Dynamic genome architecture in the nuclear space: regulation of gene expression in three dimensions
Christian Lancto^t, Thierry Cheutin, Marion Cremer, Giacomo Cavalli and Thomas Cremer Nature Reviews Genetics 8, 104-115 (February 2007) | doi:10.1038/nrg2041
The regulation of gene expression is mediated by interactions between chromatin and protein complexes. The importance of where and when these interactions take place in the nucleus is currently a subject of intense investigation. Increasing evidence indicates that gene activation or silencing is often associated with repositioning of the locus relative to nuclear compartments and other genomic loci. At the same time, however, structural constraints impose limits on chromatin mobility. Understanding how the dynamic nature of the positioning of genetic material in the nuclear space and the higher-order architecture of the nucleus are integrated is therefore essential to our overall understanding of gene regulation.
Рис.1. | Organization of the mammalian cell nucleus.
Поразительным свойством ядерной архитектуры является существование самостоятельных структурных и функциональных компартментов (Fig. 1). Хорошо охарактеризованные ядерные структуры включают ядерную lamina, ядрышка, и , а также 1-4. Также увеличивается количество компонентов кухни, которая необходима для транскрипции или её репрессии, которая, как известно, обладает негомогенным распределением в нуклеоплазме5-7. На уровне собственно генома генетический материал уложен и упакован в ядре в структуры высшего порядка, которые скорее всего вносят вклад в регуляцию генной экспрессии8-12.
Необходимо понять потенциальное влияние ядерной архитектуры на функцию ядра, чтобы идентифицировать принципы, которые управляют пространственной организацией генома. Одним из классических примеров организации внутри ядра является разграничение между деконденсированным, транскрипционно активным эухроматином и более конденсированным неактивным гетерохроматином13. Сегодня известно, что индивидуальные хромосомы, занимают определенные позиции в ядре, обозначаемые как хромосомные территории14,15. Из-за различий в уровнях компакции разные сегменты хромосом воспринимают сложную организацию и топографию внутри своих хромосомных территорий16-18. Поляризованное внутриядерное распределение богатых генами и бедных генами сегментов хромосом, как было показано, эволюционно законсервированный принцип ядерной организации19,20. Регионы, богатые генами, стремятся быть ориентироваными в направлении внутренности ядра, тогда как бедные генами регионы ориентируются в направлении периферии (rev. Ref. 10).
Хотя хромосомы организованы как самостоятельные территории в интерфазном ядре, получены доказательства из разных биологических моделей - с использованием техники от классической генетики для молекулярных инструментов - показавшие, что хромосомы являются динамическими структурами и что индивидуальные хромосомные области могут быть репозиционированы в отношении как ядерных структур, таки и др. хромосомных регионов. Всё увеличиваются доказательства того, что перемещения геномных регионов в ядерном пространстве важны для регуляции генной экспрессии21. Недавние технологические успехи теперь позволяют крупно-масштабную идентификацию локусов по всему геному, а первые результаты подчеркивают потенциальное широко распространенное значение таких взаимодействий для собственно регуляции генов. Возможно, что существуют пространственные сети геномных локусов в ядре11, указывающие на существование ранее неизвестного уровня регуляции генов, который координирует экспрессию по всему геному.
Chromatin movement: extent and timing
Первые исследования на живых клетках показали, что позиции меченного хроматина и субхромосомных сегментов ограничиваются во время интерфазы внутри радиуса приблизительно в 0.5-1 μm - т.е., менее 1% объёма от обычного сферического ядра млекопитающих, которое имеет диаметр в 10 μm17,22-24. Исключения появляются во время ранней G1, когда часто наблюдаются движения на дальние расстояния более 2 μm24. На уровне одиночных геномных регионов исследования, которые используют флюоресцентно меченную , специфически связанную с гетерохроматиновыми повторяющимися блоками на Х хромосоме D. melanogaster подтверждают заключение, что подвижность индивидуальных локусов также может быть лучше всего описана принудительной диффузией. Однако, в этом случае радиус заключения (0.9 μm) составляет приблизительно половину радиуса ядер (2 μm), указывая тем самым на более значительную относительную подвижность хроматина в этой экспериментальной модели25.
