Посещений:
ПЕРЕДАЧА СИГНАЛОВ BMP

Механизмы

Finding partners: How BMPs select their targets
Ira L. Blitz , Ken W.Y. Cho
Developmental Dynamics 238:1321-1331, 2009. © 2009 Wiley-Liss, Inc.

The bone morphogenetic protein (BMP) signaling pathway is a conserved and evolutionarily ancient regulatory module affecting a large variety of cellular behaviors. The evolutionary flexibility in using BMP responses presumably arose by co-option of a canonical BMP signaling cascade to regulate the transcription of diverse batteries of target genes. This begs the question of how seemingly interchangeable BMP signaling components elicit widely different outputs in different cell types, an important issue in the context of understanding how BMP signaling integrates with gene regulatory networks to control development. Because a molecular understanding of how BMP signaling activates different batteries of target genes is an essential prerequisite to comprehending the roles of BMPs in regulating cellular responses, here we review the current knowledge of how BMP-regulated target genes are selected by the signal transduction machinery. We highlight recent studies suggesting the evolutionary conservation of BMP target gene regulation signaling by Schnurri family zinc finger proteins.

J. Xu, A. H. Wang, J. Oses-Prieto, K. Makhijani, Y. Katsuno, M. Pei, L. Yan, Y. G. Zheng, A. Burlingame, K. Brьckner, R. Derynck, Arginine methylation initiates BMP-induced Smad signaling. Mol. Cell 51, 5–19 (2013).

X. Guo, X.-F. Wang, A P(E)RM(I)T for BMP signaling. Mol. Cell 51, 1–2 (2013).


Bone morphogenetic proteins (BMPs) являются секретируемыми белками из семейства transforming growth factor-β которые действуют посредством двух рецепторных сериновых и треониновых киназ (BMPRI and -RII), чтобы управлять морфогенезом и развитием. BMPs соединяются с BMPRII, которые фосфорилируются и активируют BMPRI, которые в свою очередь фосфорилируют эффекторные белки Smad1 и Smad5. Эти Smads затем рекрутируются на BMPRI, где они ассоциируют с Smad4, чтобы сформировать тримерный комплекс, который транслоцируется в ядро, чтобы активировать экспрессию генов мишеней. Smad6 конкурирует с Smad1 и Smad5 за соединение с BMPRI как часть механизма обратной связи, чтобы ингибировать передачу сигналов. Отметив, что фосфорилирование эффекторов Smads в ответ на активацию BMPR слабее, чем фосфорилирование субстратов рецепторных тирозин киназ , Xu et al. исследовали, существуют ли дополнительные ступени перед фосфорилированием Smad, необходимые для передачи сигналов BMP. Авт. установили, что нокдаун protein arginine methyltransferase 1 (PRMT1) в разных линиях клеток человека ингибирует BMP4-зависимое фосфорилирование Smad1 и Smad5, транслокацию в ядро Smad1 и экспрессию генов мишеней для BMP. Было установлено, что PRMT1 ассоциирует с Smad6, но не с др. Smads и in vitro экспериментах было установлено, что PRMT1 метилирует Smad6 преимущественно по Arg74. В клетках BMP4 стимулирует временную ассоциацию между PRMT1 и Smad6, что приводит к метилированию Smad6 с более быстрой кинетикой, чем вызываемое BMP фосфорилирование Smad1 и Smad5. Дальнейший анализ межбелковых взаимодействий показал, что Smad6 ассоциирует с BMPRI, а PRMT1 ассоциирует с BMPRII в нестимулированных клетках. BMP4 стимулированная ассоциация BMPRI и BMPRII, сводит PRMT1 с Smad6, что ведет к метилированию по arginine Smad6, его отсоединению от BMPRI, и его увеличению ассоциации с BMPRII. Эксперименты на клетках Drosophila показали, что PRMT1 ортолог Dart1 метилирует Smad6 ортолог Dad, и Dart1 противодействует эффектам Dad в развитии крыльев. Итак, подтверждено, что зависимое от BMP метилирование аргинина в Smad6 с помощью PRMT1 дерепрессирует путь BMP, обеспечивая возможность фосфорилирования и активации Smad1 and Smad5.
Bone morphogenetic proteins (BMPs) представляют самую большую подгруппу сверхсемейства transforming growth factor (TGFβ) из внеклеточных сигнальных молекул. Т.к. BMPs впервые были идентифицированы благодаря их кость-индуцирующим свойствам (Wozney et al.,[1988]), их важность подчеркивается наличием более 10,000 публикаций в современной литературе. Среди их многочисленных обязанностей BMPs контролируют спецификацию типов клеток, дифференцировку, плюрипотентность, апоптоз, пролиферацию и тканевой морфогенез. Сокращенный список онтогенетических событий, в которых участвуют BMPs включает рост мышиного яйцевого цилиндра, спецификацию и развитие зародышевых клеток, формирование dorsal-ventral (D-V) паттерна осей тела, индукцию эпидермиса, раннее формирование паттерна ЦНС, нейрального гребня и различных плакод, развитие черепно-лицевых структур, добавочных органов кожи, глаз. зачатков конечностей и практически каждого органа тела. Участвуя во столь многочисленных различных онтогенетических событиях, не является сюрпризом, что BMPs являются также эволюционно древними белками. Передача сигналов BMP существует, по крайней мере 700 миллионов лет, предвосхищая эволюцию двухстронне-симметричных (see Fig. 1). Лиганды и нижестоящие компоненты сигнального каскада обнаружены как у Cnidaria (metazoans, включая Hydra, анемон Nematostella, медуз и кораллов), а также у губок, наиболее древних из metazoan clade (Suga et al.,[1999]; Hayward et al.,[2002]; Finnerty et al.,[2004]; Reinhardt et al.,[2004]; Rentzsch et al.,[2006],[2007]; Reber-Mu"ller et al.,[2006]; Nichols et al.,[2006]; Adamska et al.,[2007]; Zoccola et al.,[2009]). Не выявлено сигнальных компонентов сверхсемейства TGFβ в таксоне, лежащем в основе грибов, включая одноклеточных choanoflagellates, грибов или простейших (Nichols et al.,[2006]; King et al.,[2008]). Следовательно, передача сигналов TGFβ возникла примерно при возникновении metazoa, 700 миллионов лет тому назад (Peterson et al.,[2008]) и затем кооптирована, чтобы выполнять роли во всё увеличивающихся биологических процессах.


