У млекопитающих пролиферативные клетки не обнаруживаются на периферии сетчатки у взрослых при физиологических условиях. Однако pigmented ciliary margin (PCM) взрослых глаз содержит потенциальные стволовые клетки, которые ммогут быть выделены
(Ahmad etal. 2000; Tropepe etal. 2000). Когда цилиарные тела млекопитающих диссоциируют на отдельные клетки и культивируют
, то небольшое количество клеток подвергается трансдифференцировке и пролиферирует, давая нейросферы. Будучи помещенными в увловия для дифференцировки эти сферы-образующие клетки дифференцируются во многие типы клеток, включая фоторецепторы, биполярные клетки и Muller глию (Ahmad etal. 2000; Tropepe etal. 2000). Интересно, что расположение PCM топографически аналогично CMZ у низших позвоночных. Т.к. PCM обычно не митотические и полностью дифференцированы у млекопитающих, то предполагается, что клетки в PCM поддерживаются в молчащем состоянии
, сохраняя свой потенциал вести себя подобно стволовым клеткам ис. следовательно, они д. рассматриваться как 'потенциальные стволовые клетки' (Amato etal. 2004).
Хотя факторы, которые регулируют CMZ клетки предшественники остаются в основном неизвестными, копятся доказательства, показывающие, что внеклеточные сигнальные молекулы играют существенные роли в контроле пролиферации или дифференцировки CMZ клеток предшественников (rev. Yang 2004). Fischer and Reh сфокусировались на субнаборе клеток в CMZ, которые пролиферируют у цыплят после вылупления и проверяли. могут ли экзогенные ростовые факторы влиять на их пролиферацию (Fischer & Reh 2000). Они установили, что пролиферация CMZ клеток предшественников усиливается при внутриокулярных инъекциях инсулина, insulin-like growth factor 1 (IGF1) или EGF . Стимулирующий эффект insulin/IGF на пролиферацию клеток CMZ наблюдался также у костистых рыб (Boucher & Hitchcock 1998; Otteson & Hitchcock 2003). Клетки предшественники из куриных CMZ могут действительно дифференцироваться в несколько типов зрелых нейронов сетчатки, такие как амакриненые и биполярные клетки. Однако они неспособны дифференцироваться в ганглиолярные клетки или фоторецепторные клетки, показывая тем самым, что они обладают лишь ограниченной способностью дифференцировки. Интересно, что совместное применение FGF2 и инсулина может индуцировать дифференцировку CMZ клеток предшественников во ганглиолярные клетки сетчатки (Fischer et al. 2002), подтверждая, что ограниченная способность CMZ предшественников после вылупления цыплят может быть модулирована определенными комбинациями различных факторов роста. Имеется также несколько линий доказательства, которые демонстрируют участие пути передачи сигналов Shh в пролиферации на краю сетчатки. Мыши, дефицитные по дному аллелю Shh корецептора,
patched, у которых передача сигналов Shh активирована постоянно, обнаруживают персистенцию клеток предшественников на крае сетчатки, это напоминает CMZ низших позвоночных (Moshiri & Reh 2004), указывая тем самым, что передача сигналов Shh индуцирует пролиферацию клеток на краю сетчатки мышей, который обычно не содержит пролиферирующих клеток. Следовательно, Shh белок может способствовать пролиферации CMZ в глазах цыплят после вылупления (Moshiri et al. 2005). Как лиганды, так и рецепторы этих ростовых факторов скорее всего экспрессируются повсеместно во всей сетчатке, включая и центральную часть сетчатки, но не обязательно специфичны для CMZ (Diaz et al. 2000; Bergman etal. 2005: Close etal. 2006), указывая тем самым, что эти ростовые факторы могут действовать как митогены или модуляторы дифференциальной способности обычным образом. Следовательно, эти факторы, описанные выше, д. поддерживать пролиферативную способность CMZ клеток предшественников в комбинации с определенным CMZ специфическим фактором.