Эти первые находки были дополнены некоторыми исследованиями, которые отслеживали положение флюоресцентно меченных, стабильно интегрированных массивов lac operator трансгенов в живых D. melanogaster, Arabidopsis thaliana и в линиях клеток человека26-29. Количественный time-lapse анализ выявил два разных типа движений хроматина в сперматоцитах D. melanogaster: быстрые, локальные перемещения (0.3-0.7 μm) и медленные перемещения на большие расстояния со средним радиусом 2.6 μm, что сравнимо с размерами индивидуальных хромосомных территорий в крупных ядрах такого типа клеток (10-17μm в диаметре)29. Картина флюоресцентно нагруженных локусов в живых клетках человека подтверждает находки, что средняя подвижность хроматина увеличивается во время ранней G1 (Ref. 30), как это наблюдалось для хромосомных субдоменов24. Более того, перемещения индивидуальных локусов зависят от их ядерной локализации, при этом периферические м ассоциированные с ядрышками трансгены достоверно менее мобильны, чем нуклеоплазматические26. Недавний анализ динамики хроматина в клетках оварий китайского хомячка был осуществлен со значительно более высоким пространственным (~20 nm) и временным (~30 ms) разрешением с использованием и 31. Траектории частиц обнаруживали периоды ограниченной диффузии, прерываемые почти каждую минуту быстрыми 'скачками' ~150 nm, которые были чувствительны к истощению клеточных АТФ и к температуре, указывая тем самым, что хроматин может подвергаться активным. возможно направленным движениям на уровне одиночного локуса.
Все эти наблюдения на живых клетках показывают, что дальнодействующие перемещения хроматина во время интерфазы происходят только во время относительно коротких временных окон, которые соответствуют у большинства клеток приблизительно первой трети G1. Как только это окно закрывается, движениях хроматина ограничиваются внутри небольших ядерных субдоменов. Размер таких субдоменов относительно размеря ядра варьирует в зависимости от вида, типа клеток и состояния клеточной дифференцировки. Хромосомные сегменты могут принимать нерегулярную форму внутри этих субдоменов, с многочисленными выпячиваниями и инвагинациями, образующимися в результате подвижности хроматина. Примеры выпячиваний специфических хромосомных сегментов из стрежневой территории хорошо документированы32-34. Сегодня имеются некоторые противоречия, из-за степени, с которой эти выпячивающиеся сегменты перемешиваются с хроматином из соседних хромосом15. Используя трехмерную (FISH) на тонких криосрезах, Branco and Pombo описали экстенсивное перемешивание хроматина35, в то время как Albiez et al. пришли к противоположному заключению на базе экспериментальных манипуляций с ядерной архитектурой32.
Важно установить, коррелируют ли движения хроматина, которые наблюдаются во время интерфазы, с изменениями в экспрессии генов. Этот вопрос адресуется imaging индивидуальных локусов в живых клетках. Т.к. современная техника гибридизации ДНК не может быть использована в живых клетках, то визуализация специфических геномных последовательностей in vivo нуждается во введении гетерологичных сайтов связывания для флюоресцентно меченных белков в или по соседству с интересующим локусом. Сегодня является наиболее широко используемой системой такого типа. Хотя физиологическая важность исследований крупных массивов тандемно повторяющихся генов ставится под сомнение, но эта техника дает важную информацию о взаимоотношениях между движением хроматина и регуляцией генов. Напр., движения хроматина были проанализированы во время активации транскрипции в клетках млекопитающих путем использования слияния acidic activation domain (AAD) вирусного белка VP16 и ДНК-связывающего домена lac репрессора в сочетании с интегрированным набором lac операторов36. Помеченный локус движется с периферии в направлении внутренности ядра после митоза как в контрольных, так и VP16-AAD-экспрессирующих живых клетках. Однако, он возвращается на периферию ядра в течение 3-4 ч в отсутствие VP16 AAD.
При дальнейшей обработке, рекрутирование VP16 AAD на lac массив сделали зависимым от rapamycin37, это позволило выбирать время активации транскрипции. Дальнодействующие перемещения локуса (со средним расстоянием в 2.6 μm) наблюдалось в 14 из 43 обработанных rapamycin клетках, в то время как движения, ограниченные внутри небольшого радиуса наблюдались в остальных 29 клетках38. В большинстве случаев движения были ориентированы в направлении внутренности ядра и зависели от ядерного актина и миозина, указывая на вовлечение активного процесса.
Movement with respect to nuclear landmarks
Movement with respect to the periphery or interior. Преимущественное перемещение локуса внутрь ядра при транскрипционной активации, которое описано выше, согласуется с результатами ряда предыдущих исследований, которые обнаружили занятие определенных положений генами в фиксированных клетках. Перемещение активированных генов во внутрь ядра было документировано для (immunoglobulin heavy chain) в детерминированных B лимфоцитах39, в T клетках40, в нейрональных клетках41 и в клетках аденокарциномы42. Было предположено, что периферия ядра является неактивным компартментом и что перемещение внутрь ядра необходимо для эффективной транскрипции. Однако, не всегда наблюдается строгая корреляция между движением прочь от периферии и активацией гена. Локус interferon-γ(Ifng), напр., выявляется на периферии ядра независимо от его транскрипционной активности40. Более того, недавно было показано, что хотя мышиный β-globin локус перемещается внутрь ядра во время эритроидной дифференцировки, но экспрессия гена действительно предшествует движению прочь от периферии43. Наконец, анализ 2-Mb сегмента, соотв. гену Mash1 показал, что вся область перемещается внутрь ядра в нейрональных клетках, экспрессирующих Mash1, даже если некоторые из генов в этой области не экспрессируются в этом типе клеток41. Это согласуется с идеей, что статус транскрипции может не зависеть от положения относительно периферии ядра.