Рис.1.  |  A phylogenetic tree depicting the appearance of bone morphogenetic protein (BMP) signaling cascade components during evolution. Animals within these categories that have been examined for the presence or absence of BMP signaling components using either Metazome (metazome.org) or Blast searches (blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi or compagen.zoologie.uni-kiel.de/blast/blast_cs.html). Using Metazome, mammals examined include Homo sapiens, Mus musculus, Rattus norvegicus, Canis familiaris, and Monodelphis domestica. Birds include the chicken Gallus gallus, while amphibians included Xenopus tropicalis. Teleost fishes include Gastrocleus aculeatus, Oryzias latipes, Takifugu rubripes, and Danio rerio. Urochordates, cephalochordates, and echinoderms examined were the ascidian Ciona species savignyi and intestinalis and the amphioxus Branchiostoma floridae and the sea urchin Strongylocentrotus purpuratus, respectively. Insects consisted of Drosophila melanogaster, Anopheles gambiae, Aedes aegypti, Bombyx mori, and Tribolium casteneum. Nematode worms included both Caenorhabditis elegans and briggsae, while molluscs are represented by the limpet Lottia gigantean. Cnidaria are represented by Nematostella vectensis. We also blast searched the genome of the cnidarian Hydra magnapapillata using http://hydrazome.metazome.net/cgi-bin/gbrowse/hydra/. We identified brinker candidate genes in nondrosophilid insect species belonging to Culex, Anopheles, Pediculus, and Apis using NCBI blast. Neither blast searches of the Daphnia pulex genome (http://genome.jgi-psf.org/Dappu1/Dappu1.home.html) nor the NCBI EST database found a brinker in this species. BMP R-Smads were also identified using NCBI blast in the poriferan Oscarella carmela. Compagen was used to blast search the lamprey Petromyzon marinus, the choanoflagellate Monosiga brevicola, the poriferan Amphimedon queenslandica, and the placozoan Trichoplax adhaerans (not shown as precise position in the tree remains controversial). Branch lengths herein do not attempt to accurately depict the evolutionary divergence times or genetic distances between different sister groups.

При огромном разнообразии клеточных реакций, осуществляемых с помощью BMPs, обычно возникает вопрос: как могут кажущиеся взаимозаменяемые BMP лиганды вызывать такой широкий круг разнообразных действий? Частичный ответ на этот вопрос получен в раннем эмбриогенезе - как клетка отвечает на внешние стимулы не кодируется самими стимулами per se, это является функцией истории развития отвечающих клеток. Индукция дифференциальных генов с помощью BMPs зависит от специфической природы аппарата, экспрессируемого каждым отвечающим типом клеток.

THE CANONICAL BMP SIGNALING CASCADE: FROM THE CELL MEMBRANE INTO THE NUCLEUS


Сверхсемейство TGFβ может быть подразделено на две ветви, исходя из компонентов, используемых в каждом сигнальном каскаде. Одна ветвь содержит TGFβ1, лиганд по которому и названо сверхсемейство, а также activins и nodals. Др. ветвь содержит BMPs, growth and differentiation factors (GDFs) и anti-Mullerian hormone (AMH). Заслуживает внимание, что некоторые лиганды, названные как BMPs/GDFs, передают сигналы посредством TGFβ ветви (напр., GDF1/Vg1), тогда как др. члены сверхсемейства TGFβ , по-видимому, действуют как ингибиторы передач сигналов (напр., Lefty). Суть сигнального трансдукционного каскада приложима к обеим ветвям и выяснена в деталях (Fig. 2; Shi and Massague',[2003]; Feng and Derynck,[2005]; Miyazono et al.,[2005]; Ross and Hill,[2008]). Почти на каждой ступени сигнальные каскады двух ветвей содержат специфические для данной ветви компоненты, чтобы отделить эти сигнальные каскады др. от др.


Рис.2.  |  The canonical BMP signaling cascade.

Сигнальные лиганды являются disulfide-сцепленными димерами и соединяются с рецепторами, состоящими из двух субъединиц (рецепторы types I и II). Обе рецепторные субъединицы содержат цитоплазматические serine/threonine киназные домены на их C-концах. Связывание лиганда облегчает/стабилизирует type I-type II взаимодействия и активирует сигнальный комплекс, состоящий из (type I)2(type II)2 субъединичного стоихометричного состава. Соединяясь вместе type I и type II рецепторные субъединицы обеспечивают эффективное трансфосфорилирование type I рецепторной субъединицы с помощью type II рецептора, который является конституитивно активной киназой. Фосфорилирование type I субъединицы стимулирует её собственную киназную активность и, в свою очередь, type I субъединица фосфорилирует цитоплазматически локализованные сигнальные трансдукторы, Smads. Т.о., взаимодействие лиганд-рецептор в конечном итоге облегчает активацию рецептороной субъединицы type I, тем самым передается сигнал внутрь клетки посредством Smads. Имеется несколько доказательств неканонической передачи сигналов BMP, которая может быть Smad-независимой (reviewed by Moustakis and Heldin,[2005]), канонический же путь посредством Smads, по-видимому, является основным путем влияния BMPs на генную экспрессиию.
После активации type I рецепторы фосфорилируют Smads по их C-концевому SSXS мотиву последовательности и эта модификация ведет к активации Smad белков. The TGFβ и BMP ветви каждая обладают Smads, предназначенных для передачи сигналов. Smads 2 и 3 используются ветвью TGFβ, тогда как Smads 1, 5 и 8 (также известен как Smad9) передают BMP сигналы. Все эти Smads обозначаются как receptor-regulated Smads (R-Smads). чтобы отличать их от Smad4. Этот Smad (часто обозначаемый как Co-Smad) является общим R-Smads как для TGFβ , так и BMP каскадов, он лишен C-терминального SSXS мотива и поэтому не фосфорилируется с помощью type I рецепторов. Наконец, имеются также ингибирующие Smads (I-Smads) 6 и 7, которые действуют, чтобы блокировать передачу сигналов TGFβ сверхсемейства на нескольких уровнях. Как R-Smads, так и Smad4 структурно построены в виде высоко консервативного N-терминального Mad Homology (MH) 1 и C-терминального MH2 доменов. Домен MH1, который обладает ДНК-связывающей активностью, отделен от домена MH2 за счет линкерной области, которая законсервирована в меньшей степени и, как полагают, является очень не структуированной и гибкой. Домен MH2 участвует в активации транскрипции и также необходим для мультимеризации Smad. R-Smads формируют комплексы с Smad4в отношении 2:1, хотя и R-Smad гомотримеры. лишенные Smad4 (Correia et al.,[2001]) также могут играть роль в передаче сигналов. C-терминальноеl Smad фосфорилирование заканчивается, по крайней мере, двумя событиями. Фосфорилирование вызывает конформационное изменение, устраняя взаимодействие между MH1 и MH2 доменами, которое ингибирует связывание с ДНК. Это открытие R-Smads делает возможным их взаимодействие с Smad4 и их накопление в ядре, где они получают доступ к геному.

