Сегменты позвоночных формируются во время раннего эмбриогенеза, когда предшественники позвонков, т.наз. сомиты, отпочковываются ритмическим образом от передней части presomitic mesoderm (PSM). Периодическое образование сомитов, как полагают, контролируется с помощью молекулярного осциллятора - часов сегментации - которые управляют периодической активацией путей Notch, Wnt и fibroblast growth factor (FGF) в PSM^1,2-4. Периодический сигнал часов сегментации превращается в повторяющиеся серии сомитов за счет перемещения фронта созревания - фронта волны или фротнта детерминации - формируемых за счет градиента передачи сигналов Wnt/FGF, который снижается к хвосту PSM одновременно у удлинением

Число сомитов, а следовательно, и позвонков, чрезвычайно варьирует среди видов позвоночных⁹. Напр., лягушки имеют приблизительно 10 позвонков, тогда как люди - 33, а змеи более 300. Чтобы исследовать механизмы, контролирующие количество позвонков мы сравнивали сомитогенез у corn змеи (Pantherophis guttatus; Fig. la, b), которая имеет наибольшее число сомитов (~315), с тремя др. видами позвоночных, которые имеют их меньшее количество: рыбки данио (Danio rerio, 31), куры (Gallus gallus, 55) и мыши (Mus musculus, 65).

Изучали экспрессию у corn snake гомологов генов, участвующих в формировании паттерна PSM и сомитогенезе (Fig. 2a-l). Гены, кодирующие fibroblast growth factor 8 (FGF8) (Fig. 2b) и его мишени sprouty 2 (SPRY2; Fig. 2c) и dual specificity phosphatase 6 (DUSP6)410 (Fig. 2d), а также WNT3A (Fig. 2e) и его мишени AXIN2 (ref. 7; Fig. 2f) и mesogenin 1 (MSGN1) (ref. 11; Fig. 2g), ephrin receptor A4 (EPHA4; Fig. 2h), retinoic acid biosynthetic enzyme (RALDH2; Fig. 2i), paraxis (TCF15) (Fig. 2j), UNCX4.1 и MYOD (Supplementary Fig. 1), были клонированы и была проанализирована их экспрессия с помощью гибридизации in situ. Все эти гены (исключая SPRY2) экспрессируются в доменах, сравнимых с таковыми рыб или амниот^4-7,12-19, подтверждая существование заднего Wnt/FGF градиента в противоположность переднему градиенту ретиноевой кислоты у corn змеи, как и у

Сравнивали динамику этого градиента у змеи с таковой у др. видов. В качестве показателя задних градиентов мы использовали экспрессию MSGN1, которая контролируется градиентом Wnt/FGF и для которого четкая передняя граница маркирует позицию полоски mesoderm posterior 2 (MESP2)²⁰ на фронте детерминации³ (Fig. 2a-g). Мы измеряли скорость регрессии передней границы MSGN1 во время сомитогенеза у всех 4-х видов (Fig. За-x) и установили, что она перемещается на длину одного сомита во время одного периода формирования сомитов независимо от стадии сомитогенеза и вида (Fig. 4a and Supplementary Fig. 2). Это подкрепляет важное предсказание модели часов-и-фронта волны, что размер сомита соответствует расстоянию, проходимому фронтом волны в течение одного периода осцилляции. Мы описали соотношение домена экспрессии MSGN1 к размеру PSM как функцию стадии для каждого вида (Fig. 4b). Очевидно, что сходное соотношение, наблюдаемое в течение всего сомитогенеза у всех 4-х видов, указывает на то, что происходят сходные процессы (scaled proportionately). Т.о., характеристики градиентной системы, участвующие в формировании паттерна в PSM, по-видимому, законсервированы у corn змей и др.

