависимого транспорта и даже определенных мембранных энзимов, чтобы внести вклад в детерминацию аксона^{85, 86}. Более неожиданным грузом оказался белок полярности PAR3, который связывается непосредственно с kinesin-3 (KIF3A)⁸⁷. PAR3, PAR6 и aPKC необходимы для спецификации аксона в нейронах гиппокампа^{88, 89} (хотя не в нейронах Drosophila melanogaster⁹⁰) и могут усиливать образование стабильных микротрубочек благодаря негативной регуляции MAP/microtubule affinity-regulating kinase (MARK) или MARK-related kinase PAR1 (обозначаемая MARK/PAR1)⁹¹. MARK/PAR1 может дестабилизировать микротрубочки путем фосфорилирования MAPs⁹². Стабилизация микротрубочек непосредственно затрагивает kinesin-based транспорт: пост-трансляционные модификации, такие как detyrosination, polyglutamylation и ацетилирование, усиливают связывание kinesin-1 с микротрубочками и вносят вклад в процессы транспорта в нейронах и фибробластах^93-96. Интересно, что информация о усилении транспорта в аксоны может располагаться в моторном домене kinesin, т.к. kinesin-1 головок достаточно, чтобы направлять kinesin в аксон^{97, 98}. Все эти взаимодействия, описанные выше выявляют потенциальную петлю позитивной обратной связи между микротрубочками, kinesin-based транспортом и сигнальными молекулами, такими как PAR3, для нарушения инициальной симметрии, которое устанавливает полярность нейрона.

Maintenance of cell polarity

Однажды установленная клеточная полярность сильно варьирует по продолжительности в зависимости от типа клеток. Полярность д. быть стабильной в клетках, которые нуждаются в поддержании своего высоко дифференцированного состояния и функции (напр., нейроны и эпителиальные клетки), тогда как стабильность может быть менее важной в нейтрофилах, которые гоняются кувыркаясь за бактериями, или в дрожжевых клетках, которые в поиске партнеров по спариванию. Вместо этого способность чутко отвечать на пространственные и временные изменения во внешних стимулах (хемоаттрактаны, высвобождаемые бактериями, или феромоны спаривания, соотв. ) может оказаться более важной. Хотя еще много предстоит понять относительно принципов, которые управляют продолжительностью поляризованного состояния, актин вности вклад в поддержание клеточной полярности динамическим способом благодаря своей эндоцитической функции, тогда как микротрубочки важны для длительно сохраняемой полярности в крупных клетках.

Maintaining dynamic cell polarity through endocytosis. Поддержание концентрации молекул в специфических местах кортеса не тривиальный вопрос из-за диффузии. У дрожжей очевидно, что многие поляризованные кортикальные белки могут диффундировать с готовностью вдоль мембраны и/или прочь из мембраны даже после того, как клетки достигнут кажущейся стабильной поляризованной концентрации эти х белков в кортексе^{39, 99-101}. По существу поляризованное распределение этих белков может быть достигнуто и поддерживаться динамическим способом посредством непрерывной новой доставки 'исчезнувших' молекул. Рециклинг закрепленных на мембране белков может завершаться с помощью endocytic recycling, который у дрожжей происходит в участках кортикального актина, которые собираются с помощью Arp2/3 комплексов и некоторых NPFs¹⁰². Полимеризация разветвленной актиновой сети вместе с myosin-I мотором, управляют инвагинациями и элонгацией эндоцитических мембран и ведут к отделению эндоцитических пузырьков. В клетках млекопитающих полимеризация актина запускает также перемещения эндосом¹⁰².

Эффективность эндоцитоза в поляризации мембранных белков установлена в экспериментах на дрожжах, у которых в плазматической мембране SNARE Sso1, который обычно униформно распределен вокруг клетки, становится поляризованным после внесения эндоцитического сигнала на его цитоплазматический домен¹⁰⁰. Концентрация связанного с мембраной Cdc42 в сайте поляризованного роста нуждается в актине^{39, 103,}, возможно из-за его эндоцитической функции³⁷. Математическая модель, которая описывает поддержание связанного с мембраной Cdc42, базируется на механизме баланса диффузии с эндоцитозом и транспортом, предсказывает не монотонные взаимоотношения между скоростью эндоцитоза и степенью концентрации мембранных белков¹⁰⁴, это указывает на то, что поляризация связанных с мембраной белков может быть очень тонко регулироваться посредством эндоцитоза.