IT'S A SMAD WORLD: DNA RECOGNITION BY THE SMADs


Современные доказательства, главным образом из экспериментов по избыточной экспрессии в культурах клеток, у эмбрионов Xenopus и рыбок данио указывают на то, что все три BMP R-Smads функционально взаимозаменяемы (Suzuki et al.,[1997]; Dick et al.,[1999]; Kramer et al.,[2002]). Фенотипический анализ мышиных Smad нокаутов также указывает на то, что Smads 1, 5 и 8 функционально перекрываются (Hester et al.,[2005]; Arnold et al.,[2006]; Pangas et al.,[2008]; Retting et al.,[2009]). Согласуется с этим мнением и то, что все три BMP R-Smads обладают очень высокой степенью сходства аминокислотных последовательностей. Smads 1 и 5 почти идентичны и их отличие от Smad8 заключается в линкере, отделяющем MH1 и MH2 домены. Эти наблюдения подтверждают, что три BMP R-Smads возникли в результате мультипликации гена из одиночного Smad1/5/8 предшественника (Fig. 1). Это мнение было подтверждено тем, что кишечнополостная Nematostella содержит гены, кодирующие только 4 Smads, с высоким сходством аминокислотных последовательностей с Smads1/5/8, Smads2/3, Smad4 и I-Smad, Smad6. Ген Nematostella smad1/5/8 и гены smad8 позвоночных также обнаруживают сцепление с соседним alg5 геном, подтверждая локальную синтению. Геномы иглокожих (Strongylocentrotus; sea urchin), cephalochordate (Branchiostoma; amphioxus) и urochordate (Ciona; ascidian) также все содержат одиночный небольшой ортолог smad1/5/8. С др. стороны, геномы рыб и тетрапод содержат (по крайней мере) три самостоятельных smad1, smad5 и smad8 гена, также как и геномы миноги Petromyzon, безчелюстных позвоночных (agnathan), которые рассматриваются как исключение по отношению ко всем остальным позвоночным. Эти наблюдения согласуются consistent с гипотезой, что три BMP R-Smads возникли в результате двух раундов удвоения целого генома (и потери генов), которые происходили до появления agnathan рыб или при возникновении позвоночных (Fig. 1).
Smads идентифицируют гены мишени путем непосредственного соединения с цис-действующими регуляторными элементами ДНК. MH1 домен Drosophila Mad (Smad1/5/8) , как было установлено, связывает DPP чувствительные регуляторные регионы в vestigial, labial, и Ultrabithorax (Ubx) генах и взаимодействует с консенсусной последовательностью 5-GCCGNCGC-3 (Kim et al.,[1997]). BMP R-Smads позвоночных, по-видимому, имеют предпочтение к сходным GC-богатым сайтам связывания (Kusanagi et al.,[2000]; Ishida et al.,[2000]), но описывается множество вариаций последовательностей. Методы селекции сайтов связывания, использованные для Smad3 (R-Smad for the activin/nodal/TGFβ branch) и Smad4 MH1 доменов подтвердили, что эти белки предпочитают мотив связывания в ДНК 5'-GTCTAGAC-3' (Zawel et al.,[1998]). Рентгеновская структура Smad3 MH1 домена ко-кристаллизованная вместе с этим ДНК мотивом (Shi et al.,[1998]) показала, что связывание Smad3 происходит на этом палиндроме посредством половины сайта 5'-GTCT-3' (обратным комплиментом является 5'-AGAC-3'), и эта последовательность часто обозначается как Smad-binding element (SBE). Интересно, что кристаллическая структура в комбинации с последовательностью для построения всех R-Smads и Smad4, показывает, что все передачи сигналов Smads д. обладать сходными ДНК-связывающими специфичностями, поскольку аминокислотные остатки в β-hairpin? которые непосредственно контактируют с основаниями ДНК неизменны между человеческими R-Smads и Smad4 (Shi et al.,[1998]).
В соответствие с этим мнением сродство связывания изолированных Smad1 MH1 доменов с SBE (half site) было установлено равным 5Ч 10-7 M (Shi et al.,[1998]), а сродство Smad3 и Smad4 MH1 доменов оказалось сходным, 1.1Ч 10-7 M и 3Ч 10-7 M, соотв. (Shi et al.,[1998]). К сожалению, подобные измерения отсутствуют для связей этих MH1 доменов с GC-богатым мотивом (оба типа Smad связывающих мотивов могут рассматриваться как дегенеративные формы мотива 5'-GNCN-3'). Более того, мухи Medea (Smad4) также обнаруживают связывание нескольких GC-богатых элементов в промоторе tinman (Xu et al.,[1998]).
Несмотря на эти экспериментально наблюдаемые различия в предпочтении сайтов связывания ДНК, BMP R-Smads обычно предпочитают GC-богатые элементы связывания, тогда как др. Smads предпочитают SBE. GC-богатые боксы, также дифференциально обнаруживающие благосклонность к BMP активации при трансфекциях клеточных культур и индукции репортерных генов, оказываются неэффективными только с SBE сайтами (Korchynskyi and ten Dijke,[2002]; Katagiri et al.,[2002]; Lo'pez-Rovira et al.,[2002]). Вообще-то сходство in vitro сродства изолированных MH1 доменов к мотивам ДНК не точно отражает предпочтения белков полной длины, скомплексованных в R-Smad/Smad4 гетеродимеры. Было предположено, что Smad1's предпочтение к GC-богатым мотивам по сравнению с SBEs может быть обусловлено серией высоко щелочных аминокислот по соседсу с β-hairpin остатками, найденными во всех трех BMP R-Smads, которых лишены как R-Smads, специфичные к activin/nodal/TGFβ ветви, так и к Smad4 (Shi et al.,[1998]; Shi,[2001]).
Задача для Smads по обеспечению специфического таргетинга BMP и TGFβ чувствительных генов осложняется относительно слабым сродством Smads к этим мотивам последовательностей, которое на несколько порядков величин ниже, чем для большинства сиквенс-специфических ДНК-связывающих белков. Благодаря низкому сродству и избирательности Smads' к их сайтам связывания, не следует ожидать, что они способны строго различать между собственно мишенями генной активации и случайными ДНК. Это может объяснить, почему относительно длинны concatemers сайтов связывания Smad часто необходимы, чтобы обеспечить активацию транскрипции в клеточных культурах (Jonk et al.,[1998]; Kusanagi et al.,[2000]). Промоторы некоторых индуцибельных с помощью BMP генов (напр., bambi, и id и vent семейств генов) имеют многочисленные сайты связывания Smad (Lo'pez-Rovira et al.,[2002]; Korchynskyi and ten Dijke,[2002]; Karaulanov et al.,[2004]), по-видимому, чтобы более эффективно рекрутировать Smads для усиления транскрипционной регуляции. Т.к. изолированные MH1 домены Smad3 не обнаруживают кооперативного связывания с палиндромными SBEs (Shi et al.,[1998]), то разумно предположить, что полной длины Smads могут вести себя по другому. Smad MH2 домены способствуют гетеротримеризации (Correia et al.,[2001]; Qin et al.,[2001]; Chacko et al.,[2001]), и поэтому эти MH1 домены физически прикреплены один к др. в тримерных Smad комплексах, они д. быть способны связывать SBE и GC-богатые сайты, организованные в кластеры с более высоким сродством, чем то, которое обнаруживается для изолированных MH1 доменов для одиночных в 4-bp элементов. Имеются также доказательства, что не все относительные ориентации GC-rich/SBE GNCN мотивов, в димерной или мультимерной форме эквивалентны в отношении сродства связывания Smad (Johnson et al.,[1999]; Gao and Laughon,[2006],[2007]). Пока остается спорным, может ли связывание только Smads быть достаточным для активации транскрипции сайтов мишеней, тот факт, что SBE/GC-rich сайты возникают в относительной изоляции в некоторых промоторах и что Smads взаимодействуют слабо с одиночными сайтами связывания, указывают на то, что Smad-ДНК взаимодействия обычно стабилизируются с помощью др. сиквенс-специфических ДНК связывающих партнеров. Ранее было показано, что FoxHI (Fast1) белок непосредственно взаимодействует с Smad2/4 комплексами в mix.2 промоторе и что взаимодействия Smad2/4 с Nodal генами мишенями усиливаются с помощью FoxHI, подкрепляя строго эту идею (Chen et al.,[1996];[1997]), это оказывает существенное влияние на модели регуляции многих BMP/TGFβ генов мишеней.

