Регуляторы Транскрипционных Шумов

The Primary Cilium as a Gravitational Force Transducer and a Regulator of Transcriptional Noise Stephen J. Moorman and Ardon Z. Shorr DEVELOPMENTAL DYNAMICS V.237, P.1955-1959, 2008
Circumstantial evidence has suggested that the primary cilium might function as a gravity sensor. Direct evidence of its gravity-sensing function has recently been provided by studies of rohon beard neurons. These neurons showed changes in the variability of gene expression levels that are linked to the cyclic changes in the Earth's gravitational field due to the Sun and Moon. These cyclic changes also cause the tides. Rohon beard neurons, after the primary cilia have been selectively destroyed, no longer show changes in gene expression variability linked to the cyclic changes in Earth's gravitational field. After the neurons regrow their primary cilia, the link between variability in gene expression levels and the Earth's changing gravitational field returns. This suggests two new functions for the primary cilia, detecting the cyclical changes in the Earth's gravitational field and transducing those changes into changes in the variability (stochastic nature) of gene expression. Рис. \| Functions of primary cilia	В последнее время мы изучали эффекты, вызванные микрогравитацией на экспрессию генов у эмбрионов рыбок данио. результаты этих экспериментов были настолько изменчивы и не предсказуемы для разных стадий развития и тканей, что мы начали рассматривать новую гипотезу. Первичные реснички функционируют как сенсоры гравитации, эта гипотеза объясняет почти, если не все накопленные результаты. первичная ресничка является филогенетически старой, недавно открытой вновь, почти повсеместной клеточной органеллой со специфическими сенсорными функциями в специфических типах клеток. первичная ресничка явлется сенсором тока в эпителиальных клетках почечных канальцев (see Pan et al., 2005) и ключевым модификатором пути передачи сигналов hedgehog (Corbit et al., 2005). Первичная ресничка. как полагают, действует также как тензометрический датчик для остеоцитов in vivo (Whitfield, 2003) и как молекулярный переключатель между каноническим и не-каноническими WNT путями (Otto et al., 2003). Кроме того, модифицированные первичные реснички являются ключевыми детерминантами лево-правосторонней асимметрии (Ferrante et al., 2006; Tamakoshi et al., 2006). Т. к. они являются филогенетически очень старыми клеточными органеллами, то разумно предположить, что первичные реснички могут обладать общей функцией во всех или большинстве типов клеток с ресничкой. Получены данные подтверждающие идею. что первичная ресничка может регулировать стохастическую природу генной экспрессии и это может быть общей функцией первичных ресничек. Т.к. все клетки нуждаются в регуляции стохастической природы генной экспрессии, то гравитационное поле Земли может предоставлять стимулы первичным ресничкам в тех клетках, где первичные реснички не приобрели некоторые др. функции, такие как восприятие деформирующих усилий (shear forces), ассоциированных с током жидкости. HEART AND BLOOD VESSEL PRIMARY CILIA Одним из первоначальных наблюдений стало то, что микрогравитация может вызывать достоверное увеличение генной экспрессии в развивающихся сердце и кровеносных сосудах (Shimada et al., 2005). первичные реснички были обнаружены в эндокардиальных клетках в развивающемся сердце кур преимущественно в клетках в области с низкими силами деформации (Van der Heiden et al., 2006). такая локализация, по-видимому, обусловлена активным ремоделированием сердца, которое происходит в областях с высокими силами деформации. Обычно для сердца, чтобы добавить эндокардиальные клетки, когда ремоделируются камеры, первичные реснички резорбируются в клетках, которые активно делятся (Alieva and Vorobjev, 2004). Если сердце рыбок данио сходно с сердцем кур в этом отношении, то первичные реснички эндокардиальных клеток д. резорбироваться, когда трубчатое сердце начинает ремоделироваться в дефинитивное предсердие и желудочки около 48 ч после оплодотворения. Временная рамка чувствительности к изменениям генной экспрессии, индуцированной микрогравитацией, совпадает с онтогенетическим периодом. когда первичные реснички присутствуют до периода моделирования сердечной трубки у эмбрионов рыбок данио. Мы недавно исследовали эффекты, стимулированные микрогравитацией, на экспрессию fli1 у эмбрионов рыбок данио. Fli1 является самым ранним известным маркером эндотелиальных клеток у рыбок данио (Kidd and Weinstein, 2003). Стимуляция микрогравитацией вызывает драматические изменения в экспрессии fli1:gfp в эндотелиальных клетках, но только до инициации кровотока через развивающиеся сосуды (Shimada et al., 2005). Это указывает на то, что или эндотелиальные клетки теряют свою чувствительность к стимулированной микрогравитации или что эффекты тока крови через кровеносные сосуды превосходят эффекты стимулированной микрогравитации. Т.к. эндотелиальные клетки in vitro и in vivo имеют первичные реснички (Iomini et al., 2004; Van der Heiden et al., 2007), то первичная ресничка на эндотелиальной клетке может начать функционировать как сенсор тока по кровеносному сосуду, что совпадает с изменением чувствительности к стимулированной микрогравитации. NOTOCHORD PRIMARY CILIA Развитие хорды у рыбок данио имеет период чувствительности к стимулированной микрогравитации, пик которой приходится на 24-72 ч после оплодотворения (Shimada et al., 2005). Это является периодом пика спонтанных контракций развивающихся сомитов. У эмбрионов рыбок данио хорда состоит из набора клеток, которые могут быть сравнены со столбиками монет, расположенными на боку. Каждая клетка имеет одиночную первичную ресничку, проецирующуюся от центра к поверхности "coin" (unpublished observation). Т.к. первичные реснички от многих типов клеток функционируют по типу датчика деформаций (Pan et al., 2005; Whitfield, 2003), то первичная ресничка на каждой клетке хорды д. быть идеально приспособлена для мониторинга искривлений хорды в ответ на силы, такие как гравитация или мышечные сокращения. Первичная ресничка непосредственно сцеплена с цитоскелетом посредством материнской центриоли (see Satir and Christensen, 2006). Если первичные реснички действуют как сенсоры тяжести в хорде, то не нагруженная хорда во время воздействия искусственной микрогравитации может обнаруживать более драматический эффект на цитоскелет во время того периода, когда хорда подвергается действию др. сил, таких как мышечные контракции. Эта идея подтверждается наблюдением, что индуцированное увеличение экспрессии β-actin:gfp в хорде более драматическое при искусственной microgravity во время онтогенетического периода, когда эмбрион является более "активным." HSP70 AND PRIMARY CILIA Протеом ресничек недавно стал доступным on-line (http://www.ciliaproteome.org/). Эта база данных предоставляет справочник репертуара белков, необходимых для биогенеза и функции ресничек у эукариот (Gherman et al., 2006). Из генов, которые были обнаружены у рабок данио только hsp70 присутствует в протеоме ресничек. Единственной тканью у эмбрионов рыбок данио, которая экспрессирует hsp70 в отсутствие каких-либо средовых стрессов, это развивающийся хрусталик. HSP70 , по-видимому, действует в хрусталике, чтобы предупредить хрусталиковые клетки от гибели, когда их ядра вступают на путь апоптоза (Ribeil et al., 2007). Т.