GПотебность в эндоцитозе для клеточной полярности отмечена также и в др. типах клеток, таких как делящиеся дрожжи¹⁰⁵, мигрирующие клетки¹⁰⁶, асимметрично делящиеся стволовые клетки¹⁰⁷, эпителиальные клетки^108-110 и ооциты D. melanogaster^{111, 112}. Неожиданно при RNAi скрининге генов, которые регулируют мембранный трафик у C. elegans , установлено, что законсервированные регуляторы клеточной полярности, такие как CDC-42 и PAR белки, в совою очередь необходимы для эффективного эндоцитоза¹¹³. Сходным образом в ооцитах D. melanogaster задний детерминант белок Oskar является эндоцитическим грузом и также стимулирует эндоцитоз, возможно путем регуляции динамики актина^{111, 112}. Такое двунаправленное взаимодействие между кортикальными регуляторами и эндоцитозом подтверждает потенциальную роль эндоцитоза в теории Turing-Gierer-Meinhardt, которая часто используется для объяснения клеточной полярности и восприятия градиента¹¹⁴. Эта теория предполагает присутствие медленно диффундирующего аутокаталитического активатора и неуловимого глобального ингибитора, который является продуктом активатора и ограничивает распространение активатора. Эндоцитоз, actin-based процесс, который интернализует связанные с мембраной активаторы (напр., CDC42 и Oskar) и сам себя стимулирует тем самым, может быть желанным 'global inhibitor' , который необходим для клеточной полярности. Phosphatase and tensin homologue (PTEN), который дефосфорилирует phosphatidylinositol-3,4,5-trisphosphate, является др. кандидатом на роль глобального ингибитора в клетках Dictyostelium discoideum, которые подвергаются хемотаксису^{115, 116}.

Microtubules in T-cell polarity. В то время как микротрубочками направляемый мембранный трафик является безусловно вносящим вклад фактором нарушения симметрии в нейронах, более распространенная роль микротрубочек необходима для усиления инициальной полярности, которая устанавливается за счет действия актинового цитоскелета, особенно в крупных клетках или клетках, которые нуждаются долговременной полярности. Когда Т клетки взаимодействуют с мишенями. они формируют иммунологические синапсы, которые содержат собранные в кластеры сигнальные молекулы и актиновые филаменты и они переориентируют свои центросомы в направлении синапса (Fig. 4). Переориентировка происходит во время взаимодействия Т клеток с антиген-презентирующими клетками и во время взаимодействия клеток natural killer (NK) и cytotoxic T lymphocytes (CTLs) со своими мишенями и она необходима для эффективного лизиса мишеней, связанных с NK клетками и CTLs¹¹⁷. Задействование Т-клеточных рецепторов ведет к передаче сигналов. которые запускают актин-зависимое образование иммунологических синапсов, сопровождаемое быстрой переориентацией центросом в позицию вблизи синапса. Активация Rho GTPase CDC42, по-видимому, играет ключевую роль в инициации переориентации центросом¹¹⁸. Во время переориентации микротрубочки взаимодействуют латерально с синапсом, это приводит к активному перемещению центросом в направлении синапса¹¹⁹. Dynein взаимодействует с adhesion- and degranulation-promoting adaptor protein (ADAP), каркасным белком, который связывает передачу сигналов Т-клеточных рецепторов с кластерами integrin и оба белка обнаруживаются в периферических синапсах. Это ведет к возможности того, что ассоциированный с синапсом dynein генерирует силы на микротрубочках, чтобы тянуть центросомы в направлении синапса¹²⁰. Локализация центросом вблизи иммунологического синапса позиционирует аппарат Гольджи и литические гранулы вблизи синапса, гарантируя тем самым прямую секрецию в направлении клеток мишеней¹²¹.

