Ангиогенез или создание кровеносных сосудов использует врастание высоко мобильных эндотелиальных кончиковых клеток, которые испускают отростки, наз. филоподиями. Зрелые сосуды содержат молчащие эндотелиальные клетки, которые формируют плотные соединения, создавая эндотелиальный барьер. Vascular endothelial growth factor receptors (VEGFRs) и их лиганды являются критическими для ангиогенеза, а связывание VEGF со своим рецептором стимулирует эндоцитоз. Nakamaya et al. исследовали роль эндоцитоза VEGFR в постнатальной васкуляризации сетчатки мышей. Неожиданно, иммуноокрашивание VEGFR2 оказалось наивысшим в установленной васкулатуре в центральной части сетчатки и оказывалось едва уловимым в ангиогенных врастаниях. Концентрация VEGFR2 и VEGFR3 во врастаниях увеличивалась после внутриглазной инъекции протеосомного ингибитора, лизосомного ингибитора или ингибитора clathrin-обеспечиваемого эндоцитоза. Околоядерное скопление краской меченного VEGF было наивысшим в клетках ангиогенного фронта. Трансмембранный белок EphrinB2 участвует в интернализации VEGFR, а белки affinity-очищенные с цитоплазматическим регионом Ephrin B2 содержат компоненты аппарата клатрином-обеспечиавемого эндоцитоза (адаптор AP2, clathrin heavy chain, dynamin и clathrin-associated sorting protein Dab2). Взаимодействие EphrinB2 с Dab2 обеспечивается с помощью PAR-3, который действует как молекулярный адаптор для VEGFR2, VEGFR3, EphrinB2, Dab2 и atypical protein kinase C (aPKC). Совместная иммунопреципитация VEGFR3, Dab2 и PAR-3 обнаруживается в лизатах легких, а специфичная для эндотелиальных клеток потеря PAR-3 снижает совместную иммунопреципитацию Dab2 и VEGFR2. Нокдаун Dab2 или PAR-3 снижает потребление накопление около ядер экзогенно добавленного VEGF в культивируемые эндотелиальные клетки мышей и нарушает нижестоящую передачу сигналов VEGFR к guanosine triphosphatase Rac1 и к mitogen-activated protein kinases ERK1 и -2. Индуцибельный специфичный для эндотелиальных клеток генетический нокаут Dab2 или PAR-3 уменьшает размер и сложность эндотелиальной сети в сетчатке и ассоциирует со снижением числа кончиковых клеток, длины врастания и количеством филоподий. Более того, потребление меченного краской VEGF снижалось по ангиогенному фронту. Напротив, индуцибельный специфичный для эндотелиальных клеток генетический нокаут aPKC PKC ведет к увеличению накопления меченного краской VEGF в центральной васкулатуре сетчатки, снижая концентрацию VEGFRs в центральном регионе и аберрантное врастание васкулатуры центральной сетчатки. Методы in vitro показали, что PKC фосфорилированный фрагмент Dab2, который снижает взаимодействие между фрагментом Dab2 и VEGFRs. Ингибирование aPKC усиливает интернализацию VEGFR и нижестоящую передачу сигналов в культивируемых эндотелиальных клетках. Фосфорилированная (и активированная) aPKC преимущественно обнаруживается в васкулатуре центральной сетчатки, подтверждая, что во взрослых сосудах центральной части сетчатки пространственная регуляция активности aPKC вносит вклад в стабилизацию VEGFR, но снижает его эндоцитоз и передачу сигналов.

Во время врастающего (sprouting) ангиогенеза концевые клетки, отобранные из эндотелиальных клеток существующих сосудов прокладывают путь новым кровеносным сосудам. Хотя градиент vascular endothelial growth factor (VEGF), как было установлено, влияет на выбор и прокладывает маршрут этим концевым клеткам, но механизм, который регулирует сколько и какие специфические клетки будут отобраны, неизвестен. В трех работах исследовался этот вопрос и было установлено, что передача сигналов Notch обеспечивает выбор концевых клеток во время ангиогенеза.

Hellstro"m с коллегами сконцентрировались на роли Notch во время ангиогенеза в сетчатке мышей. Применение γ-secretase inhibitors (GSIs), которые мощно ингибируют Notch, к мышам во время первой постнатальной недели выявило усиление плотности сосудов. GSI-индуцированное подавление Notch давало также больше клеток, содержащих маркер кончиковых клеток platelet-derived growth factor B. Эти данные показали, что ингибирование Notch вызывает увеличение количества кончиковых клеток, в результате чего усиливалось врастание сосудов. Напротив, воздействие агонистом Notch, показало. что усиление активности Notch вызывает снижение плотности сосудов и врастания.

Исследования мышей, у которых клетки с активным Notch были мечены green fluorescent protein (GFP), показали, что delta-like-4 (Dll4), Notch субстрат, ко-локализуется с Notch активностью по фронту врастания. Более того, 96% кончиковых клеток обнаруживали внутриклеточное накопление Dll4, указывающее на подверженность действию сигналу Notch. Напротив, Dll4 не накапливается в клетках позади фронта врастания. Важность передачи сигналов Notch-Dll4 подтверждается также находками, что Dll4^+/- мыши имеют фенотип, сходный с таковым у мышей, после обработки с помощью Notch-ингибирующих GSIs.

Сходные находки описаны Siekmann and Lawson, которые использовали трансгенных рыбок данио с флюоресцентно меченными кровеносными сосудами для изучения выбора tip-cell. Morpholino-обусловленный нокдаун Rbpsuh (ДНК-связывающий белок, который обеспечивает транскрипцию Notch генов мишеней) увеличивает врастание кровеносных сосудов и количество клеток, которые обнаруживают поведение кончиковых клеток. Напротив активация Notch блокирует врастание кровеносных сосудов. Также morpholino-индуцированная потеря Dll4 фенокопирует потерю активности Notch, хотя и с менее тяжелыми морфологическими дефектами, указывая тем самым, что другие Notch субстраты также могут участвовать во врастании кровеносных сосудов.

Установив сходную роль передачи сигналов Notch-Dll4 у рыбок данио, Leslie с сотр. далее изучали взаимоотношения между этим сигнальным путем и Vegf. Они показали, что обработка эмбрионов, которые лишены Dll4 (и следовательно, передачи сигналов Notch), ингибитором Vegf предупреждает аберрантное врастание кровеносных сосудов.

Всё это указывает на то, что в то время как VEGF способствует врастанию кончиковых клеток, передача сигналов Notch-Dll4 снижает чувствительность к VEGF в одних клетках. но не в др., обеспечивая тем самым выбор кончиковых клеток. Как подчеркивается Hellstro"m с коллегами, это может указывать на то, что ингибиторы и модуляторы пути Notch-Dll4 могут быть пригодны для лечения патологического ангиогенеза в опухолях, для которого на сегодня существует только одна одобренная стратегия ингибирования VEGF.