к. искусственная microgravity не индуцирует экспрессии в какой-либо ткани эмбрионов рыбок данио помимо хрусталика, то искусственная microgravity не может рассматриваться как hsp70-связанный средовой фактор, вызывающий стресс. Однако искусственная microgravity вызывает увеличение экспрессии hsp70 в хрусталиках и это совпадает со снижением TUNEL-позитивных клеток в хрусталиках (Shimada and Moorman, 2006). Это подтверждает идею, что искусственная microgravity, вызывающая изменения в генной экспрессии, может обеспечиваться посредством эффектов на первичные реснички. ROHON BEARD NEURON PRIMARY CILIA Когда мы начали подозревать участие первичных ресничек в обеспечении эффектов искусственной микрогравитации на экспрессию генов, то мы были в затруднении объяснить, как первичные реснички могут участвовать в изменениях, наблюдаемых в rohon beard нейронах. Rohon beard нейроны являются первичными сенсорными нейронами у рыбок данио до развития клеток ганглиев дорсальных корешков. Rohon beard нейроны являются единственным ростро-каудальным рядом крупных нейронов в дорсальной части спинного мозга на каждой стороне. Каждый rohon beard нейрон имеет одиночный аксон, который проецируется периферически, чтобы посегментно иннервировать ткани, которые в конечном итоге будут иннервированы клетками ганглиев дорсальных корешков. Наши предыдущие данные показали, что обнаруживается выраженное увеличение экспрессии β-actin: gfp в rohon beard нейронах, подвергшихся искусственной микрогравитации между 24 и 72 hr (Shimada et al., 2005). Когда формируются ганглии дорсальных корешков, то rohon beard нейроны дегенерируют. Этот процесс дегенерации начинается 72-80 ч после оплодотворения. Эта временная рамка совпадает с концом периода чувствительности к индуцированным с помощью simulated-microgravity изменениям в экспрессии генов в Rohon Beard нейронов, но не затрагивает первичных ресничек. Данные по rohon beard нейронам согласуются с измерениями уровней экспрессии β-actin:gfp в одиночных rohon beard нейронах в каждом из 4-х сегментов спинного мозга у 24 эмбрионов в каждой группе. Не было обнаружено достоверных отличий между любыми из коэффициентов изменчивости для любой из групп. Данные были повторно проанализированы отдельно подсчитанных коэффициентов изменчивости для 4 rohon beard нейронов в каждом эмбрионе. При такого типа анализе коэффициенты изменчивости для simulated-microgravity эмбрионов оказались достоверно выше, чем для др. эмбрионов. Это указывает на то, что уровни экспрессии β-actin: gfp в rohon beard нейронах значительно более вариабельны, когда эмбрионы подвергаются действию искусственной микрогравитации. Этот повторный анализ данных по rohon beard нейронам оказывался боле чувствительным, если первичная ресничка могла быть сцеплена с путями, которые регулируют транскрипционные шумы. В целом, обсуждаемые данные согласуются с выполняемой первичными ресничками ролью в обеспечении вызываемых simulated-microgravity изменений в генной экспрессии, наблюдаемых у эмбрионов рыбок данио и подтверждают гипотезу, что первичная ресничка может действовать как передатчик гравитационной силы в клетках позвоночных. Необходимо подчеркнуть, что эти данные не доказывают, что первичная ресничка используется. Необходимо также подчеркнуть, что эффекты микрогравитации или искусственной микрогравитации имеют незначительное, если вообще имеют какое-то значение к жизни на Земле. Поэтому, т.к. первичная ресничка может обнаруживать драматические изменения гравитационных сил, ассоциированных с переходом от гравитации и микрогравитации, то не следует подозревать, что первичная ресничка участвует в мониторинге гравитационного поля Земли. Однако гравитационное поле Земли не является постоянным, оно подвергается очень малым циклическим изменениям величин из-за влияния Солнца и Луны. Эти изменения обычно имеют величины 2 X 10^-6 m/s² повсюду на поверхности Земли. Эти изменения имеют единственный наблюдаемый эффект приливы и отливы. Гравитационное поле Земли является наиболее слабым при наивысшем приливе и гравитационное поле Земли является наиболее сильным при отливе с периодом одного цикла прилива около 12 ч и 25 мин. Если пердположить, что обычно клетки имеют диаметр10 X 10^-6 м, то можно подсчитать приблизительную деформирующую силу, которая может быть приложена к первичной ресничке клетки циклическими изменениями гравитационного поля Земли, обычно клетка - 10-µ.m lbfvtnhjv: 4/3 Π r³ = 523.6 µm³ = 523.6 µg массу (предполагается, что клетка имеет ту же самую плотность что и вода): 523.6 X 10^-6 g = 523.6 X 10^-9 kg mass: Force = mass * acceleration, Force = 523.6 X 10^-9 kg * 2 X 10^-6 m/s² = 1,047.2 X 10^-15 (kg * m²)/s² Newton является велечиной силы, необходимой, чтобы ускорить тело с массой sd 1 кг при скорости в 1 м в сек в квадрате. Алгебраически: IN = 1(kg * m²)/s² Т.о., типичная клетка будет осуществлять до 1,047 X 10^-15 N на свою первичную ресничку из-за относительных позиций Земли, Солнца и Луны, в зависимости от ориентации клетки в поле гравитации по отношению к её первичной ресничке. Интересно, что одиночная первичная ресничка способна определить деформирующую силу (shear force) в 5.2 X 10^-15 N (Resnick and Hopfer, 2007). Это указывает на то, что первичная ресничка является достаточно чувствительной для восприятия циклических изменений гравитационного поля Земли. PRIMARY CILIA AS GRAVITY SENSORS Недавно нам удалось продемонстрировать, что rohon beard нейроны в развивающемся спинном мозге рыбок данио обнаруживают изменения стохастической природы их генной экспрессии, связанными с малыми циклическими изменениями гравитационного поля Земли (Shorr and Moorman; unpublished data). Короче, мы измерили экспрессию neurogenin-3.1:gfp (ngn3.1:gfp) в rohon beard нейронах у доного и того эмбриона во время дня, когда высокий прилив в Raritan River в New Brunswick, NJ (место в 3 милях от лаб) и затем во время дня с низким приливом во время двух последовательных дней. Средний коэффициент вариации экспрессии ngn3.1:gfp в rohon beard нейронах, пришедшийся на высокий прилив был достоверно выше, чем средний коэффициент вариации тех же самых rohon beard нейронов во время отлива, тогода как из средние уровни экспрессии были теми же самыми во время прилива и отлива. Это указывает на то, что экспрессия ngn3.1:gfp в rohon beard нейронах более вариабельна, когда гравитационное поле Земли наиболее слабое (прилив), чем когда гравитационное поле Земли наиболее сильное (отлив). "Gravity clamping" эмбрионов при 1.1 g во время прилива обусловливает изменчивость генной экспрессии, оказывающееся той же самой при приливе, что и при отливе, подтверждая идею, что это является изменением гравитационной силы, которое вызывает обычное изменение вариабельности генной экспрессии при приливе и отливе. Чтобы определить опосредует ли первичная ресничка изменения в вариабельности генной экспрессии, мы избирательно разрушали первичные реснички за счет инкубации эмбрионов в chloral hydrate (Praetorius and Spring, 2003; Praeto-rius et al., 2004). После такого воздействия вариабельность экспрессии ngn3.1:gfp была одинаково высокой при приливе и отливе. Когда клетки удаляли из chloral hydrate, то они отращивали свои первичные реснички. В результате вариабельность экспрессии ngn3.1:gfp снова была достоверно выше при приливе, чем при отливе. Эти данные подтверждают, что первичная ресничка ответственна of передачу циклических изменений гравитационного поля Земли а изменения уровней вариабельности генной экспрессии в rohon beard нейронах спинного мозга рыбок данио. Почему rohon beard нейроны д. нуждаться в механизме регуляции вариабельности уровней генной экспрессии и являются ли эти результаты уникальными для rohon beard нейронов? Во время развития rohon beard нейроны специфицируются и поддерживаются как одиночный ростро-каудальный ряд клеток на каждой из сторон дорсальной части спинного мозга эмбрионов рыбок данио. Чтобы спецификация и поддержание происходили надлежащим образом презумптивные rohon beard нейроны д. быть способны аккуратно и воспроизводимо отвечать на специфические комбинации средовых факторов. Если презумптивные rohon beard нейроны не смогут четко регулировать уровни вариабельности генной экспрессии во время спецификации, то они не смогут развиться как одиночный ряд клеток, но будут развиваться как более диффузная популяция в дорсальной части спинного мозга. Способность тонко регулировать стохастическую природу генной экспрессии не является уникальной для rohon beard нейронов. Все клетки нуждаются в регуляции вариабельности уровней генной экспрессии, чтобы быть способны аккуратно и воспроизводимо реагировать на своё внеклеточное окружение. Существует цена повышенной аккуратности и некоторые группы клеток ммогут быть способны успешно противостоять транскрипционным шумам (variability), в то время как др.