Мы изучали циклическую экспрессию генов, ассоциированных с часами сегментации амниот. Не получено доказательств динамической экспрессии SPRY2, DUSP6 (ref. 4) или AXIN2 (ref. 7) в PSM змеи (Fig. 2c, d, f). Однако, Lunatic fringe (LFNG) обнаруживает неожиданный паттерн экспрессии, который представлен свыше 9 полосок различного размера и положения в PSM (Fig. 2k, l)^21,22. 31 эмбрион змеи был гибридизирован с LFNG и все они обнаруживали разный паттерн экспрессии (Fig. 2k, 1 and data not shown). Эти данные указывают на существование осциллятора, управляющего циклической экспрессией гена у эмбрионов змей. Количество полосок экспрессии LFNG у corn змей, однако, в несколько раз больше, чем у др. видов позвоночных (Fig. 2k-p), это указывает на то, что часы сегментации могут регулироваться разными

Предполагая, что один сомит формируется во время каждого цикла осцилляции часов, мы можем вывести период осцилляций часов подсчитывая количества сомитов у эмбрионов от одного и того же сжатия (clutch) за разное время инкубации (Supplementary Methods). У corn змей средняя скорость образования сомитов составляет одну пару каждые 100 мин., по сравнению со скоростью возникновения пары каждые 30, 90 и 120 мин. у рыбок данио, кур и мышей, соотв. Скорость образования сомитов была найдена равной одной паре каждые ~60 min у эмбюрионов домовой змеи [Lamprophis fuliginosus), которая очень сходна с онтогенетическими характеристиками и паттерном экспрессии LFNG у corn змей (Supplementary Methods and Supplementary Fig.

Чтобы оценить значение этих периодов, необходимо сравнить их с общей скоростью развития, которая различна у разных видов. Сравнение времени, необходимого для достижения консервативных морфологических характеристик (Supplementary Fig. 4) указывает на то, что скорость развития почти в три раза более медленная у corn змей. чем у кур. Мы также анализировали ящериц Aspidoscelis uniparens, которые имеют ту же самую медленную скорость общего развития, что и змеи²³ (Supplementary Methods). Этот вид имеет приблизительно 90 сомитов и обладает более длительным временем образования сомита (~4h). Следовательно, относительно скорости развития часы тикают быстрее у эмбрионов змей, чем у эмбрионов кур и

Анализ взаимоотношений между скоростью сомитогенеза и скоростью роста ткани PSM подтверждает эту гипотезу. В соответствии с моделью часов-и-фронта волны, каждый сомит состоит из клеток, выделяющихся из PSM в течение одного цикла часов. Это д. быть равным количеству новых клеток, генерируемых в PSM за счет роста, по крайней мере, когда PSM сохраняет свой постоянный размер. Т.о., размер сомита, как фракция размера PSM прямо отражает продолжительность цикла часов, как фракцию среднего времени генерации клеток PSM (т.е., chlytt время клеточного цикла; Supplementary Box 1). У змей эта фракция приблизительно 1/4 от значения. наблюдаемого у др. видов.(Fig. 4c). Т.о., часы сегментации у змей, идут приблизительно в 4 раза быстрее относительно времени средней генерации клеток PSM, чем у др.