Недавние находки на дрожжах ещё больше осложнили наше понимание взаимоотношений между активацией транскрипции и расположением гена по отношению к периферии ядра. У Saccharomyces cerevisiae, этот регион содержит компартменты молчания44, но также и активированные компартменты. В самом деле, ядерные поры являются наиболее важными местами транскрипции у этого вида и анализ по всему геному показал, что белки, ассоциированные с ядерными порами, соединяются преимущественно с активными генами45,46. Активация транскрипции часто сопровождается видимым перемещением генов в противоположном направлении тому, что наблюдается в клетках млекопитающих - т.е. из внутренности ядра к периферии47,48. Недавно наблюдения на живых клетках флюоресцентно меченных локусов в дрожжевых клетках показали, что перемещение генов ограничено пристеночной к ядерной оболочке областью при активации транскрипции49-51. Анализ дрожжевых мутантов показал, что это ограничение диффузии активных генов зависит от их динамической ассоциации с компонентами ядерных пор, эта находка согласуется с идеей, что эффективность транскрипции может быть увеличена путем прикрепления хроматина к месту экспорта мРНК ('gene gating')52.
Хотя возможно, что эта модель приложима к субнабору генов млекопитающих, но вряд ли возможно, что фильтрация гена (gene gating) может объяснить регуляцию транскриптома млекопитающих в целом. В самом деле, хотя хроматин и способен зондировать весь ядерный объем у дрожжей благодаря малым размерам органелл, он ограничен значительно меньшим объемом в крупных ядрах клеток млекопитающих, это предупреждает ассоциацию с ядерными порами для большинства генов. Это отличие подчеркивает важную роль структурных ограничений, которые сдерживают подвижность хроматина при такой организации ядра. Присутствие больших количеств гетерохроматина, как полагают, создает др. форму структурного ограничения, которая влияет на экспрессию генов в клетках млекопитающих.
Movement with respect to heterochromatin. Несколько исследований описали корреляцию между молчанием генов и внутриядерным положением вблизи конституитивного гетерохроматина в клетках млекопитающих. Было предположено, что такого типа репрессия транскрипции может быть объяснена конкуренцией между гетерохроматиновыми белками и активаторами транскрипции на локусах мишенях53 или компакцией хроматина, которая обусловлена ремоделирующими комплексами, ассоциированные с гетерохроматином54. Анализ дифференцирующихся клеток гематопоэтического клона показал, что активация генов часто ассоциирует с перемещением локуса прочь от гетерохроматинового компартмента40,55 и наоборот, молчание генов коррелирует с перемещением локуса к гетерохроматину56.
Сходные корреляции наблюдаются в хорошо изученном случае у D. melanogaster, у которых хромосомные инверсии перемещают гетерохроматиновый блок приблизительно на 2 Mb в локус, который расположен рядом с дистальным концом хромосомы 2. Мутантный аллель, bwD, вызывает доминантный репрессивный эффект на гомологичный дикого типа аллель brown, приводя к экспрессии в менее чем 2% клетках в глазу. И мутантный и дикого типа аллели оказываются более часто ассоциированными в центромерным гетерохроматином в ядрах клеток, которые несут перестройку, чем в клетках дикого типа57,58. Оценивая на базе cell-by-cellстатус транскрипции трех др. генов, которыя являются предметом мозаичных эффектов положения, Harmon and Sedat установили строгую позитивную корреляцию между молчанием гена и пространственной близостью к гетерохроматину в ядре59. Расстояния между каждым из локусов и центромерным гетерохроматином были не только меньше среднего в не экспрессирующих клетках, но и также были менее вариабельными. Это уменьшение вариабельности интерпретируется так, что молчащие локусы часто создают стабильные и персистирующие взаимодействия с гетерохроматином, тогда как активные локусы могут быть привязаны более рыхло в ядре.
Сходные наблюдения, которые связаны с перемещением локусов относительно периферии ядра, показывают, что хромосомный контекст, по-видимому, является важным детерминантом ассоциации между специфическими локусами и гетерохроматином. Это было продемонстрировано в исследовании локусов человеческого b 60. В лимфоцитах, в которых оба локуса молчат, β-globin локус, но не α-globin локус локализуется вблизи центромерного гетерохроматина. Возможным объяснением этого наблюдения является то, что два локуса располагаются в областях генома, которые отличаются по важным аспектам: α-globin локус расположен в рано реплицирующейся субтеломерной области, которая содержит гены, экспрессирующиеся на высоком уровне и широко, тогда как β-globin кластер вставлен в поздно реплицирующийся AT-богатый регион, который содержит гены, обнаруживающие ткане-специфические паттерны экспрессии. Возможно, что отсутствие ассоциации между неактивным α-globin локусом и гетерохроматином отражает потребность соседних генов быть экспрессированными, в таком случае это может быть вызывано доминантным эффектом на расположение целой геномной области вдали от гетерохроматина.
