Principles of bioactive lipid signalling: lessons from sphingolipids
Yusuf A. Hannun & Lina M. Obeid Nature Reviews Molecular Cell Biology 9, 139-150 (February 2008) | doi:10.1038/nrm2329
It has become increasingly difficult to find an area of cell biology in which lipids do not have important, if not key, roles as signalling and regulatory molecules. The rapidly expanding field of bioactive lipids is exemplified by many sphingolipids, such as ceramide, sphingosine, sphingosine-1-phosphate (S1P), ceramide-1-phosphate and lyso-sphingomyelin, which have roles in the regulation of cell growth, death, senescence, adhesion, migration, inflammation, angiogenesis and intracellular trafficking. Deciphering the mechanisms of these varied cell functions necessitates an understanding of the complex pathways of sphingolipid metabolism and the mechanisms that regulate lipid generation and lipid action
Рис.1. | An overview of the roles of sphingolipids in biology.
Рис.2. | Sphingolipid metabolism and interconnection of bioactive sphingolipids.
Рис.3. | Parallel networks of sphingolipid signalling.
Рис.4. | Transport and transbilayer movement of bioactive sphingolipids.
Рис.5. | Examples of ceramide signalling pathways and their role in stress responses.
Хотя концепция 'биоактивных липидов' - широко трактуется как изменения в уровнях липидов, которые вызывают функциональные последствия - исследования проводятся последние 20 лет. В своем пионерском исследовании в 1950s, Hokin and Hokin наблюдали быстрый оборот inositol phospholipids на срезах поджелудочной железы, который стимулировался acetylcholine1. Однако значение этих наблюдений для клеточной функции оставалось не замеченным в течение нескольких лет до тех пор diacylglycerol () и inositol-1,4,5-trisphosphate (Ins(1,4,5)P3) не оказались вовлеченными в специфическую регуляцию (PKC) и высвобождения calcium 2, соотв., приводя к различным клеточным реакциям. Демонстрация прямой активации PKC с помощью липида DAG сцементировала идею, что липиды (с уже установленной ролью в промежуточном обмене веществ) могут регулировать передачу сигналов в клетке.
В последние 4 десятилетия были также определены eicosanoids (и др. продукты метаболизма arachidonic кислоты) как ключевые молекулы меж- и внутриклеточной передачи сигналов липидами, которые прежде всего участвуют в опосредовании или разрешении воспалительных реакций3. Дальнейшие исследования показали, что многие минорные продукты метаболизма фосфолипида inositol, такие как phosphatidylinositol-3,4,5-trisphosphate (PtdIns(3,4,5)P3), также служат ключевыми промежуточными звеньями в передаче клеточных сигналов. Др. производными glycerolipid являются регуляторные молекулы, включая phosphatidic acid (PA), monoacylglycerols и anandamide (кандидаты на роль лигандов для cannabinoid рецепторов), lyso-phosphatidic acid и platelet activating factor (PAF).
Др. группой биоактивных липидов, которая вышла на передний план в последнее время, это sphingolipids. Первым был идентифицирован sphingosine, который вызывает плейотропные эффекты на протеин киназы и др. мишени. Sphingosine и родственные sphingoid основания играют роль в регуляции актинового цитоскелета, эндоцитозе, клеточного цикла и апоптоза4 (Fig. 1). Ещё большее внимание было уделено сфинголипидам ceramide и sphingosine-1-phosphate (S1P). Ceramide обеспечивают многие реакции на клеточные стрессы, включая регуляцию апоптоза5 и клеточного старения6, тогда как S1P играет критическую роль в выживании клеток, миграции клеток и воспалении7 (Fig. 1). Недавним дополнением к семейству биоактивных сфинголипидов явились ceramide-1-phosphate (C1P, который играет роль в воспалении и везикулярном трафике 8-10), glucosylceramide (который участвует в post-Golgi трафике и резистентности к лекарствам11,12), lyso-sphingomyelin и dihydroceramide. в
В дополнение к огромному количеству клеточных процессов, с которыми ассоциируют сфинголипиды, дальнейшие уровни сложности передачи сигналов сфинголипидов только начинают расшифровываться. Подобная сложность возникает в результате метаболических взаимных соединений биоактивных липидов (Fig. 2), так что изменения в одном липиде вызывают метаболические 'ripple' эффекты с функциональными последствиями. Более того, энзимы липидного метаболизма (вхождение в эти пути) часто являются гидрофобными мембранными белками, которые не поддаются простым биохимическим и клеточным исследованиям. Варьирующие биофизические свойства регуляторных липидов также вносят усложнения, связанные с из субклеточной локализацией и механизмами действия.
Поэтому на базовом уровне необходимо вычленить различные специфические механизмы, с помощью которых регулируется метаболизм сфинголипидов и молекулярные механизмы, с помощью которых продукты биоактивных липидов передают свои соотв. сигналы. На продвинутом и липид-специфическом уровне такое понимание нуждается в знании метаболической организации энзимов метаболизма сфинголипидов и их взаимодействия, субклеточную и субмембранную локализацию липидами-обеспечиваемых путей, метаболическую трансформацию биоактивных липидов и интеграцию или координацию реакций в целом.