Roles of Wnt signaling in the retina
Доказательства активации передачи сигналов Wnt на периферии сетчатки.
Сигнальный путь Wnt является сигнальным каскадом, который контролирует разнообразные онтогенетические процессы (reviewed in Dorsky et al 2002; Logan & Nusse 2004). В каноническом Wnt сигнальном пути соединение Wnt лиганда со своим рецептором Frizzled и корецептором LRP5/6 ингибирует активность деструкционного комплекса, который вызывает деградацию β -catenin посредством ubiquitin-зависимого пути, приводя к накоплению β-catenin в цитоплазме. Накопленный β-catenin транслоцируется в ядро, где он соединяется с T cell-specific transcription factor/lymphoid enhancer-binding factor (TCF/LEF) транскрипционными факторами и затем активирует транскрипцию их генов мишеней (rev. Dorsky etal. 2002; Logan & Nusse 2004). Недавно каноническая роль Wnt пути была исследована основательно и было показано, что он контролирует дифференцировку ткане-специфических стволовых клеток (rev. Reya & Clevers 2005; Clevers 2006; Blanpain etal. 2007). Удивительно, что сигнальный путь Wnt активируется на периферии сетчатки, включая CMZ у разных видов. У трансгенных мышей, несущих Wnt репортерную кассету. в которой LacZ экспрессируется под контролем Wnt-чувствительных элементов, активность репортера обнаруживалась на периферии сетчатки (Liu etal. 2003; Liu etal. 2006; Liu etal. 2007). Wnt репортерная активность обнаруживалась также в периферической области сетчатки у рыбок данио (Dorsky etal. 2002; Yamaguchi etai. 2005) и эмбрионов кур (Cho & Cepko 2006). Более того, LEF1 экспрессируется на периферии сетчатки кур и мышей (Kubo etal. 2003; Liu etal. 2007), их экспрессия позитивно регулируется после активации канонического Wnt сигнального пути (Kengaku etal. 1998; Hovanes etal. 2001). Среди семейства Wnt генов, экспрессирующихся в сетчатке, Wnt2b, по-видимому, является соотв. лигандом, который активирует канонический сигнальный путь на периферии сетчатки. У мышей и кур Wnt2b обнаруживает паттерн экспрессии. которые совершенно сходен с активностью Wnt репортера (Liu etal. 2003). У этих видов Wnt2b экспрессируется в наиболее маргинальной оконечности (anterior rim) сетчатки, который соседствует с CMZ, а также в retinal pigmented epithelium (RPE) , покрывающем реснитчатый эпителий (Zakin etal. 1998; Jasoni etal. 1999; Kubo etal. 2003; Liu etal. 2003; Cho & Cepko 2006). Тщательный анализ паттернов экспрессии членов семейства Wnt показал, что некоторые члены сигнального семейства Wnt, включая Wnt2b и Frizzled гены, также экспрессируются на периферии сетчатки (Jin etal. 2002; Fuhrmann etal. 2003; Liu etal. 2003).