Мы определяли время средней генерации клеток и общее количество клеточных генераций PSM, необходимое для продукции полного набора сомитов. Мы пытались опредить способ. с помощью которого размер PSM изменяется в ходе сомитогенеза (Figs За-x and 4d). У рыбок данио длина PSM снижается с начала сомитогенеза; у эмбрионов амниот PSM сначала увеличивается, а затем уменьшается в размере вплоть до конца сомитогенеза²⁴ (Fig. 4d). Благодаря детальным измерениям длины PSM и размера только что сформированного сомита of the most recently formed somite S₁ как функцию стадии развития (Fig. 4d, e), в комбинации со знанием периода сегментационных часов и общего количества формируемых сомитов, мы можем подсчитать среднее время клеточной генерации и общее количество клеточных генераций необходимое PSM, чтобы создать полный набр сомитов (Supplementary Box 1). Эти подсчеты показали, что время клеточной генерации в среднем в PSM, которое значительно больше у corn змей (~24.4h), чем у мышей (~8h), кур (~6.3h) или рыбок данио (~5.5h). Прямые измерения клеточного цикла с использованием включения 5-bromodeoxyuridine (BrdU) с помощью жидкостной цитометрии, дали время клеточного цикла ~34 h в эмбриональном хвосте corn змей и ~30 h у ящериц, по сравнению с ~9 h у кур (as measured using tritiated thymidine²⁵; Supplementary Table 4, Fig. 4f and Supplementary Fig. 5), это подтверждает, что время клеточной генерации почти в 4 раза больше, чем у кур. Удивительно, вычисленное количество клеточных генераций, необходимых для генерации 315 сомитов у змей (~21 генерация) лишь слегка больше, чем для 65 сомитов у мышей (~17 генераций) или 55 сомитов у кур (~13 генераций), хотя значительно больше, чем для 31 сомита у рыбок данио (~2.8 генераций). Следовательно, чрезвычайно большое количество сомитов у змей по сравнению с таковым у др. амниот, не является прежде всего результатом большого количества генераций.

Наконец, мы исследовали основу необычайно большого количества LFNG полос. наблюдаемых у эмбрионов змей. Количество полос отражает количество циклов часов, с помощью которых клетки переднего конца PSM отстают от таковых в задней части PSM. Путем измерения распределения полосок, можно предположить как изменяется скорость часов в зависимости от позиции в PSM26. Используя измерение распределения полосок LFNG у эмбрионов corn змей, мы установили диаграмму. отражающую снижение скорости генных осцилляций в PSM. График для змей и рыбок данио почти идентичен (Fig. 4g), это указывает на то, что механизм. контролирующий замедление циклических генных осцилляций сходен у двух видов. Тот же самый способ замедления генных осцилляций у змей и рыбок с очень разными количествами PSM полос объясняется разными соотношениями скорости осциллятора по отношению к скорости роста (Supplementary Box 2). Чем быстрее идет осциллятор относительно скорости роста PSM, тем больше полос циклической генной экспрессия наблюдается

Т.о., наши данные показывают, что базовый clock-and-wavefront механизм оперирует в соответствии со сходными принципами у змей. кур, мышей и рыбок данио. У всех 4-х видов сомитогенез заканчивается при прогрессивном укорочении PSM. Это укорочение, по-видимому, отражает постепенное угасание сигналов, которые поддерживают PSM характер клеток на конце хвоста эмбриона²⁷. У эмбрионов кур и мышей окончание сомитогенеза является активным процессом, ассоциированным с обширной клеточной гибелью в хвостовой почке²⁸. Апоптоз клеток хвостовой почки, ведущий к укорочению оси, может быть индуцирован воздействием ретиноевой кислоты²⁹; т.о., возможно, что близость передней части домена ретиноевой кислоты к хвостовой почке, вызываемая за счет укорочения PSM, запускает гибель предшественников параксиальной мезодермы. Следовательно, укорочение PSM может объяснить арест удлинения оси и завершение сомитогенеза. У рыбок данио переключение на укорочение PSM происходит очень рано по сравнению с таковым у амниот и это коррелирует с небольшим количеством сомитов. У амниот переключение на укорочение PSM происходит в месте перехода туловища и хвостовой области, указывая тем самым, что оно может быть под контролем региональных регуляторов, таких как HOX гены. Наша модель указывает на то, что количество генераций PSM при которых сомитогенез продолжает изменяться относительно мало среди амниот. Напротив, в ходе эволюции произошли серьёзные изменения в соотношении скорости часов сегментации со скоростью онтогенетического роста. Изменчивость этого соотношения объясняет столь большое эволюционное расхождение в количестве сегментов у амниот.

