Insulin-like growth factor I (IGF-I) является членом семейства инсулина, которое регулирует развитие и тканевой [1], [2]. Он действует прежде всего путем соединения с высоким сродством с IGF-I тирозин киназным рецептором (IGF1R), а его активность модулируется с помощью IGF-связывающих белков (IGFBP) [3]. IGF факторы, рецепторы и связывающие белки формируют IGF систему. Пик экспрессии IGF-I в нервной системе приходится на поздний эмбриональный и неонатальный период, хотя довольно высокая экспрессия сохраняется в областях высокой пластичности, таких как обонятельные луковицы и гиппокамп [4]. Мутации у мышей показали, IGF-I модулирует жизнеспособность, пролиферацию и дифференцировку всех нейральных клонов, и он способствует синаптогенезу и образованию дендритного древа в проекционных нейронах [4], [5]. Активация IGF1R ведет к фосфорилированию субстратов инсулиновых рецепторов и к активации цитозольных серин-треониновых MAP киназ и Akt киназ, которые индуцируют транслокацию транскрипционных факторов в ядра клеток, инициируя тем самым программы экспрессии специфических [6], [7]. Дефицит IGF-I ассоциирует с тяжелыми нарушениями нервной системы, включая нейро-дегенеративные болезни, а воздействие IGF-I способствует репарации и регенерации нервных клеток [8]. Гомозиготные мутации у человека IGF-I вызывает широкий круг нарушений, включая внутриутробную задержку роста, неспособность к постнатальному росту, микроцефалию и умственную отсталость. Они также вызывают тяжелую билатеральную сенсоронейральную глухоту (ORPHA73272; http://www.orpha.net; [9], [10], [11]).