могут обладать низкой толерантностью к шумам. Напр, удержание транскрипционных шумов на низком уровне особенно важно во время развития, когда комбинации внеклеточных сигналов специфицируют фенотипы клеток, тканей и органов по всему эмбриону. Напр., градиент Shh, высвобождаемого хордой и донной пластинкой, в комбинации с BMP, высвобождаемого верхней пластинкой, и ретиноевой кислотой из сомитов. специфицируют дорсо-вентральные качественные способности нейронов с развивающемся спинном мозге (Wilson and Maden, 2005). В отсутствие способности тонко регулировать уровни генной экспрессии в ответ на различные пороги концентраций морфогенов клеточные реакции станут довольно простыми on-off переключениями, делающими значительно более трудным спецификацию более чем 8 типов клеток, обнаруживаемых вдоль дорсо-вентральной оси спинного мозга. Повсеместная природа первичных ресничек подтверждает, что использование первичных ресничек для регуляции стохастической природы генной экспрессии может быть общим для всех клеток позвоночных. WNT PATHWAYS MIGHT LINK PRIMARY CILIA TO TRANSCRIPTIONAL NOISE На уровне одиночной клетки транскрипция индивидуальных генов связана с шумами, случайными молекулярными флюктуациями, которые вызывают вариабельность уровней генной экспрессии в клеточной популяции. Источники шума, которые ассоциированы с генной экспрессией включают: небольшое количество молекул, которые участвуют в определенных биохимических реакциях в клеточных пространствах, стохастическая природа молекулярных взаимодействий, которые лежат в основе химических реакций и врожденная эффективность процесстов транскрипции и трансляции. Большинство исследований шумов, которые связаны с экспрессией гена, сфокусированы на транскрипции и принято отличать шумы, которые проиходят в результате взаимодействия между полимеразами и ДНК (intrinsic noise), и шумы, продуцируемые др. влияниями, такими как случайные флюктуации в питательных веществах, клеточных делений или регуляторных импульсов к аппарату транскрипции (extrinsic noise) (Elowitz et al., 2002; Paulsson, 2004). В клетках млекопитающих основным источником транскрипционных шумов являются случайные флюктуации между взрывами активной транскрипции и транскрипционной неактивности (Raj et al., 2006). Эти периоды, как полагают обусловлены ремоделированием хроматина, где активная транскрипция совпадает с деконденсацией хроматина, а транскрипционная неактивность совпадает с конденсацией хроматина (Raj et al., 2006). Недавно было подтверждено, что канонический путь передачи сигналов WNT играет ключевую роль в стабилизации и поддержании экспрессии генов мишеней (Arias and Hayward, 2006). Было предположено, что Wnt эффектор, β-catenin, выполняет качественно отличную функцию в генной экспрессии по мимо той, которую выполняют эффекторы др. сигнальных путей. В отличие от передачи сигналов epidermal growth factor (EGF), Hedgehog белки или bone-morphogenetic protein (BMP), которые находят транскрипционный аппарат и обеспечивают скорость транскрипции, передача сигналов WNT может быть преимущественно нацелена на ремоделирование хроматина и стабилизацию скорости и паттернов экспрессии, которые обеспечиваются транскрипционными факторами. в Установлены некоторые связи между первичными ресничками и путями WNT. Напр., inversin, белок, локализующийся в первичных реничках (Hou et al., 2002; Watanabe et al., 2003), ингибирует канонический WNT путь и активирует не-канонический WNT путь (Simons et al., 2005). Таким образом, inversin действует как молекулярный переключатель между двумя путями путем направления белка WNT пути disheveled (DVL) на деградацию. Ток жидкости увеличивает уровень inversin в ресничках (Otto et al., 2003), это подтверждает заключение, что канонический путь передачи сигнала WNT подавляется с помощью первичных ресничек. Tg737, мутантный ген в orpk мышиной модели PKD, кодирует polaris, белок, необходимый для собственно сборки ресничек (Pazour et al., 2000; Taulman et al., 2001; Yoder et al., 2002b). Имеется увеличение экспрессии и локализации β-catenin в расширенных протоках поджелудочной железы и повышенные уровни экспрессии WNT сигнальных транскрипционных факторов (Cano et al. 2004) у Tg737 мышей. в И polycystin-1 и polycystin-2, белки, кодируемые Pkd1 и Pkd2, соотв., локализуются в ресничках клеток почек у мышей и людей (Yoder et al., 2002a). Polycystin-1 является G protein-coupled рецептором, а polycystin-2 является кальциевым каналом. Поэтому возможно. что первичная ресничка может также участвовать в модуляции пути WNT/calcium. Этот путь за счет увеличения концентрации кальция, как полагают, влияет на канонические WNT пути, которые в свою очередь, могут влиять на вариабельность генной экспрессии. CONCLUDING REMARKS The data presented are consistent with the primary cilium being able to play a role as a gravitational force transducer in vertebrate cells. The degree to which the expression level of the same gene varies in different cells is an important factor that influences phenotypes within cell populations. The large number of cell states and types that are present in the lifetime of an organism and the reproducibility with which they are generated predicts the existence of developmental programs and mechanisms that ensure their reliable execution. In the context of development, variability in gene expression opposes the precise and reproducible phenotypes observed in cell populations. If noise is an intrinsic property of biological systems, it needs to be controlled during the construction of an organism. For instance, cells in many different regions of the developing vertebrate embryo adopt different fates based on the concentration of morphogen detected in the extracellular environment. For this concentration-dependent specification to work, cells must be able to tightly regulate their gene expression levels, our hypothesized function of the primary cilium. Otherwise, the response to many different concentrations of morphogen would be similar and the morphogen would function more like a molecular on-off switch. The unchanging cyclic nature of the Earth's gravitational field over the last 3-4 billion years, could have provided an evolutionary-selective advantage to cells that could use gravity as a stabilizing influence on gene expression levels, providing the control necessary to stabilize the phenotype of a cell population. The phylogenic age and ubiquitous nature of primary cilia suggest that regulating the stochastic nature of gene expression might be a function of primary cilia in most if not all vertebrate cells that possess them. In addition, for those cell types that do not use other stimuli such as shear forces associated with fluid flow to stimulate the primary cilia, the cyclic nature of Earth's gravitational field might provide the stimulus.