Introducing the sphingolipid family
Метаболизм сфинголипидов в основном наблюдается у эукариот, но он обнаружен и в роде бактерий Sphingomonas. Пути метаболизма сфинголипидов имеют уникальную метаболическую точку входа (serine palmitoyl transferase; SPT), которая формирует первый сфинголипид на de novo пути и уникальную точку выхода, , которая разлагает S1P на non-sphingolipid молекулы. Множественные метаболические ступени между ними составляют очень сложную сеть, которая соединяет метаболизмы многих сфинголипидов (Fig. 2). В этой сети ceramide (и dihydroceramide в меньшей степени) могут рассматриваться как метаболический центр (hub), т.к. он занимает центральное положение в биосинтезе и катаболизме сфинголипидов.
Короче, сфинголипиды синтезируются de novo из serine и palmitate, которые конденсируются в форму 3-keto-dihydrosphingosineблагодаря действию SPT13,14. В свою очередь, 3-keto-dihydrosphingosine редуцируется до dihydrosphingosine, это сопровождается ацетилированием с помощью (dihydro)- (также известной как Lass или CerS)15. Ceramide формируется за счет десатурации dihydroceramide16 (Fig. 2).
В путях биосинтеза сфинголипида (Fig. 2), ceramide может быть фосфорилирован с помощью ceramide kinase17, гликозилирован с помощью glucosyl или galactosyl ceramide synthases18 или может получить phosphocholine головку от phosphatidylcholine (PC) при биосинтезе sphingomyelin (SM) благодаря действию SM synthases19, которая кроме того используется для генерации DAG из PC.
Разрушение комплекса сфинголипидов (Fig. 2) осуществляется благодаря действию специфических hydrolases, приводящих к образованию glucosylceramide и galactosylceramide. В свою очередь специфические beta-glucosidases и galactosidases гидролизуют эти липиды, чтобы регенерировать ceramide20,21. Разрушение SM катализируется одной из нескольких sphingomyelinases (SMases)22. Сюда входят , и .
Ceramide может быть разрушен с помощью одной из многих 23, 24, приводящих к образованию sphingosine, который , по-видимому, имеет одну из двух судеб. Sphingosine может быть 'спасен' или переработан в сфинголипид (Box 1) или он может быть фосфорилирован с помощью одной из двух sphingosine kinases25, и (Fig. 2). Продукт S1P может быть дефосфорилирован, чтобы регенерировать sphingosine благодаря действию специфических внутриклеточных S1P фосфатаз26 и возможно неспецифических внеклеточных lipid phosphate phosphatases27,28. Альтернативно, S1P lyase может необратимо расщеплять S1P, чтобы генерировать ethanolamine phosphate и hexadecenal (который, в свою очередь, может быть редуцирован до palmitate и впоследствии повторно включаться в пути липидного метаболизма)29.
Complexities of sphingolipid signalling
Концептуализация передачи клеточных сигналов в основном базировалась на канонической cyclic AMP парадигме, при этом путь линейной передачи сигнала состоит из рецепторов, cyclase, cAMP и cAMP-зависимой протеин киназы, при этом сигнальную функцию выполняет cAMP. Однако передача сигналов сфинголипидов обнаруживает дополнительные слои сложности по сравнению с путем cAMP. В отличие от относительной простоты биохимически изолированного пути cAMP, энзимы липидного метаболизма интимно связаны др. с др. и образуют взаимосвязанную сеть (Fig. 2), которая служит для регуляции не только уровней индивидуальных биоактивных липидов, но и также их метаболических взаимопревращений. Более того, имеются множественные пути, которые могут оперировать параллельно (Fig. 3). Также в отличие от растворимой молекулы cAMP биоактивные сфинголипиды обладают гидрофобными свойствами; поэтому физиологическое окружение биоактивных липидов, по большей части, ограниченного биологическими мембранами. Итак, критический и уникальный набор свойств действует в клетках, чтобы определить субклеточную локализацию сфинголипидами-обеспечиваемых путей и транспорт биоактивных молекул через и между мембранами.
The interconnectivity of sphingolipid metabolism. Беспрецендентная сложность биохимических взаимосвязей сфинголипидов позволяет клеткам организовывать клеточные реакции путем регулирования взаимных превращений сфинголипидов. Напр., активация SMase генерирует ceramide в качестве непосредственного липидного продукта. Однако последующее действие ceramidase, ceramide kinase, SM synthase или glucosylceramide synthase в принципе может превратить ceramide сигнал в один из тех, что обеспечивается с помощью sphingosine (и затем S1P), C1P, DAG или glucosylceramide, соотв. (Fig. 2).