Integrating spatial and temporal aspects
Сегодня неясно на какой стадии процесса дифференцировки устанавливаются взаимодействия с гетерохроматином. Важное указание получено благодаря наблюдению, что блокирование развития личинок D. melanogaster предваряет терминальную дифференцировку, но не предупреждает ассоциацию между локусом bwD и гетерохроматином61. Сходным образом. ассоциация др. variegating локусов м гетерохроматином всё ещё выявляется в арестованных на ст. G2 клетках глазных имагинальных дисков59. Интересно, что предыдущие работы показали, что взаимодействие между bwD и гетерохроматином нарушается в начале S фазы и д. быть восстановлено во время G1 (Ref. 62). Отсюда было предположено, что в делящихся клетках, которые переходят к терминальному дифференцированному состоянию, длина G1 скорее, чем точное состояние дифференцировки, является критическим фактором в установлении взаимодействий между специфическими локусами и гетерохроматином. Согласно этой модели, чем более длительная продолжительность времени, которое локус проводит в G1, исследуя ядерное пространство, тем более высокая вероятность, что он натолкнется на центромерный гетерохроматин и осуществит стабильный контакт с этой структурой59,61.
После выхода из клеточного цикла временные ограничения на перемещения хроматина, такие как длина G1, могут быть замещены более существенными структурными ограничениями. В глазных имагинальных дисках D. melanogaster движения хроматина были обнаружены более ограниченными в дифференцированных, по сравнению с недифференцированными клетками61, указывая тем самым, что дифференцировка сопровождается изменениями общей мобильности гетерохроматина, возможно в результате усиления связей с ядерными структурами или изменений в объеме ядра и уровнях компакции хроматина.
Успехи в imaging живых, дифференцированных клеток д. быть важными для понимания, как пространственные и временные аспекты перемещений хроматина комбинируются, чтобы активировать и поддерживать программы экспрессии генов. специфичных для определенного типа клеток. Очевидно, что митозы открывают окно благоприятных возможностей для изменений конструкции хроматина высшего порядка, которые могут быть необходимы для клеточной дифференцировки63 и как обсуждалось выше, взаимодействия, которые устанавливаются во время или вскоре после митозов могут стабилизироваться позднее в клеточном цикле. С др. стороны, сообщения об обширной перестройке центромерного гетерохроматина в пост-митотических клетках64-67 указывают на то, что такие клетки сохраняют способность формировать новые конфигурации хроматина. Следовательно, индивидуальные геномные локусы обладают благоприятными возможностями передвигаться значительно во время как пролиферативной фазы, так и терминальной стадии процесса дифференцировки. Такие движения могут способствовать не только перемещению локусов относительно гетерохроматина, и др. компартментов ядра, но также встрече со специфическими геномными областями в ядре. Эти специфические внутри- и межхромосомные ассоциации между локусами д. вносить вклад в установление паттернов экспрессии генов, специфичных для типов клеток.
Nuclear architecture and gene-gene interactions
Пространственная ко-локализация генных локусов, которые расположены на разных хромосомах, и из удаленных сайтов внутри хромосомы, является одним из удивительных примеров трехмерной организации генома (Fig. 2). Из-за низкой вероятности, что удаленные локусы будут ко-локализоваться случайно в ядре, обнаружение таких 'gene kissing' (генных поцелуев) в большой фракции ядер рассматривается как высоко значимое.
Gene kissing and transcriptional silencing. Одним из хорошо задокументированных случаев gene kissing является функция белков (PcG), репрессоров транскрипции, которые способны поддерживать память о состоянии молчания гена в чреде клеточных делений68,69. Репрессия транскрипции достигается путем соединения белков PcG с цис-действующими PcG response elements (PREs). У D. melanogaster, инсерция 3.6 kb PRE-содержащей регуляторной последовательности Fab7 в Х хромосому ведет к variegated репрессии соседних генов, эффект, которые наиболее выражен у гомозиготных самок. Т.к. гомологичные хромосомы спарены в соматических клетках двукрылых, феномен был обозначен как чувствительная к спариванию репрессия. Неожиданно, репрессия, которая обеспечивалась трансгеном Fab7 оказалась зависимой от присутствия эндогенного Fab7 элемента в комплексе bithorax, локусе, который локализован на правом плече хромосомы 3 (Ref. 70). Трехмерный FISH показал, что эти два локуса ко-локализуются в 23% и 43% ядер у эмбрионов самок и личинок самок. соотв. Присутствие Fab7 было достаточным, чтобы предоставить хромосомным сайтам способность взаимодействовать в транс-положении, чтоб было продемонстрировано тем фактом, что Fab7 элемент, который вставлен в левое плечо хромосомы 2, может ассоциировать с эндогенным Fab7 элементом в комплексе bithorax, или с др. трансгенным элементом Fab7 на хромосоме X. Пространственная ассоциация между локусами не выявляется на Polycomb нулевом фоне. Т.к. белки PcG, как известно, компартментализованы в ядре71,72, то эти данные ведут к предположению, что "...endogenous PcG target genes may undergo physical associations at nuclear PcG bodies dedicated to their regulation."70 Др. PcG элемент мишень, Mcp, как было установлено, также способен управлять межхромосомными ассоциациями ткане-специфическим способом, указывая тем самым, что это свойство широко распространено среди PcG target elements73.