В последнее время мы изучали эффекты, вызванные микрогравитацией на экспрессию генов у эмбрионов рыбок данио. результаты этих экспериментов были настолько изменчивы и не предсказуемы для разных стадий развития и тканей, что мы начали рассматривать новую гипотезу. Первичные реснички функционируют как сенсоры гравитации, эта гипотеза объясняет почти, если не все накопленные результаты. первичная ресничка является филогенетически старой, недавно открытой вновь, почти повсеместной клеточной органеллой со специфическими сенсорными функциями в специфических типах клеток. первичная ресничка явлется сенсором тока в эпителиальных клетках почечных канальцев (see Pan et al., 2005) и ключевым модификатором пути передачи сигналов hedgehog (Corbit et al., 2005). Первичная ресничка. как полагают, действует также как тензометрический датчик для остеоцитов in vivo (Whitfield, 2003) и как молекулярный переключатель между каноническим и не-каноническими WNT путями (Otto et al., 2003). Кроме того, модифицированные первичные реснички являются ключевыми детерминантами лево-правосторонней асимметрии (Ferrante et al., 2006; Tamakoshi et al., 2006). Т. к. они являются филогенетически очень старыми клеточными органеллами, то разумно предположить, что первичные реснички могут обладать общей функцией во всех или большинстве типов клеток с ресничкой. Получены данные подтверждающие идею. что первичная ресничка может регулировать стохастическую природу генной экспрессии и это может быть общей функцией первичных ресничек. Т.к. все клетки нуждаются в регуляции стохастической природы генной экспрессии, то гравитационное поле Земли может предоставлять стимулы первичным ресничкам в тех клетках, где первичные реснички не приобрели некоторые др. функции, такие как восприятие деформирующих усилий (shear forces), ассоциированных с током жидкости.