Интересно, что клеточные уровни этих биоактивных sphingolipids делают эти сценарии очень возможными30. Напр., в большинстве типов клеток SM присутствует в концентрациях, которые на порядок величин выше, чем таковые ceramide; следовательно, небольшие изменения в SM могут приводить к выраженным изменениям в ceramide. Кроме того, ceramide часто обнаруживаются в концентрациях, которые больше, на порядок величин выше, чем концентрация sphingosine. Следовательно, непосредственный гидролиз лишь 3-10% вновь сгенерированных ceramide может удваивать уровни sphingosine. Сходным образом фосфорилирование 1-3% sphingosine может удваивать уровни S1P (Fig. 1).
Учитывая эти метаболические данные, возможно, что когда sphingolipid энзим участвует в процессе, то непосредственный продукт этого энзима может не быть актуальным сигнальным эффектором. Следовательно, важно определить, какой липидный продукт или субстрат действительно обеспечивает сигнал. Напр., воздействуя SMase или SKs на специфические клеточные реакции, нельзя сделать непосредственное заключение, что ceramide или S1P непосредственно обеспечивают подобную функцию. К счастью, сегодня доступны инструменты и подходы, чтобы вычленить эти процессы. Это и высоко чувствительные методы масс-спектрометрии для анализа сфинголипидов30,31, молекулярные инструменты, которые были разработаны для полной молекулярной идентификации всех известных энзимов сфинголипидного метаболизма и RNA interference, которая успешно применяется в клеточной биологии для изучения лимидного метаболизма и функции. в
Parallel networks of sphingolipid signalling. разнообразие некоторых путей сфинголипидного метаболизма генерирует ещё один слой сложности, который накладывается на основную кальку сфинголипидного метаболизма. Это лучше всего иллюстрируется ceramide synthases15 (Fig. 3). Сегодня известны 6 индивидуальных ceramide synthases, катализирующих образование dihydroceramides или ceramides (в зависимости от того, является ли субстратом dihydrosphingosine или sphingosine, соотв.). Важно. что эти ceramide synthases обнаруживаю разные предпочтения в отношении разных fatty acyl-CoA субстратов и, следовательно, они генерируют разные ceramides с уникальными N-сцепленными жирными кислотами. Отдельные керамиды могут располагаться в разных субкомпартментах и могут обеспечивать разные функции. В качестве др. примера, и acid SMase и neutral SMase могут действовать на SM, чтобы генерировать ceramide. Однако эти два энзима регулируются по-разному, локализуются в разных субклеточных компартментах (Box 1) и м.могут аже генерировать ceramides с разными молекулярными свойствами.
Subcellular localization of bioactive sphingolipids. Большинство энзимов сфинголипидного метаболизма обнаруживает специфическую субклеточную локализацию(и) (Box 1) и это оказывает выраженные эффекты на передачу сигналов и регуляторные функции генерируемых сфинголипидов. Напр., acid SMase локализуется в первую очередь в эндолизосомном пути, но при определенных условиях она может также перемещаться на плазматическую мембрану, преимущественно на наружный листок32. Neutral SMase2, по-видимому, локализуется на внутреннем листке плазматической мембраны. SK1 и SK2, по-видимому, действуют преимущественно на sphingosine субстрат, который находится в мембранах, которые необходимы для транслокации SK энзимов из их цитозольного компартмента в плазматическую мембрану (и др. мембраны) и соединяются с анионными липидами33. Следовательно, наиболее вероятно, что SK энзимы имеют множественные субклеточные локализации, которые и д. диктовать разные функциональные ответы.
Эти данные вкупе плохой растворимостью липидов (Box 2) в клетках накладывают четкие ограничения на субклеточную локализацию биоактивных липидов. В отсутствие специфических механизмов транспорта этих липидов, место генерации биоактивных липидов скорее всего диктует и место действия.
Биоактивные сфинголипиды (и липиды в целом) могут быть подразделены на отдельные классы, которые могут быть различены по их биофизическим свойствам (Box 2). Некоторые биоактивные липиды. такие как C1P и phosphatidylinositol-3-phosphate, несут ионные заряды при нейтральном pH и содержат две гидрофобные цепи. Эти липиды, скорее всего, располагаются в компартментах своей генерации и вряд ли проходят (flip) спонтанно через двойной слой. Вторая группа, которая включает ceramide и DAG, состоит из нейтральных гидрофобных молекул, которые также ограничены своими компартментами образования, но могут с готовностью flip-flop через мембраны34.
Третья группа состоит из одноцепочных липидов, сюда входят sphingosine, S1P, lyso-sphingomyelin и lyso-phosphatidic acid. Эти молекулы обладают достаточной растворимостью в воде, чтобы перемещаться между мембранами. Напр., было подсчитано. что приблизительно 70% sphingosine находится в мембранах при физиологическом pH, а остальные 30% растворtys35. Эти молекулы могут, следовательно, быстро уравновешиваться в мембранах. Более важно, учитывая их amphipathic природу (т.е. растворимость в воде и органических растворителях), эти молекулы могут осуществлять surfactant активность. Следовательно, не является неожиданным, что их клеточные уровни обнаруживают тенденцию быть наинизшими среди всех биоактивных липидов.
