Двунитчатые разрывы ДНК (DSBs) активируют две основных DNA-damage checkpoint киназы, ataxia telangiectasia (A-T) mutated (ATM) и A-T and RAD3-related (ATR), которые и организуют реакцию на повреждения ДНК, задерживая ход клеточного цикла и делая возможным репарацию повреждений ДНК. Однако структурные детерминанты ДНК, которые активируют ATM и ATR и как активности киназ скоординированы, исследовано плохо. Shiotani and Zou предоставляют новую механистическую информацию.

Используя экстракты клеток человека и ДНК молекулы с определенной структурой, чтобы осуществить активацию ATM in vitro, авт. установили, что длинная двунитчатая ДНК (dsDNA) с тупыми концами индуцирует фосфорилирование ATM (маркер активации) более эффективно, чем короткая dsDNA с тупыми концами. Напротив, dsDNA с длинным single-stranded overhangs (SSOs) обладает пониженной способностью активировать ATM, тогда как dsDNA с короткими SSOs эффективно активируют ATM. Итак, активация ATM с помощью DSBs регулируется с помощью длины как dsDNA, так и SSOs.

ДНК фрагменты с SSOs содержат два типа концов: те, что из области dsDNA (соединения между dsDNA и ssDNA) и концы из SSOs. С помощью химического блокирования этих разных dsDNA концов, Shiotani and Zou установили. что только dsDNA-ssDNA соединения являются критическими для активации ATM. Отметим, что dsDNA-ssDNA соединения как известно активируют также ATR. Итак. как активируются ATM и ATR скоординированно на DSBs?

Экзонуклеазы, которые разрезают линейную ДНК и постепенно генерируют SSOs, мешают активации ATM, но способствуют активации ATR. Итак, вследствие активации ATM и инициации резекции, SSOs могут способствовать переключению между ATM и ATR на DSBs. В самом деле, checkpoint kinase 2 (CHK2), ATM субстрат, временно фосфорилируется вскоре после того как клетки повреждаются с помощью ионизирующего излучения (IR) , а снижение фосфорилирования CHK2 совпадает с активацией CHK1, ATR субстрата. Заметим, что replication protein A (RPA)-покрытые ssDNA фокусы (которые генерируются с помощью exonuclease-обусловленной резекции DSBs и, как известно, рекрутируют ATR) накапливаются на DSBs, когда активация ATM ослабляется. Итак, переключение ATM-to-ATR обусловливается резекцией DSB?

Это, по-видимому, так. т.к. ATM индуцирует резекцию ДНК, а ATM ингибитор блокирует переключение ATM-to-ATR после воздействия IR. Более того, экспрессия экзонуклеаз, которые участвуют в резекции, способствует IR-индуцированному переключению с ATM на ATR на DSBs. Предполагается, что "the ATM-to-ATR switch driven by DSB resection is the key mechanism through which the functions of ATM and ATR are coordinated and integrated".

FURTHER READING
Cimprich, K. A. & Cortez, D.
ATR: an essential regulator of genome integrity. Nature Rev. Mol. Cell Biol. 9, 616–627 (2008)
Article

Makovets, S. & Blackburn, E. H.
DNA damage signalling prevents deleterious telomere addition at DNA breaks.
Nature Cell Biology. 11, 1383–1386 (2009)
Article

Энзим теломераза поддерживает целостность хромосом путем синтеза теломер на концах хромсом. Что мешает теломеразе добавлять теломеры к double-stranded DNA breaks (DSBs)? Svetlana Makovets и Elizabeth Blackburn сообщают, что передача сигналов от повреждений ДНК вызывает фосфорилирование ингибитора теломеразы Pif1 (petite integration frequency 1). Фосфорилирование Pif1 блокирует активность теломеразы на разрывах ДНК, но не на концах хромосом.

У почкующихся дрожжей DSBs, возникающие во время нормального роста или как результат генотоксических стрессов, активируют киназы Tel1 и Mec1 — ортологи ATM (ataxia telangiectasia mutated)и ATR (ATM and Rad3-related) млекопитающих, соотв. — чтобы индуцировать фосфорилирование checkpointкиназ Chk1 и Rad53. Makovets и Blackburn установили, что Pif1, который, как известно, противодействует функции теломеразы на концах ДНК, фосфорилируется вследствие повреждения ДНК. Делеция MEC1 или RAD53 блокирует вызванное повреждением ДНК фосфорилирование Pif1, хотя Rad53не нужен для рекрутирования Pif1 на DSBs. Эти данные указывают на то, что путь реакции на повреждения ДНК регулирует фосфорилирование Pif1, но не локализацию Pif1.

Интересно, что мутантный Pif1, который не может быть фосфорилирован по Thr763, Ser765, Ser766 или Ser769 (pif1-4A) делает возможным ошибочное добавление теломеров к DSBs; тот же самый эффект наблюдался в PIF1-нулевых клетках. Напротив, pif1-4A не оказывает эффекта на добавление теломеров к естественным концам хромосом. Фосфорилирование Pif1не индуцируется с помощью остановившейся репликационной вилки или за счет nocodazole-обусловленного ареста митоза. Т.о., Mec1-зависимое фосфорилирование Pif1 между остатками 763–769 активируется специфически в ответ на разрывы ДНК и это усиливает его способность ингибировать активность теломеразы на DSBs.

Дополнительные эксперименты показали, что DSBs индуцируют фосфорилирование Pif1 по Thr763 и Ser766, которые существенны для ограничения функции теломеразы на DSBs. Однако пока неясно, как фосфорилирование Pif1 блокирует теломеразную активность в этих сайтах. Также важно выяснить, управляет ли Pif1 непосредственно мишенями Rad53 и Dun1 (киназа, стоящая ниже Rad53), и законсервирован ли этот путь в клетках млекопитающих.