TRANSCRIPTION FACTOR PARTNERS FOR SMADS IN THE REGULATION OF BMP TARGET GENE EXPRESSION


Благодаря важности кооперативных взаимодействий между Smads и др. сиквенс-специфическими ДНК-связывающими факторами, были идентифицированы некоторые транскрипционные факторы, обеспечивающие предачу сигналов BMP. Эти белки, как полагают, партнеры Smads в деле упрочения Smad-ДНК взаимодействий (напр.. FoxHI) и поэтому они играют важную роль в рекрутировании Smads на гены, содержащие сайты связывания для партнерских фактров транскрипции. Один такой Smad партнер, впервые выявленный как обеспечивающий передачу сигналов BMP , это Oaz (OE/EBF-associated zinc-finger белок, также известный как Znf423). Этот multi-zinc finger белок, как полагают, обеспечивает передачу сигналов посредством BMP response element (BRE) в Xenopus vent2 гене (Hata et al.,[2000]). Oaz связывает BRE in vitro и активирует BMP-зависимую экспрессию гена репортера в методе временной трансфекции. Нокаутные oaz мыши обнаруживают дефекты срединной линии головного моза (Cheng et al.,[2007]) и обонятельных нейронов (Cheng and Reed,[2007]), это может быть связано с нарушением передачи сигналов BMP. Однако эти мутантные мыши не способны обнаруживать дефекты в раннем эмбриогенезе, связанные со снижением передачи сигналов BMP, подтверждая, что др. транскрипционные факторы могут быть задействованы в обеспечении передачи сигналов BMP в раннем развитии. В соответствии с этим мнением пространственно-временные паттерны экспрессии oaz и vent2 у эмбрионов Xenopus на ст. хвостовой почки также не перекрываются. Потенциальным осложнением является присутствие в геномах позвоночных др. гена цинковые пальчики, znf521, близко родственного oaz. Прока неясно, является ли znf521 функционально перекрывающимся с oaz, т.к. экспрессия этого гена подавляется в ответ на BMPs в мезенхимных клетках и Znf521, по-видимому, противодействует дифференцировке остеобластов (Wu et al.,[2009]). Необходимо отметить, что Drosophila содержит единственный oaz ортолог, демонстрируя локальную синтению с хромосомными регионами, содержащими гены oaz позвоночных. Потеря этого гена приводит к дефектам в развитии задних спираклей (spiracle) (Krattinger et al.,[2007]), но пока не установлено прямой связи между мушиным oaz и передачей сигналов DPP в этом процессе. Исходя из этих наблюдений, Oaz может и не быть повсеместным и универсальным ДНК-связывающим Smad партнером, а скорее Oaz может действовать как специализированный ткане-специфичный транскрипционный фактор, способствующий передаче сигналов BMP.
Runx2 является др. важным транскрипционным фактором, регулирующим экспрессию BMP мишеней. Роль Runx2's в передаче сигналов BMP была установлена в исследованиях дифференцировки хондроцитов и остеоцитов. Потеря runx2 к тяжелыми нарушениям развития костей (rev. Karsenty,[2008]). Гены, такие как osteocalcin, osteopontin, col10 и smad6, которые участвуют в формировании остеобластов, все они непосредственно регулируются путем связывания Runx2 вместе с Smad1 с промоторами этих генов (Zhang et al.,[2000]; Drissi et al.,[2003]; Wang et al.,[2007]). Т.к. передача сигналов и Runx2 и BMP является критической для развития этих типов клеток, то эти данные уают на то, что Runx2 может широко координировать экспрессию генов мишеней для BMP, участвующих в дифференцировке остеобластов. Однако, все ли мишени Runx2 в остеобластах также воспринимают сигналы BMP R-Smad, пока неизвестно.
Среди др. ДНК-связывающих Smad партнеров. которые привлекли внимание, являются Zeb2 (также известный как Sip1) и Zeb1 (также известный как EF1; Sekido et al.,[1996]; Verschueren et al.,[1999]). Эти близко родственные zinc finger белки, по-видимому, формируют inhibitor/activator пару и являются ортологами дрозофилийного zfh1 (Postigo,[2003]; Postigo et al.,[2003]). Zeb2 экспрессируется у ранних эмбрионов Xenopus и рыбок данио и, по-видимому, негативно регулирует экспрессию, по крайней мере, некоторых BMP генов мишеней (van Grunsven et al.,[2006]; Delalande et al.,[2008]). Взаимодействие между этими белками и передачей сигналов TGFβ является сложным и они также функционируют в регуляции передачи сигналов activin/nodal (Verschueren et al.,[1999]). Smad1 белок, как было установлено, физически взаимодействует с HoxC8, Nkx3-2, YY1, β-catenin/Lef1 комплексом и Gata факторами 4, 5 и 6 (Shi et al.,[1999]; Kim and Lassar,[2003]; Benchabane and Wrana,[2003]; Brown et al.,[2004]; Lee et al.,[2004]; Hu and Rosenblum,[2005]).
Все транскрипционные факторы партнеры для BMP R-Smads, описанные здесь, обладают сиквенс=-специфической ДНК связывающей активностью и, по-видимому, управляют связыванием Smad со специфическими BMP генами мишенями, чтобы передавать сигналы BMP в определенные типы клеток. Остается неясным, существуют ли вездесущие, ДНК-связывающие Smad партнеры, которые регулируют батареи BMP-чувствительных генов. И так как Smad партнеры распознают разные мотивы ДНК, то вряд ли существует цис-регуляторный код (помимо Smad мотивов, обсужденных ранее) , который является общим для распознавания всех BMP мишеней.

SCHNURRI, A TRANSCRIPTIONAL PARTNER WITH MULTIPLE PERSONALITIES


У Drosophila активация большинства DPP (BMP) мишеней происходит посредством непрямого, двойного репрессионного механизма, оперирующего на уровне регуляции транскрипции (Fig. 3A, top). Ген brinker кодирует репрессор, управляющий транскрипцией генов мишеней для BMP (Campbell and Tomlinson,[1999]; Jawiska et al., 1999a,b; Minami et al.,[1999]) и его широко распространенная экспрессия контролируется с помощью ещё не охарактеризованных транскрипционных факторов (Yao et al.,[2008]). Передача сигналов DPP/BMP ослабляет Brinker-обеспечиваемую репрессию путем ингибирования транскрипции brinker (Fig. 3A, bottom; Campbell and Tomlinson,[1999]; Jawiska et al., 1999a,b; Minami et al.,[1999]). Критический транскрипционный фактор, обеспечивающий эту DPP-зависимую репрессию brinker, это ДНК-связывающий белок цинковые пальчики Schnurri (Shn; German for whiskers; Arora et al.,[1995]; Grieder et al.,[1995]; Staehling-Hampton et al.,[1995]). Ген shn кодирует крупный белок (275 kDa), содержащий 8 цинковых пальчиков (расположенных в виде 4-х кластеров), который взаимодействует с Smads (Mad and Medea, ортологи Smads 1/5/8 и 4, позвоночных соотв. ) , чтобы обеспечить передачу сигналов DPP (Dai et al.,[2000]; Udagawa et al.,[2000]). В ответ на передачу сигналов DPP/BMP (Fig. 3A, bottom), Schnurri репрессирует транскрипцию brinker путем соединения с его промоторной областью вместе со Smads (Pyrowolakis et al.,[2004]). Это, в свою очередь, высвобождает Brinker-репрессированные BMP мишени, позволяя им становиться активными. В самом деле, большинство этих генов, регулируемых с помощью передачи сигналов DPP у Drosophila содержит сайты связывания Brinker и нуждаются в высвобождении от репрессии Brinker.


