Хотя адреномедуллярные хромаффинные клетки являются наиболее изученными производными нервного гребня, всё ещё неясно существуют ли симпато-адреналовые предшественники в medulla надпочечников. Благодаря тесной связи хромаффинных клеток с сипатическими нейронами, однако, выделение, размножение и дифференцировка симпато-адреналовых предшественников из medulla надпочечников взрослых вселяет большие надежды в отношении лечения нейродегенеративных заболеваний. Основным преимуществом в исследованиях стволовых клеток стало открытие, что популяция недифференцированных мультипотентных нейральных клеток [27, 28] может быть выделена из дифференцированной нервной ткани и выращена в суспензии в виде нейросфер. Аналогично первичным нейральным клеткам, было установлена в данном исследовании стратегия выделения хромаффиных предшественников и дифференцировки из medulla надпочечников телят(Fig. 6) и предоставлены доказательства, что возможны пролиферация и дифференцировка компетентных хромаффинных клеток предшественников, выделенных из medulla надпочечников взрослых. Морфологическое и функциональное схоство надпочечников телят и человека [3. 29. 30] делает эти клетки идеальной моделью для разработки методов выделения и трансплантации хромаффинных клеток человека в будущем.

В отличие от близко родственных симпатических нейронов, medulla надпочечников способна пролиферировать в течение всей жизни: был предположено, что предшественники продолжают существовать в medulla надпочечников взрослых [31]. Первичные хромаффинные клетки выделялись посредством дифференциального plating, при этом удалялось большинство не хромаффинных клеток, таких как адренокортикальные и эндотелиальные клетки. Последующее культивирование low-attachment среде создавало избирательные условия для образования хромосфер (chromospheres). Выделение свободно плавающих кластеров клеток предшественников и стволовых клеток используется и для их выделения из др. тканей [24, 32-37]. В данном исследовании пролиферация клеток хромосфер обнаруживалась по их способности включать BrdU. Более того, клональный рост вторичных хромосфер из одиночных клеток диссоциированных первичных хромосфер предоставляет прямые доказательства способности этих клеток к самообновлению.

Действительно ли клетки предшественники само-обновляются? Чтобы ответить на этот вопрос, хромосферы иммуноокрашивали vimentin спустя 1 неделю просле включения BrdU. Белки промежуточных филамент, такие как vimentin или nestin, как было установлено, характеризуют стволовые клетки [38]. Само-обновление vimentin-позитивных клеток предшественников внутри хромосфер подтверждается включением BrdU в их ядро. Следовательно, существует пролиферация популяции компетентных предшественников внутри хромосфер. Кроме того, в хромосферах существуют vimentin⁺/BrdU^- клетки и vimentin^-/ BrdU^- клетки: это могут быть популяции молчащих предшественников и пролиферирующих клеток, не являющихся предшественниками или клеток, дифференцирующихся между мечением BrdU и окрашиванием на vimentin, соотв.

Помимо способности к само-обновлению, "stemness" клеток хромосфер подтверждается экспрессией некоторых маркеров нейральных предшественников. В противоположность первичным хромаффинным клеткам, клетки хромосфер, экспрессируют маркеры предшественников для нейральных стволовых клеток (nestin, vimentin, NGFR и musashi1) [24, 39-41]. Они также экспрессируют Sox9, член подгруппы SoxE, который играет важную роль в миграции и дифференцировке производных нервного гребня во время эмбрионального развития [42, 43]. Кроме того, недавно было показано, что Sox9 является общим маркером для многих тканеспецифических предшественников [44] и нейральных стволовых клеток в головном мозге [45]. Sox1 является транскрипционным фактором из SoxB 1 подгруппы, который поддерживает состояние, сходное с таковым стволовых клеток, и широко используется как маркер нейральных стволовых клеток [46].

Снижение экспрессии PNMT обусловлено тем фактом, что большинство клеток в первичной культуре medulla надпочечников - дифференцированные хромаффинные клетки - нежизнеспособны в суспензионной (nonadherent) культуре. Более того, экспрессия PNMT зависит от glucocorticoids [47] и поэтому подавляется в культуральных условиях без glucocorticoid. Недифференцированные nestin-экспрессирующие предшественники, однако, поддерживают пролиферацию и формируют трехмерные кластеры клеток в виде сфер в суспензии. Подобно нашим данным сферо-подобные PNMT-негативные структуры, которые могут также содержать клетки предшественники, наблюдали в первичных культурах хромаффиных клеток плода человека [14].

Затем был исследован состав хромосфер путем RT-PCR одиночных клеток, сопровождаемый nested PCR для более высокой чувствительности. RT-PCR одиночных клеток широко используется при изучении профилей экспрессии генов в стволовых клетках [48,49]. Этот метод позволяет определять даже низкие уровни экспрессии PNMT, которые сохраняются в условиях отсутствия глюкокортикоидов. Среда с низким прикреплением способствует nestin⁺ клеткам и неблагоприятна для PNMT⁺ клеток, в результате возникают 24% nestin⁺ клеток предшественников и 14% дифференцированных хромаффинных клеток после 2-х недель культивирования. Не обнаруживаются клетки, экспрессирующие nestin и PNMT, указывая тем самым на две разные популяции с характеристиками дифференцированных клеток или клеток предшественников, соотв. Чтобы проанализировать потенциал клеток хромосфер, диссоциированные клетки засевали на poly-D-lysine покрытые стекла и индуцировали дифференцировку, воздействуя специфическими факторами в бессывороточной среде с добавлением bFGF, EGF и LIF. Свободная от сыворотки среда с добавлением этих факторов создает хорошо охарактеризованные, определенные культуральные условия, используемые для поддержания и экспансии клеток предшественников [50-52]. При таких базовых условиях клетки хромосфер сохраняют свой недифференцированный статус, характеризующийся очень низкими уровнями PNMT мРНК и повышенной экспрессией nestin. Хорошо известно, что экспрессия PNMT индуцируется с помощью adrenocortical glucocorticoids. Кроме того, glucocorticoids, включая синтетический глюкокортикоид дексаметазон, индуцирует хромаффинный фенотип в результате активации CgA и TH in vivo и in vitro [53. 54]; в самом деле, воздействие Dex индуцирует PNMT и CgA в дифференцирующихся клетках, выделенных из хромосфер. Dex слегка, хотя и не достоверно, но повышает экспрессию вышестоящих catecholaminergic энзимов TH, DDC и DBH. Кроме того, на морфологическом уровне обработанные Dex клетки обнаруживают эндокринный фенотип, с крупным CgA-позитивным клеточным телом и отсутствием нейрон-подобных выростов. Эти данные указывают на потенциал хромаффинных клеток дифференцироваться в epinephrine-продуцирующие хромаффинные клетки.