Важность динамических межхромосомных взаимодействий в замалчивании транскрипции крупных геномных регионов продемонстрирована кроме того временным спариванием (XIC) в дифференцирующихся embryonic stem (ES) клетках дифференцирующихся эмбрионов74,75. Частоты XIC-XIC расстояний меньше, чем ~1-1.5 μm увеличиваются со времени и прежде экспрессии РНК, которая является самым ранним из известных цитологических маркеров Х инактивации. Ассоциация между XIC локусами устраняется в клеточных линиях, в которых Х инактивация осуществляется аномально, напр., у Tsix-/- мутантов. XIC спаривание не выявляется на поздних стадиях дифференцировки, указывая тем самым, что подобное межхромосомное взаимодействие временное и необходимо для инициации процесса инактивации, но не для поддержания состояния инактивации.
Gene kissing and transcriptional activation. Дальнодействующие взаимодействия между геномными областями также важны для активации генов. Напр., взаимодействия между locus control region (LCR) и нижестоящими регуляторными элементами в β-globin локусе управляют образованием 200-kb петли специфически в экспрессирующих клетках76. Взаимодействия между регуляторными элементами и генами мишенями, которые располагаются на др. хромосомах, также могут происходить, как было недавно показано, когда энхансерный элемент, который присутствует в единственной копии в геноме контактирует только с одним из примерно 1,300 генов обонятельных рецепторов (OR) в любом данном сенсорном нейроне у мышей77. Наблюдение, что экспрессия OR осуществляется специфически со взаимодействующего аллеля, подчеркивает функциональное значение этого взаимодействия.
Также дальнодействующие взаимодействия между регуляторными элементами и генами, которые находятся под их контролем, др. пример функциональной важности событий gene-kissing для транскрипционной активации. Недавно было предположено, что гены д. ассоциировать с 'transcription factories' - фокусами, которые обогащены RNA polymerase II - чтобы эффективно транскрибироваться и что благодаря ограниченному количеству факторий, "...many genes are obliged to seek out and share the same factory."78 При комбинации и иммуноокрашивания, ряд активно транскрибируемых генов, как было показано, ассоциирует с тем же самым фокусом RNA polymerase II в эритроидных предшественниках у мышей78. Аллели генов, транскрибируемых из субтеломерной области хромосомы 7 (таких как Eraf, Uros, Igf2, Kcnq1ot1) часто ко-локализуются в таких фокусах с активными аллелями β-globin, которые располагаются на расстоянии в 24-39 Mb на той же самой хромосоме.
Успехи нашей способности анализировать трехмерные взаимодействия между генами получены благодаря chromosome conformation capture (3C) методу, который предоставил дальнейшие примеры корреляции событий gene-kissing с транскрипционной активностью. Этот метод измеряет образование поперечных связей между хроматиновыми сегментами после фиксации формальдегидом целых клеток или изолированных ядер79. Частота поперечных связей, которая выше контрольного уровня указывает на пространственное соприкосновение, хотя необходимость в соотв. контроле была недавно подчеркнута80. В дополнение к наивысшему разрешению светового микроскопа, этот биохимический подход фиксирует трехмерные взаимодействия в значительно большем количестве клеток.
Используя этот метод, было показано, что ген interferon-γ, который располагается на хромосоме 10 мыши, взаимодействует с частями локуса TH2 cytokine гена, который располагается на 11 хромосоме, в нативных Т лимфоцитах81. Это межхромосомное взаимодействие зависит от присутствия (HS) на 3' конце в локусе TH2 cytokine gene. Делеция HS на хромосоме 11 влияет на экспрессию Ifng на хромосоме 10, указывая на существование регуляторного взаимодействия между целующимися локусами. Т.к. Ifng и гены TH2 локуса быстро и скоординированно экспрессируются на низких уровнях после стимуляции in vitro нативных Т лимфоцитов, то было предположено, что взаимодействующие локусы формируют 'poised chromatin hub', который ответственен за раннюю активацию генов. Авт. полагают, что этот узел (hub) может рекрутировать ремоделирующие комплексы или гистоновые acetyltransferases, чтобы сформировать позитивные условия для ранней экспрессии цитокинов.