Рис.3.  |  Various modes of Schnurri docking to bone morphogenetic protein (BMP) target genes. A: In Drosophila, in response to DPP signaling, Schnurri binds to the regulatory regions of brinker, bag of marbles, and gooseberry by means of docking to SMM ( Schnurri/Mad/Medea) sites. These sequence motifs are directional: they are composed of a GC-rich site for Mad (Smad1) binding followed by a Smad-binding element (SBE) site for Medea (Smad4) binding. Schnurri only docks when these two motifs are in this orientation and only when separated by 5 bps. B: Fly Schnurri interacts with the Ubx B enhancer to drive Ubx transcription in the midgut. Schnurri binding to this gene also occurs by means of two interactions, one by means of a direct contact of Schnurri zinc fingers with NFB-like sequence motifs in the Ubx gene, and the other by means of Schnurri docking to fly Smads bound to canonical sites located less than 100 bp distally. C: In mouse, Shn2 interacts with the pparg2 promoter region by means of docking to two protein intermediaries, the Smad complex bound to an SBE in the promoter proximal region, and C/EBP bound to a canonical CCAAT box located approximately 90 bp distally. D: As in the case of Drosophila Schnurri, vertebrate Shn1 proteins can bind to SMM elements as in the case of the BMP-response elements (BREs) found in the Xenopus vent2 and id3 promoter proximal regions. These BREs have the same architecture as the fly SMM sites but in vertebrate cells both fly and vertebrate Shn1 act as transcriptional activators to mediate BMP signals.

Анализ регуляции brinker с помощью Schnurri выявил интересный механизм, объясняющий как активация рецепторов Smads может быть использована для репрессии генной транскрипции. Регуляторная область гена brinker содержит silencer элемент, brkSE, который был идентифицирован как 16-bp цис-действующий элемент, отвечающий на передачу сигналов DPP (Pyrowolakis et al.,[2004]). Этот мотив также присутсвует в генах, чувствительных к DPP bag of marbles и gooseberry. Недавно 11 копий этого мотива, обозначенного как SMM сайт, были найдены как часть цис-регуляторного модуля, распределенного на 16kb вышестоящей регуляторной области brinker , этот сайт играет сложную роль в репрессии brinker (Yao et al.,[2008]). Обширный мутагенный анализ показал, что brkSE представлен одиночными Mad и Medea консенсусными сайтами связывания, разделенными точно в 5-bp спейсерной областью. Длина этого спейсера является критической для закрепления Schnurri на этом сайте за счет межбелковых взаимодействий как с Mad так и с Medea (Pyrowolakis et al.,[2004]; Gao et al.,[2005]). Пока нет доказательств, что Schnurri соединяется непосредственно с brkSE и поэтому современная модель предполагает, что геометрия комплекса Mad/Medea на ДНК, разделенного 5-bp, является критическим детерминантом, который создает поверхность для стыковки Schnurri (Pyrowolakis et al.,[2004]; Gao et al.,[2005]; Gao and Laughon,[2006],[2007]). Остается загаджкой. почему такое точное расположение в пространстве необходимо для стыковки Schnurri, т.к. Schnurri взаимодействует с Smad MH2 доменами, а они отделены от своих ДНК-связывающих MH1 доменов линкерной областью, которая, как полагают очень гибкая. Одна из возможностей заключается в том, что ликерные домены в [R-Smad]2:[Smad4]1 комплексе не не приспосабливаются, как это предполагалось.
Помимо этой репрессивной функции, Shn может также действовать как транскрипционный активатор (Fig. 3B). Shn необходим для экспрессии Ultrabithorax (Ubx) в средней кишке и соединяется с Ubx B midgut энхансером вместе с Mad и Medea (Dai et al.,[2000]). Соединение Shn с геном Ubx происходит в результате двух взаимодействий. Shn zinc finger домены непосредственно соединяются с энхансером посредством NF-B-подобных мотивов ДНК последовательностей. Shn активирует Ubx B репортерный ген в клеточной культуре, а мутация в NF-B-like Shn-связывающем сайте редуцирует экспрессию Ubx B репортера у эмбрионов мух (Dai et al.,[2000]). Shn также контактирует с мушиными Smads, соединяясь с сайтом, расположенным на расстоянии менее чем 100 bp от NF-B-like элементов, и является важным для регуляции DPP. Сегодня неясно, сколько генов являются управляемыми мишенями для Schnurri-зависимой активации транскрипции у Drosophila, но некоторые функции Schnurri's , как было установлено, не зависят от дерепрессии brinker (Torres-Vazquez et al.,[2000]). Примечательно также то, что Brinker не участвует в передаче сигналов BMP у большинства др. организмов, т.к. ген brinker, по-видимому, возник в качестве эволюционного новшества у насекомых. Ортологи brinker присутствуют у Anopheles и Culex (оба mosquitos), Pediculus (вошь), Apis (пчелы), Tribolium (жуки) и Bombyx (шелковичный червь), но не у Daphnia (водяной блохи, an arthropod и outgroup по отношению к насекомым). До сих пор brinker-подобный ген не был идентифицирован помимо насекомых (see Fig. 1). Интересно, что Pfam's алгоритмы для идентификации белковых доменов группы Brinker (see pfam.sanger.ac.uk/family?id=BrkDBD) с Pogo element transposases, предполагают, что Brinker мог бы эволюционировать с помощью мобильных элементов насекомых.
Ген brinker отсутствует у более удаленных членов Ecdysozoa, таких как nematodes, это указывает на то, что передача сигналов BMP у нематод, по-видимому, не использует механизм двойной репрессии. Поэтому интересно. что Caenorhabditis elegans (и briggsae) обладают членом семейства Schnurri, кодируемым геном sma-9 (Savage-Dunn et al.,[2003]; Liang et al.,[2003]). Этот ген, как предполагается, продуцирует множественные белки, содержащие до 7 цинковых пальчиков (организованных в 3 кластера) за счет альтернативного сплайсинга. Ген sma-9 был идентифицирован при скрининге мутантов на малую длину тела, скрининг, при котором были также идентифицированы несколько др. генов, кодирующих компоненты пути BMP, включая dbl-1 (dpp and bmp ligand-1, BMP лиганд червей) и sma-3 (Smad transducer) (Savage-Dunn et al.,[2003]). SMA-9, как было показано, функционирует ниже передачи сигналов DBL-1 (Liang et al.,[2003]), и противодействует передаче сигналов BMP при формировании дорсо-вентрального паттерна мезодермы червей (Foehr et al.,[2006]). Кроме того, путем использования слияний SMA-9 или с VP16 активатором транскрипции вируса герпеса или с engrailed доменами репрессии транскрипции, эксперименты по нормализации фенотипа показали, что SMA-9 может действовать как транскрипционный активатор и репрессор (Liang et al.,[2007]). Эти находки параллельны результатам, показывающим, что мушиный Schnurri играет двойную роль в обеспечении активации и репрессии (Yao et al.,[2006]). Аналогии с Drosophila могут стать яснее, когда будут выяснены механистические детали взаимодействийC. elegans's SMA-9 белка с BMP R-Smads и будут выяснены геномные мишени.