Transport and flipping of bioactive sphingolipids.Для биоактивных сфинголипидов, чтобы осуществлять функциональные реакции, они д. быть способными взаимодействовать с соотв. непосредственными медиаторами. Субклеточное ограничение биоактивных сфинголипидов и некоторых их мишеней ставит вопросы о том, как взаимодействующие партнеры способны встречаться (Fig. 4). Напр., S1P возможно генерируется на внутреннем листке плазматической мембраны в ответ tumour necrosis factor-a (TNFa) и др. агонисты36, 37. Кажется, что он достигает наружного листка плазматической мембраны, чтобы взаимодействовать с S1P рецепторами (S1PRs)38. Вдоль этого пути два члена , как полагают регулируют транспорт S1P (Fig. 4). Cystic fibrosis transmembrane regulator (CFTR) участвует в интернализации S1P из плазматической мембраны39, тогда как ABC transporter ABCC1 облегчает утечку (efflux) S1P40.
, как было показано, влияет на транспорт ceramide с
его места синтеза в эндоплазматическом ретикулеме (ER) в Golgi и необходим для синтеза SM (но не для синтеза glucosylceramide)41 (Box 1). Принимая во внимание взаимодействие CERT с phosphatidylinositol phosphates и его потенциальную регуляцию с помощью фосфорилирования, эта ступень метаболизма ceramide может регулироваться с помощью путей inositol липидного метаболизма и с помощью протеин киназ42 и фосфатаз.
Как нейтральный липид ceramide, как ожидается, с легкостью flip-flop поперек мембран , и в самом деле, исследования на модельных мембранах и мембранах эритроцитов подтвердили эти предсказания34 (Fig. 4). Однако пока неясно, могут ли ceramide, которые образуются в более сложных биологических мембранах flips с той же самой эффективностью, или организация ceramide в микродомены (т.е. специализированные липидные домены в плазматической мембране; see the review by van Meer and colleagues in this issue) может ограничивать перемещение (flipping) ceramide из наружного листка во внутренний. Ограниченный flipping (или flopping из внутреннего в наружный листок ) может оказывать огромное влияние на сигнальные функции ceramide. Напр., ceramide, который генерируется с помощью acid SMase в наружном листке может осуществлять до. функции по сравнению с ceramide, который генерируется во внутреннем листке с помощью neutral SMase2 (Ref. 22). в
Итак, биофизический и метаболический анализ, представленный выше вносит уровень сложности, который не обнаруживается в др. сигнальных путях. Имеется, по крайней мере, 26 самостоятельных энзимов, которые действуют на ceramide или как на субстрат или продукт, и которые, следовательно, обладают потенциалом регулировать уровни ceramide. Эти энзимы обнаруживают специфические и варьирующие субклеточные локализации. Более того, ceramide сам по себе является семейством близко родственных молекул с, по крайней мере, 50 разными видами молекул, которые могут быть различены по их acyl цепочкам, гидроксилированию и десатурации (Fig. 3). Следовательно, уровни ceramide могут регулироваться в разных компартментах посредством разных механизмов в разное время.В таком случае ceramides д. осуществлять разные функции.
Mechanisms of action: ceramide and S1P
Понимание как биоактивные липиды продуцируют и как они передают сигналы, нуждается в вычленении механизмов, с помощью которых, эти липиды действуют. Можно представить себе два генеральных механизма действия липидов: межлипидные взаимодействия, причем кандидаты биоактивных липидов затрагивают структуру мембран и/или взаимодействие мембранных белков с мембранным бислоем (see the review by van Meer and colleagues in this issue); или липид-белковые взаимодействия, причем изменения в липидах модулируют функцию белков мишеней, которые специфически взаимодействуют с кандидатами биоактивных молекул.
Физиологические уровни биоактивных липидов четко влияют (или даже диктуют) механизмы их действия. Следы липидов, таких как S1P, взаимодействуют с рецепторами высокого сродства, которые способны ощущать их низкие уровни. Липиды, которые обнаруживаются в промежуточных концентрациях в мембранах, такие как ceramide или DAG (которые часто составляют 0.1-1.0% от общего количества мембранных липидов), действуют на мишени с промежуточным сродством. Напротив, трудно представить, как обильные липиды, такие как SM, могут иметь специфические мишени, т.к. сродство взаимодействий д. быть низким. Это не исключает белков, которые могут связывать эти липиды с высоким сродством, но в этом случае такие белки не д. быть способны ощущать изменения в уровнях этих липидов. Высокие уровни этих липидов, однако придают им способность изменять общие свойства и субструктуру мембран, если и когда эти уровни изменяются. Для ceramide и S1P интерес сконцентрировался на определении прямых белков мишеней. Несколько белков кандидатов, как было установлено, взаимодействуют с ceramide in vitro и in cells (Fig. 5). Сюда входят ceramide-activated Ser-Thr phosphatases (CAPPs), такие как PP1 and PP2A, которые связывают ceramide in vitro43. Они умеренно активируются с помощью ceramide и обнаруживают предпочтение к естественным стереоизомерам. Исследования клеток связали действие ceramide с CAPPs и индукцию дефосфорилирования белка. Напр., ceramide-индуцирующие агенты (такие как TNFa или нагрузка клеток palmitate) индуцируют дефосфорилирование продукта гена retinoblastoma RB44, PKCδ 45, protein kinase B ( или AKT)46 и др. белки ceramide-зависимым способом. Однако , чтобы продемонстрировать непосредственную клеточную активацию фосфатаз с помощью ceramide, необходимы экспериментальные доказательства (напр., наблюдение транслокаций). Определение специфических сайтов связывания для такого процесса активации д. позволить улучшить понимание того, как эти взаимодействия происходят и могут также предоставить специфические инструменты для исследования этих путей.