Обработка NGF индуцирует нейрон-подобную дифференцировку клеток. происходящих из хромосфер с B3T-позитивыными выростами нейритов, подтверждающих нейрональную дифференцировку изолированных клеток предшественников [55. 56]. Сходная индукция дифференцировки нейронов наблюдается после воздействия на клетки BMP4. Индуцированная BMP-4 экспрессия B3T мРНК и на иммуногистохимическом уровне, выростов B3T-позитивных нейритов. Эффект BMP4 на нейральную дифференцировку противоречив и, по-видимому, зависит от стадии развития стволовых клеток. С др. стороны, BMP4 ингибирует нейральную дифференцировку эмбриональных стволовых клеток [57-59]. C др. стороны, благоприятная роль BMP4 на дифференцировку нейронов, происходящих из нервного гребня, хорошо известна [60. 61]. Под влиянием BMPs, продуцируемых дорсальной частью аорты, клетки нервного гребня развиваются в sympathoadrenal клетки предшественники, располагающиеся рядом с первичными симпатическими ганглиями, а BMP4, скорее всего, индуцирует TH в sympathoatlrenal предшественниках [62]. Избыточная экспрессия BMP-4 в мультипотентных нейральных предшественниках, происходящих из нервного гребня, инициирует noradrenergic свойства и экспрессию мРНК synnptotagmin l and neurexin l, которые являются белками, участвующими в секреции нейротрансмиттеров [63]. Поскольку neurexin экспрессируется только в нейронах, но не в нейроэндокринных клетках из medulla надпочечников, то BMP4 дифференциально индуцирует нейрональное развитие симпатоадреналовых предшественников в противовес развитию хромаффиных. Следовательно, полученные данные указывают на существование BMP4-чувствительных клеток предшественников в medulla надпочечников взрослых и их потенциал давать нейрон-подобные свойства под влиянием BMP4. BMP4 снижает, хотя и не достоверно, экспрессию DBH в дифференцирующихся клетках хромосфер. Это может указывать на потенциал BMP4 направлять эти дифференцирующиеся клетки на путь dopamine-продуцирующих нейронов.

Предполагается, что хромаффинные клетки способны трансдифференцироваться в нейрон-подобные клетки под влиянием NGF, как впервые было показано Unstulter et al. [10]. В данном исследовании большинство дифференцированных хромаффинных клеток удаляется из культуры с в среде с низким прикреплением, это ведет к обогащению nestin⁺ или vimenttn^- клеток предшественников. Следовательно, последующая дифференцировка в нейрон-подобные клетки скорее всего обусловлена дифференцировкой этих клеток предшественников и не связано с трансдифференцировкой хромаффинных клеток. Функциональное созревание нейронов из хромосфер оценивали с помощью whole-cell voltage-clamp регистрации. NGF-индуцированные дифференцированные клетки хромосфер приобретают все функциональные основные свойства зрелых нервных клеток, так что экспрессия токов натрия и генерация потенциалов действия сходны с первичными нейронами в культуре [64-66] или дифференцированными нейральными стволовыми клетками из разных источников [67-70].

Относительно развития хромаффинных клеток и симпатических нейронов выдвигаются две гипотезы (rev. [1]). Широко принимаемая гипотеза указывает на существование общих TH-позитивных предшественников для хромаффинных клеток и симпатических нейронов, расположенных в первичных симпатических ганглиях, коэкспрессирующих нейральные маркеры и специфичные хромаффинные маркеры. Вторая гипотеза предполагает, что хромаффинные и симпатические клетки развиваются независимо, исходя из того факта, что самостоятельные предшественники хромаффинных клеток и симпатических нейронов с экспрессией разных маркеров обнаруживаются во время эмбрионального развития до образования дискретных зачатков надпочечников [71, 72]. Клетки хромосфер, выделенные из medulla надпочечников взрослых в настоящем исследовании, обнаруживали признаки предшественников вместе со способностью к бипотенциальной дифференцировке, тем самым указывая на существование общих клеток предшественников для симпатических и хромаффинных клеток, субпопуляция которых может персистировать в medulla надпочечников взрослых.

Т.о., данное исследование представляет доказательства, что происходящие из нервного гребня клетки предшественники могут быть эффективно выделены из medulla надпочечников. Будучи защищены от прикрепления к стенкам, эти клетки образуют сферы, обладающие способностью к само-обновлению и способностью дифференцироваться в хромаффинные клетки и нейроны. Существование и выделение хромаффинных клеток предшественников из medulla надпочечников взрослых может быть использовано для лечения нейродегенеративных болезней, таких как болезнь Паркинсона.