Microtubules and polarity in migrating cells. В слипчивых мигрирующих клетках имеется, по крайней мере, два источника асимметрии во время организации микротрубочек: ориентация ценросом и избирательная стабилизация субнабора микротрубочек²⁰ (Fig. 4). Ориентация центросом это локализация центросом в положении между ядром и ведущим краем, которое возникает в разных типах мигрирующих клеток, включая макрофаги, фибробласты, эпителиальные клетки, астроциты и нейроны. Общий набор сигнальных факторов, включая CDC42, PAR6, aPKC и dynein, регулирует ориентацию центросом^122-124. Однако разнообразные CDC42 эффекторы участвуют в ориентации центросом. включая IQ motif-containing GTPase-activating protein-1 (IQGAP1)¹²⁵, myotonic dystrophy kinase-related CDC42-binding kinase (MRCK)¹²⁶ и mammalian formin diaphanous-1 (mDia1)¹²⁷, это указывает на то, что точный механизм может зависеть от типа клетки или использования разных нижестоящих путей. Это разнообразие эффекторов в ориентации центросом может также отражать скоординированную потребность как в микротрубочках, так и актиновых филаментах, как это продемонстрировано на фибробластах¹²⁶. В этих клетках центросомы не перемещаются в свою позицию во фронт ядра, а вместо этого ядро перемещается прочь из ведущего края актин- и миозин-зависимым способом. Центросомы поддерживаются в центре с помощью dynein, который, как полагают, действует на микротрубочки периферических сайтов¹²⁶.

Нборы микротрубочек в мигрирующих клетках также поляризуются с помощью образования субнабора персистирующих стабильных молекул вблизи ведущего края, которые накапливают пост-трансляционные модификации тубулина¹²⁸. Поляризация центросом и избирательная стабилизация микротрубочек происходит конкурентно в фибробластах, хотя каждый процесс регулируется независимо¹²³. В фибробластах, эмбриональных энтодермальных клетках и глиальных клетках образование стабилизированных микротрубочек регулируется с помощью Rho GTPase и её эффектора mDia1 (Refs 127-131). Пути Rho и mDia1 генерируют сбаилизированные микротрубочки в фибробластах путем capping плюс концов микротрубочек, что продемонстрировано по отсутствию добавления тубулиновых субъединиц или потерей их с концов стабилизированных микротрубочек^{131, 132}. mDia1, скорее всего, является ключевым игроком в capping микротрубочек, т.к. родственный белок, mDia2, непосредственно стабилизирует концы микротрубочек in vitro¹³³. Ограниченное формирование стабильных микротрубочек вблизи ведущего края обусловлено вовлечением интегрина и передачи сигналов focal adhesion kinase, которая ограничивает способность активной Rho активировать mDia1 только вблизи ведущего края¹³⁴. Ряд +TIPs вовлечен в Rho-mDia1-обеспечиваемую стабилизацию микротрубочек, включая EB1 и APC в фибробластах и actin crosslinking family protein-7 (ACF7; также известного как microtubule-actin crosslinking factor (MACF)) в энтодермальных клетках^{130, 135}. Др. тип +TIP, cytoplasmic linker protein (CLIP)-associating proteins (CLASPs), также вносит вклад в формирование стабилизированных микротрубочек в фибробластах¹³⁶. CLASPs взаимодействует с мембранным белком LL5β, и это вносит вклад в capture микротрубочек на кортикальных сайтах¹³⁷. CLASPs, по-видимому, регулируется с помощью Rac, GSK3β и phosphoinositide 3-kinase (PI3K), скорее, чем с помощью Rho^{136, 138}. Необходимы дополнительные исследования, чтобы определить, участвует ли разнообразие +TIPs в стабилизации микротрубочек, указывая на один, но сложный механизм или на разнообразные механизмы, каждый из которых может быть активирован для стабилизации микротрубочек. в

Microtubules in the maintenance of epithelial polarity. После инициации эпителиальной полярности микротрубочки подвергаются драматической перестройке из радиальных центросомных построений в не-центросомные построения В столбчатом эпителии не-центросомные микротрубочки оказываются ранжированы вдоль апикально-базальной оси, преимущественно с минус концами к апикальному полюсу и плюс концами к базальному полюсу¹⁴¹. Имеются также построения из коротких микротрубочек смешанной полярности как на апикальном, так и базальном конце. Образование эпителиальных (E)-cadherin adherens junctions запускает образование не-центросомных микротрубочек и общее увеличение стабильности микротрубочек¹⁴². В исследовании на эбрионах D. melanogaster показано, что aPKC участвует в генерации не-центросомных построений в эпителии, благодаря высвобождению микротрубочек из центросом¹⁴³. EB1 и APC вносят вклад в базальную сеть микротрубочек, но мало, если вообще известно о том, как эти построения образуются и поддерживаются¹⁴⁴.