Кроме того, ceramide, как было показано, активируют PKCζ47, 48, киназу KSR49 и cathepsin D50. Последний считается специфической мишенью для лизосомно сгенерированного ceramide и может объединять действие лизосомной acid SMase с митохондриальным путем апоптоза50. Активация PKCζ с помощью ceramide участвует в регуляции мембранного потенциала. ингибировании AKT и в про-апоптических функциях48, 51.
S1P является одним из наиболее растворимых сфинголипидов и присутствует в низких наномолярных концентрациях в клетках (но в высоких наномолярных концентрациях в сыворотке, где он ассоциирует с липопротеинами и альбумином52). Он взаимодействует с S1PRs53, которые являются высокого сродства G protein-coupled receptors (GPCRs) и пока идентифицирован только один известный рецептор для S1P таким способом. Пять S1PRs (S1PR1-5) обнаруживают избирательную тканевую экспрессию, которая является критической для их биологических функций и использует хорошо известный путь передачи внутриклеточных сигналов GPCR, чтобы обеспечить их специфические эффекты (Fig. 6). S1P осуществляет также, по-видимому, S1PR-независимые действия внутриклеточно, такие как индукция высвобождения кальция8, хотя механизмы этого остаются неизвестными. Т.к. внутриклеточные молекулярные мишени для S1P не были идентифицированы, то его внутриклеточная роль остается предметом спекуляций и привлекает значительны интерес.
Sphingolipid-mediated cell regulation
Поиск биоактивных сфинголипидов продолжается и растет с ускорением, более 18,000 ссылок в PubMed на ceramide, sphingosine и S1P, в основном в связи с их сигнальными функциями. В данном разделе мы сконцентрируемся на трех специфических путях передачи сигналов ceramide и на SK1-S1P пути в воспалении и ангиогенезе, чтобы представить ключевых игроков и предоставить проблески нашего сегодняшнего знания обеспечиваемой сфинголипидами клеточной регуляции. в
De novo synthesis of sphingolipids and stress responses. Путь биосинтеза сфинголипидов de novo, который находится в ER, возник как ключевой механизм в клетках эукариот для регуляции уровней ceramide и др. сфинголипидов. В клетках млекопитающих de novo синтез ceramide усиливается в ответ на некоторые химиотерапевтические агенты, такие как etoposide и daunorubicin54, 55, и др. индукторы апоптоза, такие как стимуляция B-клеточных рецепторов56. Про-апоптический FAS путь стимулирует de novo синтез, который, как было показано, активирует PP1. Это ведет к дефосфорилированию SR белков, которые являются регуляторами сплайсинга РНК, и функция которых регулируется с помощью фосфорилирования57. Это сдвигает баланс про- и анти-апоптических мРНК в пользу про-апоптической caspase-9 и BCL-X57. в
Интересно, что de novo путь метаболически приспособлен отвечать на изменения в концентрациях serine и palmitate, поскольку SPT обладает Km значением для двух субстратов, которые находятся в пределах своих обычных внутриклеточных концентраций58 (Fig. 1). В самом деле, недавние исследования на дрожжах продемонстрировали, что тепловые стрессы индуцируют острый приток serine в ER, который управляет de novo синтезом59. Активация этого пути у дрожжей приводит к временному накоплению sphingoid оснований, затем с помощью sphingoid оснований phosphates и затем ceramide. Многочисленные исследования показали, что sphingoid основания, которые генерируются на этом пути, обеспечивают специфические реакции на тепловые стрессы60, сюда входят регуляция nutrient permeases61, цитоскелетные изменения62, арест клеточного цикла59 и трансляция РНК63.
Регуляция синтеза de novo с помощью palmitate может играть ключевую роль в диабете и метаболическом синдроме (Fig. 5a). Появляющиеся доказательства подтверждают, что загрузка palmitate ведет к накоплению ceramide, который активирует PP2A и ведет к дефосфорилированию и инактивации AKT46, ключевого медиатора в передаче сигналов инсулина и в метаболическом контроле. Ceramide может оказывать дополнительный эффект на AKT и на др. мишени, которые сообща ведут к ухудшению чувствительности к инсулину и к гибели клеток островков64, 65 (процесс назван lipoptosis) и могут вносить вклад в др. диабетические осложнения. Недавнее исследования на мышах продемонстрировало, что ингибирование синтеза ceramide или фармакологическими воздействиями или генетическими манипуляциями предупреждает резистентность к инсулину, индуцируемую с помощью жирных кислот, ожирения или glucocorticoids65.