Нормальное развитие внутреннего уха зависит от передачи сигналов IGF-I [12]. Слуховой сенсорный эпителий является Органом Корти, который состоит из линейных рядов волосковых и поддерживающих клеток, расположенных в улитке. Внутреннее ухо мыши развивается с embryonic day (E)8 из слуховой плакоды, участка эктодермы, который инвагинирует и деформируется. Чтобы сформировать слуховой пузырёк, из которого развиваются все сенсорные эпителиальные клетки и сенсорные нейроны. На ст. E15.5 орган Корти приобретает полный набор всех типов клеток, хотя они не становятся функционально зрелыми вплоть до начала слуховой функции на 12-14 день постнатального развития [13]. Igf1нулевые мыши (Igf1?/?) являются карликовыми, это указывает на орган-специфическую задержку роста и уменьшение головного мозга на 30%. Влияние на нервную систему характеризуется потерей определенных популяций нейронов, гипомиэлинизироанием и снижением скорости проведения периферических сигналов [14], [15]. Как и у человека дефицит IGF-I у мышей вызывает билатеральную сенсоронейральную потерю слуха всех частот и задержку реакции на акустические стимулы [16]. С постнатального дня P5 развитие улитки тяжело нарушено у Igf1-/-мышей, у которых формируется маленькая улитка с незрелой текториальной мембраной. Кроме того, эти животные страдают нарушениями синаптогенеза, аномальной иннервацией сенсорных волосковых клеток в кортиевом органе, слабой и существенным снижением количества и размеров слуховых [17], [18]. Заметное уменьшение количества нейральных клеток на ст. P20 обусловлено усилением апоптической гибели клеток как нейронов. Так и Шванновских клеток [17]. Исследовали otic-специфические мишени для передачи сигналов IGF-I. Сравнение профилей генной экспрессии в улитке дикого типа (Igf1+/+) и Igf1-/- мышей на ст. E18.5 показало, что IGF-I модулирует дифференцировку сенсорных клеток и выбор нейральной клеточной судьбы во время позднего слухового развития. Паттерны экспрессии Six6, Mash1 и Fgf15 изменены в улитке Igf1-/- мышей. Изменения обнаруживаются также в экспрессии уровней белков и в ядерной локализации FoxM1, forkhead box транскрипционного фактора, который повсеместно экспрессируется в пролиферирующих клетках, а одной из его мишеней является cyclin-зависимый киназный ингибитор p27Kip. Анализ промоторных регионов дифференциально экспрессирующихся генов, отобранных для анализа микромассивов нулевых и дикого типа улиток на ст. E18.5, подчеркнул, что транскрипционный фактор myocyte enhancing factor 2 (MEF2) является новой нижестоящей мишенью передачи сигналов IGF-I в улитке. Экспрессия в ядре MEF2A и D была ниже в отсутствие IGF-I. Т.о., впервые было показано, что активности MEF2 и FoxM1 модулируются с помощью IGF-I в улитке мыши. Discussion Top Изучали молекулярные механизмы, с помощью которых IGF-I регулирует развитие и созревание улитки мыши: i) пространственно-временную экспрессию факторов, рецепторов и связывающих белков системы IGF; ii) активацию основных IGF-I сигнальных киназ Akt, ERK и p38; iii) изменения тотального транскриптома улитки, вызываемых дефицитом IGF-I с использованием массивом мРНК; и iv) факторов транскрипции, ассоциированных с регуляцией клеточного цикла нейронов, модулируемых с помощью доступности IGF-I availability. Выявлены новые регуляторные гены для развития улитки, чья нормальная экспрессия и активация зависят от IGF-I. Тяжёлая синдромная глухота у человека ассоциирует в мутациями в IGF1 [9], [10], [11] , а также с IGF-I [47]. Соотв. мыши Igf1-/- обнаруживают низкую скорость роста, высокую смертность, выраженную сенсоронейральную глухоту и поздние постнатальные морфологические альтерации в улитке [16]. Ранее мыло показано, что отсутствие IGF-I вызывает бедную миэлинизацию и задержку созревания слуховых нейронов, в которых обнаруживается апоптоз во время раннего постнатального развития мыши P5-P20 [17], [18]. При рождении, , однако, улитка Igf1?/? мышей имеет нормальные размеры ожидаемым набором типов клеток в органе Корти. На молекулярном уровне признаки задержки дифференцировки уже очевидны, но молекулярные сигналы, лежащие в основе этого фенотипа неизвестны. Здесь было показано, что дефицит IGF-I может быть компенсирован, по крайне мере частично, за счёт усиления экспрессии его рецептора высокого сродства, которые также может быть активирован и др. факторами семейства инсулинов, чьи уровни экспрессии оставались неизменными. Типичные IGF-I внутриклеточные мишени киназы, также были изучены в улитке и оказалось, что наблюдается 25% редукция активированных форм способствующих выживанию Akt kinase и ассоциированной с пролиферацией ERK1/2, с драматическим увеличением уровней стрессовой p38.

С помощью анализа микромассивов идентифицировано 231 генов, которые дифференциально экспрессируются в улитке Igf1-/- мышей. Субнабор этих генов был изучен далее с помощью комбинации комплементраных подходов во внутреннем ухе. На Рис.. 8 схематически показана локализация дифференциально экспрессируемых генов в улитке Igf1-/-, которые, как известно, важны для развития внутреннего уха или сцеплены с наследуемой глухотой (9% от всех), включая Kcnd2, Slc19a2 and Ush1c. Последний кодирует белок стереоцилий harmonin , а мутации в этом гене вызывают синдром Usher's Syndrome 1C [32]. Интересно, что синдром включает дегенерацию сетчатки, которая также ассоциирует с мутациями в Rp1h [34], гене, экспрессируемом на высоких уровнях Igf1-/- улитке. Избыточная экспрессия IGF-I вызывает выраженные альтерации в васкуляризации глаз мышей [48], но насколько нам известно, нет сообщений о дефектах глаз, связанных с дефицитом IGF-I. Напротив, IGF-I дефицит у мышей тяжело нарушает нормальное развитие обонятельных луковиц [49]. 91% генов, которые были найдены нами, как дифференциально экспрессирующиеся в улитке Igf1?/? не было описано ранее. Напр., Fgf15, ортолог человеческого и куриного гена Fgf19, обнаруживает паттерн экспрессии, подтверждающий новый вклад в спецификацию судеб клеток в сенсорном эпителии. Это ставит вопрос о специфической роли этого члена семейства FGF во время развития внутреннего уха и его регуляции с помощью IGF-I [12].