Wnt signaling in the maintenance of stem cell-like progenitor cells
Паттерны экспрессии Wnt2b и Frizzled рецепторов в ciliary крае сетчатки указывают на то, что передача сигналов Wnt может регулировать характеристики CMZ клеток предшественников. В самом деле, Wnt2b ингибирует нейрональную дифференцировку и индуцирует незрелое состояние предшественников сетчатки, если эктопически избыточно экспрессируется в центральной части сетчатки
in ovo (Fig. 2A), а блокирование передачи сигналов Wnt с помощью доминантно негативного LEF1 белка ингибирует клеточную пролиферацию на ciliary крае и вызывает преждевременную нейрональную дифференцировку (Kubo etal. 2003; Kubo etai. 2005). Более того, функция Wnt2b по поддержанию
Fig. 2. Wnt signaling maintains retinal stem cell-like progenitor cells. (A) Immunostaining for retinal cell markers of retinal explants. Retinal explants were prepared from E6 retinas electroporated with Replication-Competent A.SLV long terminal repeat with a Splice acceptor (RCAS) control or Wnt2b provirus and cultured for 2 days in vitro. The number of ceils expressing neuronal markers such as Visinin (cone photoreceptor ceils) and Hu (ganglion and amacrine cells) are dramatically reduced in the Wnt2b-expressing retinai explants. Conversely, cells doubly positive for Pax6 and ChxIO, markers for immature retinal progenitor cells, are maintained for long period of time in Wnt2b-expressing explants, (B) Retinal explants prepared at E6 and cultured for 7 days in vitro. Explants immediately after the dissection are shown at the same magnification in insets. Wnt2b~expresstng retinal explants increase in size enormously, whereas the control explants generate much smaller spheres. (C) Wnt2b-express!ng explants prepared from E6 retina were cultured for 2 days, and further cultured in the presence of extraceliuiar domain of Frizzled8 (FzSCRDi. which antagonizes Wnt ligands, for 10 days (10 DlV), and stained for neuronal markers Visinin/Hu or a Muiler glial cell marker Giutamine Synthetase (GlnSyn) counterstained with propidium iodide (PI). Wnt2b-expressing retinal progenitors can differentiate into multiple types of mature retinal neurons and also GinSyn-positive glia upon blockade of Wnt signaling
недифференцированного состояния обеспечивается посредством супрессии генов, необходимых для нейрональной дифференцировки, а именно Notch1 и пронейральных генов (Kubo etai. 2005). Кроме того, Wnt2b делает возможной непрерывную пролиферацию ретинальных клеток предшественников, которые сильно напоминают ретинальные стволовые клетки. Напр., когда
Wnt2b стабильно экспрессируется в центральных клетках предшественниках, которые обычно пролиферируют только ограниченный период времени, клетки продолжают пролиферировать, чтобы сформировать большие слоистые структуры в основном состоящие из недифференцированных клеток (Fig. 2B) (Kubo etai. 2005). Сходная гиперпролиферация наблюдалась также, когда стабилизированный β -catenin, который конституитивно активирует канонический путь передачи сигналов Wnt, вносится в центральную часть сетчатки рыбок данио (Yamaguchi etai. 2005). Более того, эти Wnt2b-обработанные клетки постепенно дифференцируются в нейроны и глию после блокады передачи сигналов Wnt (Nakagawa etai. 2003; Kubo et al. 2005) (Fig. 2C), gпокзывая, что передача сигналов Wnt индуцирует постоянную клеточную пролиферацию ретинальных клеток предшественников без потери ими мультипотентности. Все эти наблюдения согласуются с идеей, что предача сигналов Wnt обеспечивает клетками предшественниками CMZ со способностью, сходной со стволовыми клетками.
Необходимо отметить. что мРНК для Wnt2b, LEF1 и некоторых Frizzleds обнаруживаются в культурах нейросфер, приготовленных из PCM глаз взрослых грызунов (Das etai. 2006), а активация канонического сигнального пути Wnt увеличивает количество сфер, генерируемых из PCM (Das etai. 2006; Inoue etai. 2006). Эти результаты подтверждают, что передача сигналов Wnt оказывает позитивное влияние на формирования ретинальных стволовых клеток у млекопитающих in vitro.