Хотя значение этого пути сегодня оценено, некоторые ключевые вопросы остаются нерешенными. Повышенный приток (flux) благодаря пути de novo не обязательно ведет к накоплению, до тех пор, пока дальнейшая метаболическая трансформация (напр., в SM, C1P или glucosylceramide) не будет ограничена или ингибирована (как это было показано в некоторых случаях апоптоза, в которых SM synthase и glucosylceramide synthase (GCS) супрессируются). Также остается неясным, действует ли путь de novo исключительно в ER или также и в др. ER-ассоциированных мембранах (таких как ассоциированные с митохондриями мембраны ). Локализация de novo пути возможно сможет увязать её с регуляцией ER стресса, но это ещё предстоит оценить.
Acid SMase and the salvage pathway in stress signalling. Множественные стрессовые стимулы, такие как УФЛ и ионизирующая иррадиация, ligation of death рецепторов и химотерапевтические агенты (включая platinum, paclitaxel и histone deacetylase ингибиторы) , как было показано, активируют acid SMase, обычно в течение нескольких минут после стимуляции клетки (Fig. 5b). Это было продемонстрировано прежде всего путем показа повышенной активности энзима in vitro и т.о., это является указанием на некую пост-трансляционную модификацию кислой acid SMase. В немногих исследованиях активация, SMase, как было показано, сопровождается транслокацией на плазматическую мембрану и одновременно генерацией ceramide66.
Помимо этих корреляций некоторые исследования предоставили более прямые доказательства вовлечения кислой SMase в генерацию ceramide и в нижестоящие реакции или посредством использования генетических мутантов по энзиму (полученному от пациентов с )67, нокаутных мышей, которые лишены acid SMase68, small interfering (si)RNA-обусловленный нокдаун69 или фармакологическими ингибиторами70, таким как один из tricyclic amines, desipramine или imipramine. Однако такие фармакологические исследования необходимо интерпретировать с осторожностью, т.к. эти ингибиторы имеют др. мишени, включая acid ceramidase71. Исследования по нокауту или нокдауны генов сегодня четко показывают участие acid SMase в обеспечении апоптических и стрессовых реакций на ионизирующую и УФЛ ионизацию68, 72, и в снижении концентраций FAS лигандов73. Однако др. исследования продемонстрировали повышенную чувствительность к FAS, но пониженную митогенную стимуляцию Т клеток у нокаутных мышей74.
Механизмы, которые вовлекаются в активацию acid SMase в ответ на стрессовые агенты изучены плохо. Недавние результаты показали, что активируется реактивными видами кислорода и вообще более специфически nitrosative стрессами75. Др. недавнее исследование предоставило доказательства регуляции кислой SMase с помощью фосфорилирования в ответ на активацию , и это было задействовано для обеспечения эффектов радиации УФЛ на активацию кисловй SMase72. Эти исследования начинаю указывать на важные механистические связи между путями стрессовых реакций, которые как полагали ранее являются самостоятельными (acid SMase, nitrosative stress и PKCδ).
Ceramide, которые генерируются с помощью acid SMase, как было предположено, располагаются или в лизосомах или на плазматической мембране (Box 1). Обе локализации объяснимы, т.к. кислая SMase, как было твердо показано, существует в обоих субклеточных местах. В лизосомах ceramide взаимодействуют непосредственно с протеазой cathepsin D и активируют её, это, по-видимому, приводит к расщеплению и активации про-апоптического белка BID50 (Fig. 5b). На плазматической мембране действие керамидов изучено хуже, но предполагается участие в capping рецепторов (образовании микроскопических кластеров) и/или в образовании микродоменов70.
Для иллюстрации сложной природы метаболизма, недавно было показано, что активация кислой SMase в ответ на форболовые эфиры также ведет к сопутствующему увеличению образования ceramide посредством пути salvage (или рециклинга) 76. На этом пути, sphingosine повторно превращается в ceramide благодаря действию ceramide synthases (Box 1). Это может объяснить некоторые кажущиеся расхождения в литературе, согласно которым и acid SMase и de novo путь (базирующийся на ингибировании ceramide synthase с помощью fumonisin B1) участвуют в некоторых клеточных реакциях (напр.. на doxorubicin). Важно, что fumonisin B1 ингибирует ceramide synthases и делает неотличимым de novo синтез от рециклинга (Box 1). Плэтому и было предположено, что acid SMase связана с рециклингом.