SCHNURRI IS AN EVOLUTIONARILY CONSERVED REGULATOR OF BMP TARGET GENES IN VERTEBRATES


Большинство геномов позвоночных, включая миног, содержат три Schnurri-related гена и такое утроение Schnurris, подобно Smads, также, по-видимому, произошло во время радиации agnathan (Fig. 1). Члены семейства Schnurri млекопитающих (4-5 цинковых пальчика, организованные с 2-3 кластера) по-разному известны Shn1/Hivep1/Mbp1/Zas1/PrdIIBFI (Fan and Maniatis,[1990]; Baldwin et al.,[1990]), Shn2/Hivep2/Mbp2/Zas2 (Nomura et al.,[1991]; van't Veer et al.,[1992]) и Shn3/Hivep3/Krc/Mbp3/Zas3 (Wu et al.,[1993]). Эти Shn белки были в основном исследованы в отношении их роли в регуляции ассортимента генов, включая те, что кодируют collagen type IIA, α-A-crystallin, α-1-antitrypsin, β interferon, MHC H2-Kb и HIV гены (see review by Wu,[2002]), но не было исследовано их участие в предаче сигналов BMP вплоть до недавнего времени (Yao et al.,[2006]; Jin et al.,[2006]).
Доказательства, подтверждающие роль Schnurris позвоночных в передаче сигналов BMP получены двумя независимыми путями. Во-первых, мыши, дефицитные по Shn2 имеют дефекты костного гомеостаза (Saita et al.,[2007]). shn2 мутантные мыши обнаруживают недостаточность способности остеобластов продуцировать кость и способности остеокластов резорбировать кость (Saita et al.,[2007]). Избыточная экспрессия Shn2 в остеобластах усиливает BMP-индуцированную дифференцировку (Saita et al.,[2007]), а BMPs играют роль в стимулировании обоих этих типов клеток. Помимо костных дефектов, shn2 KO мыши также обнаруживают уменьшение количества белой жировой ткани (Jin et al.,[2006]). Дефект адипогенеза связан с уменьшением способности гена, кодирующего peroxisome proliferator activator gamma 2, быть транскрипционно стимулированным с помощью BMPs. Интересно, что Shn2 взаимодействует с pparg2 промотором способом механистически отличным от взаимодействия Shn с Drosophila brkSE: Shn2 закрепляется на Smad1, по-видимому, с помощью Smad4, связанного с обычным SBE(s) в проксимальном региона промотора, в то же время также контактирует с белком C/EBP, др. фактором, который, как известно, играет роль в адипогенезе, связанным с каноническим CCAAT сайтом, расположенным дистальнее (Fig. 3C; Jin et al.,[2006]). Т.о., модель предполагает, что Shn2 посредством взаимодействий с DNA-связанными Smad1/4 и C/EBP, действует как транскрипционный активатор, чтобы индуцировать pparg2 в ответ на передачу сигналов BMP.
Др. связь между Schnurris и передачей сигналов BMP у позвоночных выявляется при исследовании cross-species поведения BRE из Xenopus vent2 гена (Candia et al.,[1997]; Rastegar et al.,[1999]; Hata et al.,[2000]; Karaulanov et al.,[2004]; von Bubnoff et al.,[2005]). BRE обеспечивает индукцию BMP во время гаструляции лягушек и обнаруживается также в промоторах двух др. BMP генов мишеней, id3 и bambi (Karaulanov et al.,[2004]; von Bubnoff et al.,[2005]). Трансгенные линии Drosophila , несущие BRE позвоночных, управляющие lacZ репортерным геном, проливают свет на то, как экспрессия генов мишеней позвоночных регулируется с помощью BMPs. Этот трансген содержит несколько сайтов связывания для Grainyhead (Grh), транскрипционного активатора, который управляет широкой экспрессией у эмбрионов мух и в эпителиальных слоях личиночных имагинальных дисков. Трансген неожиданно обнаружил паттерн экспрессии во время раннего эмбриогенеза, напоминающий таковой мушиных DPP генов мишеней (Yao et al.,[2006]) , подтверждая тем самым, что механизм DPP-индуцированной репрессии может иметь аналогию с механизмом активации у лягушек (Yao et al.,[2006]).