Induction of Wnt signaling activation in Muiler glial cells during retinal regeneration
Клетки Muller глии являются принципиальной глией сетчатки позвоночных, которая не пролиферирует при физиологических условиях. Однако было показано, что когда сетчатка повреждена за счет нейротоксических воздействий, то клетки зрелой Muller глии в центральной части сетчатки приобретают способность подобную таковой клеток предшественников (Fischer & Reh 2001; Ooto et al. 2004). Недавно было показано, что передача сигналов Wnt ответственна за клеточную пролиферацию в регенеративном процессе зрелой сетчатки, индуцированной повреждениями сетчатки (Hackam 2005). У трансгенных мышей, несущих Wnt репортерную кассету, активность репортера в обычных условиях не активируется в клетках Muller глии, но становится активной в ответ на повреждения или у генетически модельных мышей дегенерации сетчатки (Osakada etal. 2007; Yi etal. 2007). Ингибирование пути передачи сигналов Wnt с помощью Wnt антагониста DKK1 предупреждает вызываемую повреждениями пролиферацию клеток Muller глии, указывая тем самым, что этот процесс нуждается в активации передачи сигналов Wnt (Osakada etai. 2007). Интересно, что клетки Muller глии, как известно, секретируют различные нейрозащитные ростовые факторы, такие как basic fibroblast growth factor (FGF) или neurotrophic factors, в ответ на повреждения фоторецепторов, при этом клетки Muller глии вносят вклад в жизнеспособность фоторецепторных клеток (Harada etal. 2000; Wahiin et al. 2000). Итак, индукция активации Wnt в комбинации с высвобождением др. факторов роста может быть необходимой для клеточной пролиферации, чтобы эффективно индуцировать программу регенерации. Важно с терапевтической точки зрения активация клеток прирожденной Muller глии может быть многообещающим источником для потенциальной терапии сегодня не поддающихся лечению болезней сетчатки, таких как retinitis pigmentosa. Этот подход позволяет обойти необходимость в трансплантации, с помощью которой клетки не столь эффективно интегрируются в ткани сетчатки, чтобы достичь восстановления функции.
Wnt signaling in the ciliary/iris epithelium development Недавно передача сигналов Wnt была продемонстрирована, как контролирующая дифференцировку передних глазных структур, включая радужку и ciliary эпителий (Cho & Cepko 2006: Liu etal. 2007). У эмбрионов кур, активация канонического пути передачи сигналов Wnt за счет стабилизированной формы β -catenin не только ингибирует нейрональную дифференцировку, но и также индуцирует экспрессию маркеров радужки/ciliary эпителия, таких как collagen IX и BMP7, с сопутствующим снижением клеточной пролиферации (Cho & Cepko 2006). Кроме того, устранение LEF1-опопсредованной транскрипции ведет к частичной потере ткани радужки in vivo. В согласии с этим исследованием кондиционная активация β-catenin в сетчатке мышей также индуцирует дифференцировку не нейронального iris/ciliary эпителия, в то же время ингибирует нейрональные судьбы (Liu etal. 2007). Напрротив, условиями вызываемая делеция β-catenln подавляет экспрессию маркеров iris/ciliary эпителия и снижает размер iris/ciliary эпителия и вызывает складки в ciliary теле. Эти два исследования открывают дополнительные роли передачи сигналов Wnt, которая участвует в индукции не нейронального iris/ciliary эпителия. Однако в этих двух исследованиях β-catenin-индуцированные клетки, сходные с таковыми ciliary края, не экспрессируют Pax6 или Chx10, которые обычно экспрессируются в ciliary крае in vivo (Cho & Cepko 2006; Liu etal. 2007). Следовательно, возможно, что программа атипического развития индуцируется в таких ситуациях. Хотя сигнальный путь bone morphogenetic protein (BMP) также участвует в формировании ciliary тела (Zhao et al. 2002), но только передача сигналов Wnt, а также передача сигналов BMP могут быть необходимы, чтобы полностью индуцировать развитие iris/ciliary эпителия.