HEART AND BLOOD VESSEL PRIMARY CILIA

Одним из первоначальных наблюдений стало то, что микрогравитация может вызывать достоверное увеличение генной экспрессии в развивающихся сердце и кровеносных сосудах (Shimada et al., 2005). первичные реснички были обнаружены в эндокардиальных клетках в развивающемся сердце кур преимущественно в клетках в области с низкими силами деформации (Van der Heiden et al., 2006). такая локализация, по-видимому, обусловлена активным ремоделированием сердца, которое происходит в областях с высокими силами деформации. Обычно для сердца, чтобы добавить эндокардиальные клетки, когда ремоделируются камеры, первичные реснички резорбируются в клетках, которые активно делятся (Alieva and Vorobjev, 2004). Если сердце рыбок данио сходно с сердцем кур в этом отношении, то первичные реснички эндокардиальных клеток д. резорбироваться, когда трубчатое сердце начинает ремоделироваться в дефинитивное предсердие и желудочки около 48 ч после оплодотворения. Временная рамка чувствительности к изменениям генной экспрессии, индуцированной микрогравитацией, совпадает с онтогенетическим периодом. когда первичные реснички присутствуют до периода моделирования сердечной трубки у эмбрионов рыбок данио.

Мы недавно исследовали эффекты, стимулированные микрогравитацией, на экспрессию fli1 у эмбрионов рыбок данио. Fli1 является самым ранним известным маркером эндотелиальных клеток у рыбок данио (Kidd and Weinstein, 2003). Стимуляция микрогравитацией вызывает драматические изменения в экспрессии fli1:gfp в эндотелиальных клетках, но только до инициации кровотока через развивающиеся сосуды (Shimada et al., 2005). Это указывает на то, что или эндотелиальные клетки теряют свою чувствительность к стимулированной микрогравитации или что эффекты тока крови через кровеносные сосуды превосходят эффекты стимулированной микрогравитации. Т.к. эндотелиальные клетки in vitro и in vivo имеют первичные реснички (Iomini et al., 2004; Van der Heiden et al., 2007), то первичная ресничка на эндотелиальной клетке может начать функционировать как сенсор тока по кровеносному сосуду, что совпадает с изменением чувствительности к стимулированной микрогравитации.

NOTOCHORD PRIMARY CILIA

Развитие хорды у рыбок данио имеет период чувствительности к стимулированной микрогравитации, пик которой приходится на 24-72 ч после оплодотворения (Shimada et al., 2005). Это является периодом пика спонтанных контракций развивающихся сомитов. У эмбрионов рыбок данио хорда состоит из набора клеток, которые могут быть сравнены со столбиками монет, расположенными на боку. Каждая клетка имеет одиночную первичную ресничку, проецирующуюся от центра к поверхности "coin" (unpublished observation). Т.к. первичные реснички от многих типов клеток функционируют по типу датчика деформаций (Pan et al., 2005; Whitfield, 2003), то первичная ресничка на каждой клетке хорды д. быть идеально приспособлена для мониторинга искривлений хорды в ответ на силы, такие как гравитация или мышечные сокращения. Первичная ресничка непосредственно сцеплена с цитоскелетом посредством материнской центриоли (see Satir and Christensen, 2006). Если первичные реснички действуют как сенсоры тяжести в хорде, то не нагруженная хорда во время воздействия искусственной микрогравитации может обнаруживать более драматический эффект на цитоскелет во время того периода, когда хорда подвергается действию др. сил, таких как мышечные контракции. Эта идея подтверждается наблюдением, что индуцированное увеличение экспрессии β-actin:gfp в хорде более драматическое при искусственной microgravity во время онтогенетического периода, когда эмбрион является более "активным."