Neutral SMase2 in cytokine action. Многочисленные исследования были связаны с активацией нейтральной SMase, чтобы вызывать реакции на некоторые внеклеточные цитокины и стрессы77, а список индукторов обнаруживает существенное перекрывание с активаторами кислой SMase. Однако прогресс в молекулярном вычленении путей, обеспечиваемых SMase, только начинается после недавней идентификации neutral SMase-2 (nSMase2) в качестве bona fide sphingomyelinase78, 79. Важно. что нокаут энзима, как было установлено, приводит к низкому росту, а естественные мутации в nSMase2 (fro/fro мыши) приводят к ломкости костей 80, 81.
nSMase2 участвует в нескольких клеточных реакциях. Она остро активируется с помощью цитокинов TNFa и interleukin (IL)-1 и, как было показано, обеспечивает эффекты IL-1 на передачу сигналов (в фосфорилировании c-Jun N-terminal kinase (JNK))82, и эффекты TNFa на индукцию генов (вовлекая endothelial nitric oxide synthase (eNOS))83. Энзим индуцируется также во время старения мышиных гепатоцитов и обеспечивает снижение чувствительности гепатоцитов к передаче сигналов IL-184. nSMase2 , как было показано, обеспечивает, по крайней мере, частично эффекты TNFa на клеточную адгезию и миграцию85.
Некоторые исследования выявили участие nSMase2 в цитотоксическом действии amyloid peptide-beta, демонстрируя ослабление этих реакций в клетках. в которых nSMase2 была послана в нокдаун с помощью siRNA86, 87. Долговременная индукция энзима наблюдалась после слияния клеток (ген энзима был первоначально клонирован как cell confluence-associated (CCA) ген88) и участвовала в аресте клеточного цикла, который индуцировался после контакта клеток89.
Механизмы участвующие в активации nSMase2 определены недостаточно. TNFa индуцирует транслокацию энзима в плазматическую мембрану, с помощью механизма, который зависит от активации p38 mitogen-activated protein kinase (MAPK)85. В слившихся клетках и тканевых клетках (гепатоцитах), nSMase2 располагается базально на плазматической мембране. Важно, что она, по-видимому, локализуется на внутреннем листке плазматической мембраны, где предположительно находится минорный пул SM90.
SK1-S1P in inflammation and angiogenesis. Подавляющее количетво первичной литературы устанавливает участие SK1-S1P-S1PR оси во многих сигнальных путях38, 91. Многие ростовые факторы, такие как epidermal growth factor и platelet-derived growth factor, также как цитокины TNFa и IL-1, остро активируют SK1, приводя к временному повышению уровней S1P (обычно в 2-3 раза)25. Эта стимуляция нуждается в PKC92, phospholipase D (PLD)93 и/или extracellular signal-regulated kinase (ERK) MAPKs, которые действуют выше SK1 (Ref. 94). PKC может действовать непосредственно или косвенно посредством PLD и ERK, тогда как считается, что ERK непосредственно фосфорилирует SK1 по остатку Ser225 (Ref. 94), это необходимо для его транслокации в плазматическую мембрану. PLD генерирует phosphatidic кислоту, которая может непосредственно связывать SK1 и приводить к его ассоциации с мембраной33.
S1P, который генерируется с помощью этого процесса, обнаруживается преимущественно во внеклеточном пространстве и учитывая его zwitterionic характер, эти результаты подтверждают необходимость в активном механизме транспорта. В самом деле, недавно было предположено, что ABC транспортер ABCC1 необходим для транспорта S1P из внутреннего листка плазматической мембраны на внешнюю сторону клетки40. Альтернативно, SK1 сам также обнаруживает внеклеточное положение. Оказавшись вне клетки, S1P связывает S1PRs с высоким сродством и запускает типичные GPCR сигнальные пути95 (Fig. 6).
На клеточном уровне путь SK1-S1P изучен лучше в связис действием цитокинов, со множественными функциями, связанными с про-воспалительными действиями TNFa (и IL-1). В течение 10 мин. стимуляции TNFa, SK1 активируется с помощью механизма, который зависит от TRAF (TNFa receptor-associated factor) и ERK96. Исследования нокдауна показали участие SK1 в обеспечении эффектов TNFa на индукцию cyclooxygenase-2 (COX2), продукцию prostaglandins37, 97, индукцию адгезивных молекул98 и активацию eNOS83. Интересно, что нокдаун S1P phosphatase или S1P lyase (ключевых энзимов, которые метаболизируют S1P) увеличивает продукцию prostaglandin, одновременно с увеличением уровней S1P37. Это указывает на то, что S1P является медиатором действия SK1, а не последующих метаболитов. в
На организменном уровне, путь SK1-S1P-S1P1R четко участвует в регуляции ангиогенеза, т.к. S1P1R присутствует на высоких уровнях в эндотелиальных клетках и играет важные роли в ангиогенезе; кроме того, нокаут S1P1R ведет к эмбриональной летальности из-за плохого развития сосудов99. Комбинированный нокаут SK1 и SK2 также воспроизводит этот фенотип100. Изучение эндотелиальных и гладкомышечных клеток подтверждает ключевую роль S1P в регуляции пролиферации, миграции эндотелиальных клеток и формировании трубок, и в активации миграции и пролиферации гладкомышечных клеток101. в
Более того, S1P1R вместе с S1P3R и S1P4R встречаются в большом количестве в лимфоидных органах и выполняют ключевые роли в регуляции лимфоидной секвестрации и/или выходу из лимфатических узлов102. Недавно, FTY270, аналог sphingosine, как было показано, фосфорилируется с помощью SK2 и действует как мощный агонист S1P рецепторов. FTY720 находится на клинических исследованиях в отношении его роли в иммунной модуляции (напр., при рассеянном склерозе103), тем самым подчеркивается важность S1P в регуляции функции лимфоцитов и иммунитета.