Wnt signaling in the development of Xenopus retina
В сетчатке Xenopus Frizzled5 способствует нейральному потенциалу ретинальных клеток предшественников путем индукции экспрессии Sox2 скорее, чем ингибирования их нейрональной дифференцировки (Van Raay et al. 2005). Экспрессия Frizzled5 и Sox2 исключена из дальней периферии CMZ, которая содержит настоящие стволовые клетки (Sumanas & Ekker 2001; Van Raay et al. 2005), и сходный паттерн экспрессии Frizzled5 обнаруживается в сетчатке кур (Fuhrmann etal. 2003). Отсутствие экспрессии в регионах, содержащих стволовые клетки, указывает на то, что эти гены функционируют в частично дифференцированных предшественниках, предназначенных стать нейронами скорее, чем в стволовых клетках. Это предположение подтверждается наблюдением, что блокирование Frizzeled5 снижает экспрессию в клетках нейральных предшественников Notch/Delta и пронейральных генов, не затрагивая экспрессии маркеров ранних предшественников, таких как Pax6, Six6 или Chx10 (Van Raay etal. 2005). Хотя FrizzledS активирует канонический Wnt сигнальный путь, соотв. лиганды Wnt до сих пор не охарактеризованы. d
Wnt/β-catenin signaling may have multiple roles during vertebrate eye development
Все эти результаты от разных видов подтверждают, что передача сигналов Wnt играет роль во множественных аспектах развития сетчатки. Соотв. пространственный и временной паттерн TCF/LEF-LacZ репортерной активности изменяется драматически во время развития сетчатки или в ответ на клеточные стимулы (Liu et al. 2006; Osakada etal. 2007; Yi etal. 2007). Напр., репортерный сигнал обнаруживается также в клетках предшественниках центральной части сетчатки или в ретинальных ганглиолярных клетках, вовлекая его в широко распространенную активацию (Liu etal. 2006). В общем считается, что перадача сигналов Wnt/β-catenin оказывает различные эффекты на большое количество популяций стволовых клеток в зависимости от клеточного контекста (rev. Clevers 2006), Напр., в кишечных криптах и волосяных фолликулах передача сигналов Wnt/β-catenin не только контролирует экспансию клеток предшественников, но и управляет терминальной дифференцировкой в специализированные типы клеток (Zhou et al, 1995; van Es et al. 2005). Необходимо также отметить, что существуют важные виды отличий в отношении пролиферативной способности клеток предшественников в CMZ (Amato etal. 2004; Moshiri etal. 2004). Видимые расхождения меду данными, полученными на разных экспериментальных системах при развитии периферии сетчатки, д. быть обязательно разрешены в дальнейшем, включая выяснение соотв. пар лиганд и рецептор и их стоящие ниже сигнальные каскады.
Conclusion
Recent molecular biological approaches have revealed that extracellular factors including Wnt and several growth factors contribute significantly to the development of peripheral retina and the retinal regeneration processes. What we have learned from this series of molecular analyses is that the way in which the signaling pathways work is far more complex than previously thought, Wnt signaling is involved not only in the stem cell-like progenitor maintenance but also in the iris/ciiiary epithelium differentiation and in the acquisition of neural competence. It will be of great interest to understand how the single Wnt signaling pathway can regulate different cell types, and how it interacts with other signaling pathways such as BMP or Shh signaling. Elucidation of the molecular basis for the characteristics of Intrinsic retinal stem cells in the CMZ as well as the induced stem cell-like Muller glial cells will heip the development of therapeutic strategies for retinal regeneration.
магазины и цены на шкафы купе на заказ
Сайт создан в системе
uCoz 
Shinlchi Nakagawa
Fig. 1. The organization of the vertebrate peripheral retina. (A, B) Schematic representation of cross section of chicken eyes at embryonic day 4 (A) and at posthatched stage (B). The eyes at each developmental stage are shown approximately to scale in (B). In the posthatched eye, the peripheral retina can further be divided into subdomains as shown in (C). Muller glial cells are located in the central retina (not shown). (C) Higher magnification of the box in (B). Distal part of the peripheral retina differentiates into non-neural tissues such as iris and ciliary epithelium. In the transitional zone between the iris/ciliary epithelium and the neural retina lies the ciliary marginal zone (CMZ). In adult mammalian eye. the potential retinal stem cells reside in the pigmented ciliary margin (PCM). RPE, retinal pigmented epithelium.