HSP70 AND PRIMARY CILIA

Протеом ресничек недавно стал доступным on-line (http://www.ciliaproteome.org/). Эта база данных предоставляет справочник репертуара белков, необходимых для биогенеза и функции ресничек у эукариот (Gherman et al., 2006). Из генов, которые были обнаружены у рабок данио только hsp70 присутствует в протеоме ресничек. Единственной тканью у эмбрионов рыбок данио, которая экспрессирует hsp70 в отсутствие каких-либо средовых стрессов, это развивающийся хрусталик. HSP70 , по-видимому, действует в хрусталике, чтобы предупредить хрусталиковые клетки от гибели, когда их ядра вступают на путь апоптоза (Ribeil et al., 2007). Т.к. искусственная microgravity не индуцирует экспрессии в какой-либо ткани эмбрионов рыбок данио помимо хрусталика, то искусственная microgravity не может рассматриваться как hsp70-связанный средовой фактор, вызывающий стресс. Однако искусственная microgravity вызывает увеличение экспрессии hsp70 в хрусталиках и это совпадает со снижением TUNEL-позитивных клеток в хрусталиках (Shimada and Moorman, 2006). Это подтверждает идею, что искусственная microgravity, вызывающая изменения в генной экспрессии, может обеспечиваться посредством эффектов на первичные реснички.

ROHON BEARD NEURON PRIMARY CILIA

Когда мы начали подозревать участие первичных ресничек в обеспечении эффектов искусственной микрогравитации на экспрессию генов, то мы были в затруднении объяснить, как первичные реснички могут участвовать в изменениях, наблюдаемых в rohon beard нейронах. Rohon beard нейроны являются первичными сенсорными нейронами у рыбок данио до развития клеток ганглиев дорсальных корешков. Rohon beard нейроны являются единственным ростро-каудальным рядом крупных нейронов в дорсальной части спинного мозга на каждой стороне. Каждый rohon beard нейрон имеет одиночный аксон, который проецируется периферически, чтобы посегментно иннервировать ткани, которые в конечном итоге будут иннервированы клетками ганглиев дорсальных корешков. Наши предыдущие данные показали, что обнаруживается выраженное увеличение экспрессии β-actin: gfp в rohon beard нейронах, подвергшихся искусственной микрогравитации между 24 и 72 hr (Shimada et al., 2005). Когда формируются ганглии дорсальных корешков, то rohon beard нейроны дегенерируют. Этот процесс дегенерации начинается 72-80 ч после оплодотворения. Эта временная рамка совпадает с концом периода чувствительности к индуцированным с помощью simulated-microgravity изменениям в экспрессии генов в Rohon Beard нейронов, но не затрагивает первичных ресничек.

Данные по rohon beard нейронам согласуются с измерениями уровней экспрессии β-actin:gfp в одиночных rohon beard нейронах в каждом из 4-х сегментов спинного мозга у 24 эмбрионов в каждой группе. Не было обнаружено достоверных отличий между любыми из коэффициентов изменчивости для любой из групп. Данные были повторно проанализированы отдельно подсчитанных коэффициентов изменчивости для 4 rohon beard нейронов в каждом эмбрионе. При такого типа анализе коэффициенты изменчивости для simulated-microgravity эмбрионов оказались достоверно выше, чем для др. эмбрионов. Это указывает на то, что уровни экспрессии β-actin: gfp в rohon beard нейронах значительно более вариабельны, когда эмбрионы подвергаются действию искусственной микрогравитации. Этот повторный анализ данных по rohon beard нейронам оказывался боле чувствительным, если первичная ресничка могла быть сцеплена с путями, которые регулируют транскрипционные шумы.

В целом, обсуждаемые данные согласуются с выполняемой первичными ресничками ролью в обеспечении вызываемых simulated-microgravity изменений в генной экспрессии, наблюдаемых у эмбрионов рыбок данио и подтверждают гипотезу, что первичная ресничка может действовать как передатчик гравитационной силы в клетках позвоночных. Необходимо подчеркнуть, что эти данные не доказывают, что первичная ресничка используется. Необходимо также подчеркнуть, что эффекты микрогравитации или искусственной микрогравитации имеют незначительное, если вообще имеют какое-то значение к жизни на Земле. Поэтому, т.к. первичная ресничка может обнаруживать драматические изменения гравитационных сил, ассоциированных с переходом от гравитации и микрогравитации, то не следует подозревать, что первичная ресничка участвует в мониторинге гравитационного поля Земли.

Однако гравитационное поле Земли не является постоянным, оно подвергается очень малым циклическим изменениям величин из-за влияния Солнца и Луны. Эти изменения обычно имеют величины 2 X 10^-6 m/s² повсюду на поверхности Земли. Эти изменения имеют единственный наблюдаемый эффект приливы и отливы. Гравитационное поле Земли является наиболее слабым при наивысшем приливе и гравитационное поле Земли является наиболее сильным при отливе с периодом одного цикла прилива около 12 ч и 25 мин. Если пердположить, что обычно клетки имеют диаметр10 X 10^-6 м, то можно подсчитать приблизительную деформирующую силу, которая может быть приложена к первичной ресничке клетки циклическими изменениями гравитационного поля Земли, обычно клетка - 10-µ.m lbfvtnhjv: 4/3 Π r³ = 523.6 µm³ = 523.6 µg массу (предполагается, что клетка имеет ту же самую плотность что и вода): 523.6 X 10^-6 g = 523.6 X 10^-9 kg mass: Force = mass * acceleration, Force = 523.6 X 10^-9 kg * 2 X 10^-6 m/s² = 1,047.2 X 10^-15 (kg * m²)/s²