Важно также вспомнить, что SK1 и SK2 выполняют ключевую метаболическую функцию в предпоследнем звене разложения всех сфинголипидов, причем необратимое разрушение продукта S1P ведет к метаболическому выходу из sphingolipid пути. Т.о., изменения в активности SK могут иметь долгодействующие эффекты не только на уровне S1P, но и также на уровне ceramide, complex sphingolipids и sphingoid bases. Это прекрасно продемонстрировано в siRNA исследованиях, которые обнаружили достоверное накопление ceramide в ответ на нокдаун
SK1 (Ref. 104).
Conclusions and future directions
The above examples focus on specific, regulated sphingolipid pathways and enzymes that have been more extensively studied than other enzymes and pathways, such as SM synthases, ceramidases, ceramide synthases, GCS, CERT, S1P phosphatase and S1P lyase, which are currently subject to intensive investigation. Sphingolipids other than ceramide and S1P are emerging as candidate bioeffector molecules. These include C1P, which has roles in activation of phospholipase A2 (Refs 105,106), regulation of vesicular trafficking, phagocytosis10, macrophage degranulation9 and in mitogenesis107. Glucosylceramide has been implicated in resistance to chemotherapeutic agents12, and may serve as the endogenous cargo for the P-glycoprotein transporter MDR1 (Ref. 108). Dihydroceramide, which had been shown to be inactive in apoptosis, has been implicated in mediating the growth inhibitory actions of fenretinide (a retinoid analogue used in the treatment of neuroblastoma), which has been shown to inhibit the activity of the desaturase109, 110, 111. Lyso-sphingomyelin has been shown to induce multiple cellular effects, possibly mediated by binding to specific GPCRs112. These additional pathways and bioactive metabolites clearly represent areas of future investigation.
The examples described here highlight important roles for sphingoid bases, ceramide and S1P in regulation of the cell cycle, stress responses, pro-inflammatory pathways and cell migration, with key roles in apoptosis, inflammation and angiogenesis. These cellular roles extend to organismal function and pathobiology and have implications for the understanding of cancer biology, arthritis and inflammation, diabetes, immune function and neurodegenerative disorders113, 114, 115. Notwithstanding the many difficulties and complexities in studying bioactive lipids, these examples demonstrate the power of modern cell biology and biochemistry in elucidating these pathways through the use of knockout mice, siRNA technology, liquid chromatography–mass spectrometry-based 'lipidomic' analysis, confocal microscopy, chemical biology, mathematical modelling and systems biology approaches. в
There are several take-home messages. First, this ever-enlarging spectrum of bioactive lipids has, in effect, reversed our assumptions about the putative functions of lipid metabolism and the roles of minor lipids. Past generations of investigators may have been sceptical of the significance of lipids in cell biology, but we are now at a point where one can almost assume that lipids, which have regulated levels, are 'bioactive until proven otherwise'. Second, it is clear that these pathways are now accessible to the cell biologist, provided that due attention is given to the peculiarities of bioactive lipids and their pathways, as discussed in this review. Third, sphingolipid-mediated pathways operate at the level of individual organelles, and thus should be studied as such. Functions of ceramide in the ER are clearly different from those at the plasma membrane; even in the membrane, ceramide seems to regulate different functions depending on whether it is formed at the inner or outer leaflet. Similar considerations may apply to SK1 and SK2 (Ref. 116). Fourth, the complexity of sphingolipid metabolism and the metabolic interconversion of bioactive sphingolipids provide the cell with an extremely rich repertoire for not only generating multiple signals, but also for fine-tuning specific responses. Therefore, the field of bioactive sphingolipids constitutes its own area of biological '-omics', the 'sphingolipidome'. This generates the anticipation that many modern analytical techniques and the mathematical approaches of systems biology will be brought to bear on this field, as has been trialled with modelling of the sphingolipid metabolic pathways of yeast117.
The study of bioactive lipids is only now coming to the forefront of cell biology, representing possibly one of the last frontiers in molecular cell biology. Clearly, more work is required to dissect each of the many regulated pathways of bioactive sphingolipids and define the mechanisms of regulation of enzymes, roles of the pathways in specific cell responses, and mechanisms by which individual bioactive sphingolipids, which act in specific subcellular compartments, mediate those actions.