В полном контрасте с рецессивной функцией Schnurri, действующей на BRE (или brkSE) у Drosophila, избыточная экспрессия или человеческого Shn1 или мушиного Shn у эмбрионов лягушек активирует экспрессию репортера vent2 BRE luciferase (Yao et al.,[2006]). Человеческие фрагменты белка Shn1 вызывают супер сдвиг фрагмента BRE ДНК вместе со Smads (Yao et al.,[2006]) точно также как в ситуации с Drosophila brkSE (Pyrowolakis et al.,[2004]). Кроме того, как и в ситуации с мушиным brkSE, модификации лягушачьего vent2 BRE, которые изменяют пространственно расположение между его предполагаемыми BMP R-Smad и Smad4 сайтами связывания, без нарушения самих сайтов, сходным образом нарушают их способность функционировать в качестве BMP response element у эмбрионов лягушек (Yao et al,[2006]). Наконец, человеческий Shn1 белок может нормализовать schnurri мутантных эмбрионов мух столь же эффективно, что schnurri мух, указывая тем самым. что человеческий Schnurri может действовать как репрессор у мух точно также как Drosophila Schnurri может активировать репортерный ген с помощью vent2 BRE у Xenopus (Fig. 3D; Yao et al.,[2006]). Т.о., было постулировано, что присутствие или отсутствие коактиваторов и корепрессоров является критическим компонентом предопределения функций Schnurri's в двух системах. До сих пор имеется мало информации относительно природы кофакторов, влияющих на функцию Schnurri. Недавно, однако, было установлено, что прямое физическое взаимодействие C-terminal binding protein (CtBP), хорошо известно коротко действующего корепрессора, вносит вклад в способность Schnurri's репрессировать brk транскрипцию (Yao et al.,[2008]). У млекопитающих Shn1 взаимодействует с MSX2-interacting nuclear target белком (MINT; также известным как SHARP и SPEN), который в дальнейшем рекрутирует SMRT/NcoR, чтобы негативно регулировать ген collagen type IIA (col2a1) (Yang et al.,[2005]). Это единственный пример Schnurri белка, действующего, чтобы репрессировать транскрипцию генов у позвоночных. Однако может ли репрессия с помощью Shn1's гена col2a1 нуждаться в активной передаче сигналов BMP пока неизвестно.
Примечательно. что подобно мышиным shn2 мутантам, shn3 мутанты также обнаруживают дефекты костей. Однако в противоположность shn2, мутанты shn3 обнаруживают увеличение костной массы у взрослых в результате повышенной активности остеобластов (Jones et al.,[2006]). Shn3 действует в остеобластах в качестве негативного регулятора стабильности Runx2 белка (Jones et al.,[2006]). Сегодня нет доказательств, прямо связывающих Shn3 с транскрипционной регуляцией BMP генов мишеней и поэтому остается неясным, способны ли эти три Schnurris позвоночных быть функционально перекрывающимися.
Базируясь на этой части доказательств, становится ясно, что Schnurris взаимодействуют с BMP генами мишенями разными способами: (1) Shn1 может закрепляться на Smads 1 и 4 , соединяясь с brkSE-type elements/BREs у Drosophila (Fig. 3A) и Xenopus (Fig. 3D); (2) Shn2 связывает pparg2 промотор в адипоцитах путем взаимодействия со Smads и C/EBP (Fig. 3C), которые отдельно соединяются со своими сайтами на расстоянии менее чем на одну сотню пар оснований; and (3) Schnurris может связывать ДНК непосредственно с помощью своих собранных в кластеры доменов цинковые пальчики и также контактирует с Smads, связанными ссоседними SBE или GC-rich элементами, как и в случае взаимодействия мушиного Shn с Ubx B энхансером (Fig. 3B). Во всяком случае, Schnurris скорее всего используют сервисы связанных коактиваторов и корепрессоров, чтобы модулировать транскрипцию. Эти наблюдения указывают на то, что Schnurris действуют как остов, делающий возможным взаимодействие с широким разнообразием факторов и элементов ДНК. Т.к. три Schnurris позвоночных также широко экспрессируются (Wu,[2002]; Durr et al.,[2004]), то можно предположить, что посредством этих разнообразных взаимодействий Schnurri могут координировать с помощью BMP регуляцию разнообразных нижестоящих BMP мишеней. Такой высоко адаптивный механизм функционирования Schnurri может помогать поддержанию консерватизма передачи сигналов BMP во время эволюции, т.к. рекрутирование др. транскрипционных факторов в путь передачи сигналов BMP будет увеличивать его разнообразие. Мы придерживаемся этого мнения, мы также помним, что Schnurri гены отсутствуют у cnidarians или губок, показывая тем самым, что не все передачи сигналов BMP используют Schnurri. Напротив функциональные гомологи Schnurri у рано дивергировавших метазоа могут сильно дивергировать по своим последовательностям, так что простое сравнение последовательностей не способно их выявить.