Newton является велечиной силы, необходимой, чтобы ускорить тело с массой sd 1 кг при скорости в 1 м в сек в квадрате. Алгебраически: IN = 1(kg * m²)/s²

Т.о., типичная клетка будет осуществлять до 1,047 X 10^-15 N на свою первичную ресничку из-за относительных позиций Земли, Солнца и Луны, в зависимости от ориентации клетки в поле гравитации по отношению к её первичной ресничке. Интересно, что одиночная первичная ресничка способна определить деформирующую силу (shear force) в 5.2 X 10^-15 N (Resnick and Hopfer, 2007). Это указывает на то, что первичная ресничка является достаточно чувствительной для восприятия циклических изменений гравитационного поля Земли.

PRIMARY CILIA AS GRAVITY SENSORS

Недавно нам удалось продемонстрировать, что rohon beard нейроны в развивающемся спинном мозге рыбок данио обнаруживают изменения стохастической природы их генной экспрессии, связанными с малыми циклическими изменениями гравитационного поля Земли (Shorr and Moorman; unpublished data). Короче, мы измерили экспрессию neurogenin-3.1:gfp (ngn3.1:gfp) в rohon beard нейронах у доного и того эмбриона во время дня, когда высокий прилив в Raritan River в New Brunswick, NJ (место в 3 милях от лаб) и затем во время дня с низким приливом во время двух последовательных дней. Средний коэффициент вариации экспрессии ngn3.1:gfp в rohon beard нейронах, пришедшийся на высокий прилив был достоверно выше, чем средний коэффициент вариации тех же самых rohon beard нейронов во время отлива, тогода как из средние уровни экспрессии были теми же самыми во время прилива и отлива. Это указывает на то, что экспрессия ngn3.1:gfp в rohon beard нейронах более вариабельна, когда гравитационное поле Земли наиболее слабое (прилив), чем когда гравитационное поле Земли наиболее сильное (отлив). "Gravity clamping" эмбрионов при 1.1 g во время прилива обусловливает изменчивость генной экспрессии, оказывающееся той же самой при приливе, что и при отливе, подтверждая идею, что это является изменением гравитационной силы, которое вызывает обычное изменение вариабельности генной экспрессии при приливе и отливе.

Чтобы определить опосредует ли первичная ресничка изменения в вариабельности генной экспрессии, мы избирательно разрушали первичные реснички за счет инкубации эмбрионов в chloral hydrate (Praetorius and Spring, 2003; Praeto-rius et al., 2004). После такого воздействия вариабельность экспрессии ngn3.1:gfp была одинаково высокой при приливе и отливе. Когда клетки удаляли из chloral hydrate, то они отращивали свои первичные реснички. В результате вариабельность экспрессии ngn3.1:gfp снова была достоверно выше при приливе, чем при отливе. Эти данные подтверждают, что первичная ресничка ответственна of передачу циклических изменений гравитационного поля Земли а изменения уровней вариабельности генной экспрессии в rohon beard нейронах спинного мозга рыбок данио.

Почему rohon beard нейроны д. нуждаться в механизме регуляции вариабельности уровней генной экспрессии и являются ли эти результаты уникальными для rohon beard нейронов? Во время развития rohon beard нейроны специфицируются и поддерживаются как одиночный ростро-каудальный ряд клеток на каждой из сторон дорсальной части спинного мозга эмбрионов рыбок данио. Чтобы спецификация и поддержание происходили надлежащим образом презумптивные rohon beard нейроны д. быть способны аккуратно и воспроизводимо отвечать на специфические комбинации средовых факторов. Если презумптивные rohon beard нейроны не смогут четко регулировать уровни вариабельности генной экспрессии во время спецификации, то они не смогут развиться как одиночный ряд клеток, но будут развиваться как более диффузная популяция в дорсальной части спинного мозга.

Способность тонко регулировать стохастическую природу генной экспрессии не является уникальной для rohon beard нейронов. Все клетки нуждаются в регуляции вариабельности уровней генной экспрессии, чтобы быть способны аккуратно и воспроизводимо реагировать на своё внеклеточное окружение. Существует цена повышенной аккуратности и некоторые группы клеток ммогут быть способны успешно противостоять транскрипционным шумам (variability), в то время как др.могут обладать низкой толерантностью к шумам. Напр, удержание транскрипционных шумов на низком уровне особенно важно во время развития, когда комбинации внеклеточных сигналов специфицируют фенотипы клеток, тканей и органов по всему эмбриону. Напр., градиент Shh, высвобождаемого хордой и донной пластинкой, в комбинации с BMP, высвобождаемого верхней пластинкой, и ретиноевой кислотой из сомитов. специфицируют дорсо-вентральные качественные способности нейронов с развивающемся спинном мозге (Wilson and Maden, 2005). В отсутствие способности тонко регулировать уровни генной экспрессии в ответ на различные пороги концентраций морфогенов клеточные реакции станут довольно простыми on-off переключениями, делающими значительно более трудным спецификацию более чем 8 типов клеток, обнаруживаемых вдоль дорсо-вентральной оси спинного мозга. Повсеместная природа первичных ресничек подтверждает, что использование первичных ресничек для регуляции стохастической природы генной экспрессии может быть общим для всех клеток позвоночных.