A Janelle Weaver

Window into the Workings of the Segmentation Clock
PLoS Biol 10(7): e1001366. doi:10.1371/journal.pbio.1001366

Во время развития циклическая экспрессия генов является критической для регуляции последовательного образования сегментов тела у позвоночных, включая и рыбок данио. Гены члены семейства hes/her экспрессируются ритмическим образом во время этого процесса и осцилляции этой генетической сети, известные как сегментационные часы, управляют сегментацией и контролируют скорость, с которой формируются сомиты. Модели источника осцилляций у рыбок данио сегментационных часов предполагают наличие негативной петли обратной связи, связанной с генами her1 и her7.

Figure 1. How timing directs anatomy: the pacemaking circuits at the core of the zebrafish embryo's segmentation clock contain two negative feedback loops, consisting of Her1:Her1 and Her7:Hes6 protein complexes.

В этом номере PLoS Biology, группа Andrew Oates of the Max Planck Institute of Molecular Cell Biology and Genetics пролила свет на генетическую сеть, которая регулирует сегментацию у рыбок данио. Исследователи установили, что две негативные петли обратной связи, состоящие из Her1:Her1 и Her7:Hes6 белковых комплексов образуют основу кругооборота (circuit) продукции пульсов сегментационных часов. Существование одновременно двух петель делает этот важный онтогенетический процесс устойчивым по отношению к генетическим и внешнесредовым нарушениям.

В серии биохимических экспериментов они установили, что Her1, Her7 и Hes6 образуют пары, чтобы сформировать все типы белковых комплексов, но только Her1:Her1 и Her7:Hes6 комплексы соединяются с ДНК, чтобы регулировать экспрессию циклических генов-тех, которые экспрессируются в виде осциллирующих паттернов. Эти два типа комплексов соединяются с одной и той же последовательностью ДНК, чтобы регулировать циклические гены her1, her7 и dlc.

Затем исследователи тестировали функцию петель обратной связи Her1:Her1 и Her7:Hes6 у рыбок данио. У эмбрионов, которые были генетически модифицированы, отсутствием или hes6 или her1, циклических генов, экспрессирующихся осцилляторным способом, сегментация была в основном нормальной, поскольку интактная петля была способна компенсировать функцию разрушенной петли. Напротив, когда одновременно нарушались обе петли в результате нарушения her1 и hes6 или her1 и her7, то экспрессия генов не осциллировала и эмбрионы не имели нормальных сегментов. Эти результаты указывают на то, что две перекрывающиеся, параллельные петли обратной связи формируют стержневой циркуит сегментационных часов у рыбок данио.

Но модель двух петель более сложная, чем ожидалось. Неожиданно рыбки данио с мутациями her7 не формировали нормальных сегментов но эти дефекты исчезали по большей части, когда мутации her7 существовали одновременно с hes6 мутациями. Математические модели подтвердили, что в отсутствие Her7, большая часть Hes6 остается свободной для связи с Her1, это ведет к уменьшению количества комплексов Her1:Her1. Этот процесс мешает функционированию петли обратной связи Her1:Her1, затухает осциллирующая экспрессия генов и это ведет к дефектам сегментации. Эти результаты указывают на то, что Hes6 играет доминирующую роль в управлении сегментацией, в зависимости от доступности партнеров по связыванию для белка. Кроме того, математические модели показали, что Hes6 меняет стабильность осциллирующих белков и этот процесс влияет на скорость сегментации.

Деликатный баланс белков Hes/Her необходим для часов сегментации, чтобы функционировать в точности так, как это происходит в генетической сети, контролирующей циркадные часы у мышей. Более того, семейство Hes/Her циклических генов участвует в сегментации как у мышей, так и кур. Т.о., новый принцип сегментационных часов может лежать в основе множественных биологических часов и генетических регуляторных сетей у ряда видов.

Schrцter C, Ares S, Morelli LG, Isakova A, Hens K, et al. (2012) Topology and Dynamics of the Zebrafish Segmentation Clock Core Circuit. doi:10.1371/journal.pbio.1001364