3C техника была использована для оценки кандидатов на взаимодействия, но, из-за ограниченной производительности и необходимости создания сиквенс-специфических праймеров, оказалось невозможным идентифицировать неизвестные последовательности, которые соединяются с интересующим локусом. Для преодоления этого ограничения сиквенс-специфическая ступень PCR в 3C технике была замещена с помощью recircularization матрицы и обратной PCR ступени. Этот новый подход был использован для поиска потенциальных взаимодействий между специфическими геномными областями и отсальной частью генома. Напр., использя этот метод пространственного окружения мышиного ген был исследован во время дифференцировки ES клеток в отношении др. геномных областей82. Анализ секвенирования более 2,000 PCR фрагментов показал, что большинство взаимосвязанных партнеров располагается внутри приблизительно 2 Mb от гена Hoxb1 и что пропорция межхромосомных взаимодействий увеличивается во время дифференцировки. Это согласуется с предыдущим сообщением, в котором был использован FISH, и который показал, что во время дифференцировки ES клеток локус Hoxb1 перемещается прочь от своей хромосомной территории83.
Сходный метод, названный 4C (Box 1) был использован для характеристики пространственной геномной среды локуса β-globin мышей84. Однако, вместо секвенирования amplicons, которые генерировались в этом исследовании, они были гибридизированы с микромассивами, которые содержали зонды для всех потенциальных сайтов партнеров на семи хромосомах, чтобы получить полную картину партнеров по поперечному связыванию. Большинство локусов, которые взаимодействуют с локусом β-globin, было обнаружено в цис положении на хромосоме 7 и были идентифицированы кластеры из 20-50 hits, часто имеющих тенденцию располагаться на расстоянии megabases от локуса β-globin. Интересно, что взаимодействующие партнеры были целиком отличны в клетках плодной печени, которые экспрессируют этот ген и клетками головного мозга плода, которые его не экспрессируют. В печени плода 80% локусов, которые взаимодействуют с активным локусом β-globin, содержат один или более активных генов, 74% из которых не были специфичными для печени; напротив, 87% из взаимодействующих локусов в клетках головного мозга не обнаруживали обнаружимой активности. На этом основании этих паттернов авт. предположили, что хромосома 7 упаковывается в области активного и неактивного хроматина. Межгенные взаимодействия могут, следовательно, управляться главным образом свойствами окружающего хроматина (напр., транскрипционная активность, гистоновый код и генное содержимое) скорее, чем специфической функцией гена, которая общая для взаимодействующих партнеров. В том же исследовании были проанализированы повсеместно экспрессируемый ген , который располагается в кластере, богатом генами, который содержит в основном гены домашнего хозяйства. Для этого локуса были выявлены очень сходные взаимодействия в клетках печники и головного мозга плодов. Как и в случае активного β-globin локуса, большинство цис-взаимодействующих регионов (~70%) содержат, по крайней мере, один активно транскрибируемый ген, который соответствует межгенным взаимодействиям, детерминируется с помощью хромосомного контекста скорее, чем специфических генных функций. Т.к. FISH анализ показал, что ген Rad23a располагается по краю (82% сигналов) или вне (14% сигналов) его хромосомной территории, то возможность, что этот ген контактирует с регионами др. хромосом, также была исследована и было идентифицировано 68 взаимодействующих регионов из др. хромосом, два из которых были оценены с помощью cryo-FISH. Подобно тому, что было найдено для взаимодействий в цис-положении, многие геномные области, которые взаимодействуют в транс-положении обнаруживают высокую плотность генов.
Предоминирование цис взаимодействий среди тех, что идентифицированы с помощью 4C иследований, согласуется с предыдущей моделью ядерной архитектуры, согласно которой территориальная организация хромосом представляет главное препятствие, которое накладывается на потенциальные взаимодействия иежду сегментами хроматина (Fig. 3). В согласии с этой моделью и то, что 4C подход также показал, что гены, которые экспозируются на поверхности хромосомной территории also (Rad23a), контактируют с генами, которые расположены на др. хромосомах, в то время как гены, которые как известно из предыдущих исследований, находятся на своей территории (β-globin мыши)60 осуществляют мало межхромосомных контактов. Это указывает на то, что расположение локуса внутри территории является важным детерминантом транс взаимодействий. Интересно, что межхромосомные взаимодействия, которые были выявлены в случае Rad23a, преимущественно используют регионы с повышенной плотностью генов. Это наблюдение указывает на то, что образование кластеров gene-dense хромосом или хромосомных сегментов во внутренности ядра16,20,85 может служить для облегчения взаимодействий между областями генома, которые расположены на разных хромосомах (Fig. 3).