WNT PATHWAYS MIGHT LINK PRIMARY CILIA TO TRANSCRIPTIONAL NOISE

На уровне одиночной клетки транскрипция индивидуальных генов связана с шумами, случайными молекулярными флюктуациями, которые вызывают вариабельность уровней генной экспрессии в клеточной популяции. Источники шума, которые ассоциированы с генной экспрессией включают: небольшое количество молекул, которые участвуют в определенных биохимических реакциях в клеточных пространствах, стохастическая природа молекулярных взаимодействий, которые лежат в основе химических реакций и врожденная эффективность процесстов транскрипции и трансляции. Большинство исследований шумов, которые связаны с экспрессией гена, сфокусированы на транскрипции и принято отличать шумы, которые проиходят в результате взаимодействия между полимеразами и ДНК (intrinsic noise), и шумы, продуцируемые др. влияниями, такими как случайные флюктуации в питательных веществах, клеточных делений или регуляторных импульсов к аппарату транскрипции (extrinsic noise) (Elowitz et al., 2002; Paulsson, 2004). В клетках млекопитающих основным источником транскрипционных шумов являются случайные флюктуации между взрывами активной транскрипции и транскрипционной неактивности (Raj et al., 2006). Эти периоды, как полагают обусловлены ремоделированием хроматина, где активная транскрипция совпадает с деконденсацией хроматина, а транскрипционная неактивность совпадает с конденсацией хроматина (Raj et al., 2006).

Недавно было подтверждено, что канонический путь передачи сигналов WNT играет ключевую роль в стабилизации и поддержании экспрессии генов мишеней (Arias and Hayward, 2006). Было предположено, что Wnt эффектор, β-catenin, выполняет качественно отличную функцию в генной экспрессии по мимо той, которую выполняют эффекторы др. сигнальных путей. В отличие от передачи сигналов epidermal growth factor (EGF), Hedgehog белки или bone-morphogenetic protein (BMP), которые находят транскрипционный аппарат и обеспечивают скорость транскрипции, передача сигналов WNT может быть преимущественно нацелена на ремоделирование хроматина и стабилизацию скорости и паттернов экспрессии, которые обеспечиваются транскрипционными факторами. в

Установлены некоторые связи между первичными ресничками и путями WNT. Напр., inversin, белок, локализующийся в первичных реничках (Hou et al., 2002; Watanabe et al., 2003), ингибирует канонический WNT путь и активирует не-канонический WNT путь (Simons et al., 2005). Таким образом, inversin действует как молекулярный переключатель между двумя путями путем направления белка WNT пути disheveled (DVL) на деградацию. Ток жидкости увеличивает уровень inversin в ресничках (Otto et al., 2003), это подтверждает заключение, что канонический путь передачи сигнала WNT подавляется с помощью первичных ресничек. Tg737, мутантный ген в orpk мышиной модели PKD, кодирует polaris, белок, необходимый для собственно сборки ресничек (Pazour et al., 2000; Taulman et al., 2001; Yoder et al., 2002b). Имеется увеличение экспрессии и локализации β-catenin в расширенных протоках поджелудочной железы и повышенные уровни экспрессии WNT сигнальных транскрипционных факторов (Cano et al. 2004) у Tg737 мышей. в

И polycystin-1 и polycystin-2, белки, кодируемые Pkd1 и Pkd2, соотв., локализуются в ресничках клеток почек у мышей и людей (Yoder et al., 2002a). Polycystin-1 является G protein-coupled рецептором, а polycystin-2 является кальциевым каналом. Поэтому возможно. что первичная ресничка может также участвовать в модуляции пути WNT/calcium. Этот путь за счет увеличения концентрации кальция, как полагают, влияет на канонические WNT пути, которые в свою очередь, могут влиять на вариабельность генной экспрессии.

CONCLUDING REMARKS

The data presented are consistent with the primary cilium being able to play a role as a gravitational force transducer in vertebrate cells. The degree to which the expression level of the same gene varies in different cells is an important factor that influences phenotypes within cell populations. The large number of cell states and types that are present in the lifetime of an organism and the reproducibility with which they are generated predicts the existence of developmental programs and mechanisms that ensure their reliable execution. In the context of development, variability in gene expression opposes the precise and reproducible phenotypes observed in cell populations. If noise is an intrinsic property of biological systems, it needs to be controlled during the construction of an organism. For instance, cells in many different regions of the developing vertebrate embryo adopt different fates based on the concentration of morphogen detected in the extracellular environment. For this concentration-dependent specification to work, cells must be able to tightly regulate their gene expression levels, our hypothesized function of the primary cilium. Otherwise, the response to many different concentrations of morphogen would be similar and the morphogen would function more like a molecular on-off switch. The unchanging cyclic nature of the Earth's gravitational field over the last 3-4 billion years, could have provided an evolutionary-selective advantage to cells that could use gravity as a stabilizing influence on gene expression levels, providing the control necessary to stabilize the phenotype of a cell population. The phylogenic age and ubiquitous nature of primary cilia suggest that regulating the stochastic nature of gene expression might be a function of primary cilia in most if not all vertebrate cells that possess them. In addition, for those cell types that do not use other stimuli such as shear forces associated with fluid flow to stimulate the primary cilia, the cyclic nature of Earth's gravitational field might provide the stimulus.

The Primary Cilium as a Gravitational Force Transducer and a Regulator of Transcriptional NoiseStephen J. Moorman and Ardon Z. ShorrDEVELOPMENTAL DYNAMICS V.237, P.1955-1959, 2008

The Primary Cilium as a Gravitational Force Transducer and a Regulator of Transcriptional Noise
Stephen J. Moorman and Ardon Z. Shorr
DEVELOPMENTAL DYNAMICS V.237, P.1955-1959, 2008