WHERE DO WE GO FROM HERE? LOOKING INTO THE CRYSTAL BALL


How important are Schnurri proteins for BMP signaling in vertebrate cells? The suggestion that Schnurris play roles as scaffolding proteins, interacting with a variety of transcription factors to regulate many BMP targets, is testable. Schnurri loss-of-function analyses should yield critical information on this. The three Schnurri genes are coexpressed weakly and uniformly during Xenopus early embryogenesis (Durr et al.,[2004]; our unpublished observations), however, later patterns of spatial expression has not been explored. There is some evidence (reviewed in Wu,[2002]) suggesting that mouse Shns1 and 2 may be expressed more broadly and Shn3 may have a more restricted pattern, but his will require further analysis. However, redundancy between the three Shn genes will likely require complex knockout combinations. Therefore, multiple knockout/knockdown approaches in a variety of species such as mouse, Xenopus, and zebrafish will be necessary and informative.
Another area to be explored is the use of the recently developed methods of genome-wide analysis of transcription factor binding, most notably ChIP-on-chip and ChIP-seq methodologies. Application of these approaches to the binding patterns of the BMP R-Smads across the genome will likely yield valuable information on two major themes. First, this would be expected to provide a larger number of candidate genes for direct regulation by BMP signaling. And second, using de novo methods for identifying enriched sequence motifs, we may learn something about how Smads regulate BMP targets. For example, do the Smads mostly use GC-rich and SBE motifs to regulate targets, or is binding to transcription factor partners without direct Smad binding to DNA the more predominant mode of action of the Smads? This may seem like an odd question but a recent study, the first of this kind on the Smads, suggests this might be the case (Chen et al.,[2008]). ChIP-seq was used to examine the genome-wide binding patterns of 13 different transcription factors in mouse embryonic stem cells, including Smad1. The study concluded that Smad1 interacts with the genome primarily through composite Sox2-Oct4 sites in mES cells. As Oct4, Sox2, and Nanog also bound these sites in mES cells, it seems that Smad1 may bind these sequences as part of a complex with these other transcription factors, without binding DNA itself. It is not clear whether these researchers searched for GC-rich/SBE motifs in the regions bound by Smad1. If Smad1 does indeed bind DNA in other cell types primarily by means of protein-protein interactions, and not through SBE/GC-rich motifs, then the current dogma for how Smads recognize their genomic targets will require significant modification.