Базолатеральные и апикальные мембранные домны эпителиальных клеток обладают разными составами белков, а исследования белков вирусных мембран четко показало, что белки, предназначенные для этих мембран доставляются разными путями во время внутриклеточного таргетинга¹⁴⁵. Имеются строгие доказательства, что белки, связанные с апикальным доменом, поставляются с помощью микротрубочек. Nocodazole вызываемое разрушение микротрубочек ведет к неполяризованному накоплению апикальных белков как в апикальном. так и базальном доменах. Это может отражать перераспределение обычно апикального SNARE белка syntaxin-4 в базолатеральные сайты в отсутствие микротрубочек¹⁴⁶. Кроме того, некоторые киназы, как было показано, специфически вовлекаются в доставку апикальных белков из аппарата Гольджи в апикальную часть мембраны^{147, 148}. в

В противоположность апикальным белкам микротрубочки, по-видимому, не нужны для доставки базолатеральных белков. Этот результат является неожиданным, учитывая высоко поляризованные построения микротрубочек, которые распространяются от апикальной области, в которой локализуется Гольджи, в направлении базальной мембраны эпителиальных клеток. Было предположено, что обычный базолатеральный маршрут может быть сохранен после обработки nocodazole, который рассеивает апикально расположенный аппарат Гольджи к сацтам вблизи базолатеральной мембране¹⁴⁵. Если kinesins могут участвовать в базолатеральном снабжении, то он д. вдохнуть в жизнь идею, что существует зависимый от микротрубочек маршрут к базолатеральной мембране.

Microtubule-actin filament crosstalk

Для микротрубочек, чтобы построить и стабилизировать полярность, которая инициируется с помощью актина, две цитоскелетные системы д. быть скоординированы посредством взаимодействий. Это взаимное влияние происходит в обоих направлениях, при этом актин вносит вклад в инициальную поляризацию построений микротрубочек, а поляризованные ряды микротрубочек усиливают инициальную асимметрию актинового цитоскелета. Как отмечалось выше, молекулярный механизм зависимой от микротрубочек доставки актин регуляторных факторов, был установлен на S. pombe.

Ранние исследования на фибробластах показали, что нарушения микротрубочек с помощью антагонистов микротрубочек вызывает коллапс фронт-тыл полярности в мигрирующих клетках^{149, 150}, а более недавние исследования подтвердили этот результат для быстро движущихся нейтрофилов, подверженных хемотаксису¹⁵¹. Два механизма было предложено, чтобы объяснить вклад микротрубочек в фронт-тыл полярность. У нейтрофилов разрушение микротрубочек вызывает Rho-обусловленную контрактильность в хвосте, которая распространяется, чтобы устранить способность клеток устанавливать protrusive активность на своем ведущем крае¹⁵¹. Молекулярной основой этого может быть вовлечение способности микротрубочек регулировать Rho GTPases, которые контролируют protrusive актин во фронте и контрактильный актин в тылу. Разрушение микротрубочек с помощью nocodazole или colchicine активирует глобально Rho с одновременным увеличением контрактильности^{152, 153}. Микротрубочки соединяются с одним из Rho guanine nucleotide-exchange factors (GEFs), RhoGEF H1, который участвует в активации Rho. Вследствие разрушения микротрубочек обменная активность RhoGEF H1 увеличивается, это ведет к увеличению уровней активного Rho¹⁵⁴. Необходимо знание эндогенных факторов, которые высвобождают RhoGEF H1 с микротрубочек и делают возможной их активацию.