Gene kissing and epigenetic regulatory networks. Недавно, используя 3C и 4C методологии было показано существование возможности, что дальнодействующие взаимодействия хроматина участвуют в эпигенетической регуляции экспрессии генов, так что эпигенетические регуляторные механизмы, которые затрагивают данный ген могут распространяться на его соседей в ядерном пространстве. Аллель-специфическая экспрессия соседних Igf2 и генов на хромосоме 7, как полагают, результат результат дифференциальных взаимодействий между (ICR), которая располагается выше гена H19, и последовательностью вблизи гена Igf2. На отцовском аллеле взаимодействия между геном Igf2 и метилированным ICR приводит ген Igf2 в тесную близость с энхансерными элементами и ведет к экспрессии Igf2 с этого аллеля86. На материнском аллеле, однако, физический контакт между двумя последовательностями, фланкирующими Igf2 ген (MAR3 и DMR1), и неметилированным ICR ведет к образованию генной петли, которая предупреждает его ассоциацию с энхансерными элементами и, следовательно, ведет к молчанию Igf2 гена на этом аллеле87. Образование такой трехсоставной структуры на материнском аллеле, как было установлено, зависит от соединения , zinc-finger белка, как с DMR1, так и ICR. Поразительно, мутации CTCF сайта связывания на материнском ICR, которые ведут к метилированию этой последовательности, также устраняют связывание белка с материнской DMR1 и ведут к de novo метилированию DMR1. Это создает возможность, что эпигенетические изменения могут быть скоординированы посредством дальнодействующих взаимодействий хроматина.
Чтобы определить, может ли взаимодействовать H19 ICR с и возможно регулировать гены, иные, чем Igf2, две группы использовали 4C по отношению к H19 ICR последовательностям мыши в качестве затравки88,89. Ling et al. идентифицировали только три взаимодействующие последовательности в линии клеток фибробластов из костного мозга, одна из которых располагается между Wsb1 и Nf1 генами на хромосоме 11, в то время как Zhao et al. идентифицировали 114 партнеров в печени новорожденных, распределенных по всем хромосомам, но с очевидной избыточной презентацией последовательностей с хромосомы 7, которая содержит H19 ICR. Обе группы сообщили, что взаимодействия в первую очередь затрагивают материнский не метилированный H19 ICR и показано с использованием 3D FISH анализа избранных партнеров, что интактные CTCF связывающие сайты необходимы для взаимодействий. Zhao et al. отметили, что 21 взаимодействующая последовательность (18%), представляют известные или предполагаемые импринтированные регионы. Более того, два клона были восстановлены внутри Osbp1Ia гена, который расположен 5' по отношению к импринтируемому гену Impact на хромосоме 18. Анализ с помощью 3C выявил, что материнский H19 ICR взаимодействует с дифференциально метилируемой областью . Влияние дальнодействующих взаимодействий на экспрессию генов было оценено в обоих исследованиях. Если взаимодействия оказывались нарушенными или за счет истощения CTCF88 или за счет мутирования CTCF связывающих сайтов в ICR89, то экспрессия генов или снижалась на 50% (Wsb1 или Nf1 и Impact) или увеличивалась в 2.5-раза (Osbp1Ia ген). Существование регуляторных взаимодействий между пространственно взаимодействующими локусами открывает новые горизонты в изучении регуляции генов. Это не только создает дополнительный уровень сложности в исследовании регуляторных элементов в геноме, но также подразумевает, что сама по себе мобильность хроматина, а, следовательно, и гарантия дальнодействующих межгенных взаимодействий, могут быть мишенью для регуляции. Возможность, что перемещение гена представляет собой способ распространения состояний хроматина по всей сети генов, необходимо еще исследовать.
The probabilistic nature and significance of gene-gene interactions. Хромосомные территории занимают преимущественные, но не абсолютные позиции в ядре14, подчеркивается вероятностная природа такого позиционирования90. Первоначальные результаты показали, что генные поцелуи также следуют законам вероятности. В предыдущих примерах, ко-локализация локусов редко наблюдалась более чем в 30-50% ядер внутри клеточной популяции70,77,88 и большинство ядер, которые были оценены как позитивные с помощью трехмерного FISH подхода, обладали только одной парой ко-локализующихся аллелей78,81. В одном исследовании, в котором поцелуй генов был связан с регуляцией экспрессии генов, эта гетерогенность наблюдалась даже когда только активные гены, выявляемые с помощью RNA FISH, включались в анализ78. Этот результат указывает на то, что наблюдаемая гетерогенность не может быть приписана исключительно тому факту, что экспрессия не происходит одновременно вол всей клеточной популяции и на обоих аллелях. Результаты полученные с использованием 4C техники, которая показала, что интересующий локус может взаимодействовать с различными областями генома как в цис-, так и транс-положении, также подтвердили идею вероятностных дальнодействующих взаимодействий хроматина84,88,89. Динамическая природа хроматина может быть особенно уместной с точки зрения того факта, что крупные фракции генома, по-видимому, транскрибируются и являются объектом регуляции (Box 2).