микротрубочки могут также влиять на актин в мигрирующих клетках путем воздействия на фокальные адгезии. Фокальные адгезии являются местами кластеров интегринов и ассоциированных молекул, которые связаны с актиновыми стрессовыми волокнам и обеспечивают тягу для клеточной миграции. Исследование картин показало, что динамические микротрубочки контактируют с фокальными адгезиями и , поступая так. запускают разборку фокальных адгезий и ассоциированных с ними актиновых стрессовых волокон^{155, 156}. Процесс разборки, который запускается с помощью микротрубочек, использует эндоцитоз интегринов. Канонический эндоцитический белок dynamin собирается в кластеры на разобранных фокальных адгезиях и необходим для индуцируемой микротрубочками разборки фокальных адгезий¹⁵⁷. Этот результат указывает на то, что микротрубочки могут доставлять факторы, которые запускают эндоцитоз компонентов фокальных адгезий. Т.к. разборка зрелых фокальных адгезий происходит прежде всего в средине и хвосте мигрирующей клетки, то это вносит вклад в поляризацию фокальных адгезий со сборкой преимущественно по фронту и разборкой их в тылу. Целенаправленные изменения фокальных адгезий являются примером вклада динамичных микротрубочек в клеточную поляризацию и может объяснить наблюдение, что низкие концентрации антагонистов микротрубочек, которые тушат динамику микротрубочек, снижают скорость мигрирующих клеток¹⁵⁸.

Актиновый цитоскелет вносит вклад в сборку поляризованных построений микротрубочек в мигрирующих клетках рядом способов. Как упоминалось выше поляризация центросом в фибробластах использует совместную работу актин-зависимых движений ядра и зависимое от микротрубочек центрирование центросом. Др. примером является разборка фокальных адгезий с помощью микротрубочек, хотя и отличная от поляризации центросом, но эффекты этого являются скорее локальными. чем глобальными. Хотя микротрубочки обычно растут прямо благодаря ограничениям, налагаемым решеткой микротрубочек, изучение картин показало, что микротрубочки изгибаются в направлении фокальных адгезий, когда оказываются в их близи¹⁵⁶. Стрессовые волокна скорее всего наводят микротрубочки на фокальные адгезии, хотя неясно используется ли для этого направленный молекулярный механизм или физический. Типа V myosin (myosin-Va) может взаимодействовать с +TIP EB1 посредством адапторного белка melanophilin, и это может наводить микротрубочки на колючие концы актиновых филамент. которые ассоциируют с компонентами фокальных адгезий¹⁵⁹. В самом деле, более ранние работы на почкующихся дрожжах показали, что сходный механизм, который использует EB1 ортолог (Bim1) и myosin-V (Myo2), направляет микротрубочки в направлении почки, чтобы переместить ядро и ориентировать веретено вдоль оси мать-почка¹⁶⁰. Т.к. актиновые построения генерируются на мембране во время большинства процессов нарушения симметрии, то это может быть распространенным механизмом взаимодействия, который усиливает capture микротрубочек во время клеточной поляризации.

Concluding remarks

The examples discussed above include cells of various sizes and polarized cell states that last from minutes (for example, yeast and neutrophils) to days or even years (for example, epithelial cells and neurons). These different cell types rely on actin and microtubules to polarize to different degrees and in different ways, but some general themes have begun to emerge. Actin seems to have a key role in the initial symmetry-breaking process and enables a rapid response to stimuli in cells of all sizes, with the possible exception of neurons, in which symmetry breaking is driven by a microtubule-based mechanism. This role might stem from the versatility in the assembly and organization of actin filaments, especially at the cell cortex, and from the many ways by which actin mediates the transport of cytosolic and cortical components. Microtubules, however, build on and stabilize the initial asymmetry that is created by actin-based forces. This function requires transport along microtubules that can be orientated by positioning the centrosome and/or by stabilizing and adding post-translational modifications to a subset of microtubules. The contributions of microtubules to cell polarization seem to increase with cell size and with the longevity of the polarized state. Some of these generalizations might not last, however, as the field has just begun to 'break' the secretive shell of cell polarity

Beyond polymer polarity: how the cytoskeleton builds a polarized cellRong Li & Gregg G. GundersenNature Reviews Molecular Cell Biology 9, 860-873 (November 2008) | doi:10.1038/nrm2522

Beyond polymer polarity: how the cytoskeleton builds a polarized cell
Rong Li & Gregg G. GundersenNature Reviews Molecular Cell Biology 9, 860-873 (November 2008) | doi:10.1038/nrm2522