Возникает вопрос о значении gene kissing в регуляции транскрипционной активности в свете вероятностной природы этих событий. Сегодня ответ таков, пока неясно является ли существование генных сетей в ядре действительной причиной активности генов, её следствием или просто отражает структурные ограничения на укладку хромосомных территорий. В пользу причинности говорит находка, что silencing мутации в одном гене могут влиять на экспрессию взаимодействующих генов на др. хромосомах81,89. С др. стороны, работа Brown et al. по-видимому, подтверждает альтернативное объяснение. Эти авт. установили, что пропорция активных α-globin и β -globin аллелей человека, которые целуются др. с др. возрастает по мере дифференцировки эритробластов, но они интерпретировали это наблюдение как следствие клеточной дифференцировки скорее, чем предварительным условием для увеличения транскрипции91. Боле того, они не обнаружили ассоциации между активными globin аллелями в клетках мышей и поэтому полагали, что gene kissing не является существенным для эффективной транскрипции и что хромосомный контекст, который отличен для глобиновых локусов у мышей и человека, возможно играет важную роль в детерминации частоты gene kissing. Анаолиз др. геномных областей д. помочь открыть соотв. влияния хромосомного контекста и транскрипционной ко-регуляции в управлении gene kissing.
Conclusions and perspectives
Mounting evidence points to an important relationship between the repositioning of the genetic material in the nucleus and the regulation of gene expression. One important set of questions for future investigation relate to the molecular mechanisms that underlie the mobility of chromatin in some situations and its immobilization in others. These are aspects that we have only touched on in this Review, although a brief overview of what is known so far about such mechanisms is given in Box 3.
Much remains to be understood about the integration of nuclear architecture and the dynamic nature of chromatin with the cell-type specific orchestration of gene expression and silencing. The view that emerges is one of chromatin being partitioned, both at the chromosome and nuclear levels, into regions that are endowed with the ability to move to different extents. A causal link between chromatin mobility and gene expression remains to be firmly established. However, insights have emerged that indicate possible mechanistic links. Gene silencing at the nuclear periphery and in the vicinity of heterochromatin could be the result of decreased chromatin mobility and, conversely, gene activation and sustained transcription might be associated with long-range movement of chromatin, as was shown recently for a transgenic locus38. In such a model, regulatory complexes could work by freeing chromatin from tethering, possibly at a given time of the cell cycle or during postmitotic terminal cell differentiation. This might increase chromatin mobility and allow new interactions to form, both between different regions of chromatin and between chromatin and nuclear compartments. Another set of regulatory complexes could then be responsible for stabilizing the subset of interactions that lead to proper gene expression.
The compartmentalized nature of the nucleus raises the question of how compartments are established and maintained. Two non-exclusive models have been proposed to account for the fact that metabolic activities are spatially organized in the nucleus: compartments could correspond to pre-existing structures, or they could be built up as a result of the self-assembly properties of macromolecular complexes that are engaged in gene regulation (Fig. 4). Although the observation of profound changes in nuclear organization after inhibition of transcription and rapidly exchanging pools of proteins within nuclear compartments would seem to support the view of the nucleus as a self-organizing entity in which regulatory processes drive the interactions between functional components92, the issue remains largely unresolved and should continue to fuel debate in the coming years.
Biochemical and genetic approaches are already at hand to dissect the molecular mechanisms that are involved in gene repositioning and, more generally, in nuclear compartmentalization93,94 (Box 1). At the same time, living-cell microscopy should continue to provide insights into chromatin mobility. However, the experimental manipulation of nuclear architecture remains difficult, raising the question of how the functional relevance of changes in nuclear organization can be investigated. Evolutionary conservation has always been considered a strong indication of functional relevance. The observation that radial positioning of chromosomes according to gene density is an evolutionarily conserved feature of the interphase nucleus indicates an important role for this pattern of chromatin organization19. Now that a growing number of genome sequences are becoming available, comparative studies of nuclear architecture are needed to distinguish between sequence-dependent and epigenetic determinants of chromatin organization and dynamics. Systematic phylogenetic analyses could also prove useful in determining the influence of reshuffling of syntenic regions and chromosomal context on intranuclear gene positioning. This is best demonstrated by the case of the active alpha-globin and beta-globin loci, which spatially cluster in human but not in mouse erythroblasts91. The analysis of the cell nucleus using complementary approaches should lead to an integrated understanding of nuclear structure and function.