Figure 8. Differentially expressed genes in the IGF-I-deficient cochlea. Names of selected differentially expressed genes (red) are shown on a schematic drawing of the adult scala media. BC, border cells; BsC, basal cells; BM, basilar membrane; CC, Claudius's cells; DC, Deiter's cells; HC, Hensen's cells; IC, intermediate cells; IDC, interdental cells; IHC, inner hair cells; IPC, inner phalangeal cells; IS, inner sulcus; Li, spiral limbus; MC, marginal cells; OHC, outer hair cells; PC, pillar cells; RM, Reisner's membrane; AG, auditory ganglion; SL, spiral ligament; SM, scala media; ST, scala tympani; SV, scala vestibuli; TM, tectorial membrane. Некоторые транспортеры, фундаментальные для трафика синаптических пузырьков, также экспрессируются дифференциально в Igf1-/- улитке, это согласуется с предыдущими наблюдениями аберрантных синапсов во внутренних волосковых клетках [17]. Напр., thiamine транспортер, Slc19a2 [32], [50], choline и acetylcholine транспортеры, Slc5a7 и Slc18a3 [51], и мембранный белок Vamp1 как обычно экспрессируются во ВВК мыши, но их уровни существенно ниже в улитке Igf1-/-. Напротив Mlc1, который кодирует белок, локализующийся в афферентных волокнах к ВВК [52], экспрессируется на более высоких уровнях. Эти данные подтверждают идею, что IGF-I является ключевой молекулой для созревания слуховых нейронов и в усовершенствовании синаптических соединений на ВВК.

Отклонения в гомеостазе и транспорте ионов также ассоциируют с дефицитом IGF-I , поскольку Kcnd2, Kif17, Kcnmb1 и Cacna1f обнаруживают более низкие уровни в Igf1-/- улитке. Kcnd2 кодирует K+ канал Kv4.2, который экспрессируется в нейронах, которые иннервируют апикальные части волосковых клеток, это регулирует возбудимость дендритов [53] и который транспортируется в дендриты с помощью kinesin Kif17 [54]. Кальцием активируемый калиевый канал Kcnmb1, как известно, экспрессируется в улитке , но нулевые мыши не обнаруживают очевидных фенотипических отклонений или нарушений слуха [55]. Напротив, присутствие кальциева канала Cacna1f ранее не было описано в улитке мыши, но мутации у человека и мыши вызывают нарушения нейротрансмиссии в сетчатке [56], [57]. Кроме того, дифференциально регулируемые гены включают Claudin 18 белок плотных соединений, экспрессирующийся в stria vascularis [2], и estrogen related receptor Esrrb, чьи мутации у человека вызывают аутосомно-рецессивное несиндромальное нарушение слуха, и который экспрессируется в контролирует развитие маргинальных клеток сосудистой [20], [21]. Эти данные указыват на то, что гомеостаз ионов и везикулярный транспорт нарушены у глухих Igf1-/- мышей.

Спецификация нейрональных судеб обеспечивается транскрипционными факторами, такими как Six6 и Mash1, которые обычно экспрессируются в ЦНС. Six6 является членом семейства Six/sine oculis и, как известно, экспрессируется в развивающейся и зрелой сетчатки, зрительном нерве в гипоталямических и гипофизарных регионах [58], [59]. Mash1 является пронейральным транскрипционным фактором из семейства basic helix-loop-helix, который участвует в детерминации нейральных предшественников, способствует выходу из клеточного цикла т миграции нейронов и в финальной спецификации качественных особенностей нейронов в головном мозге [60], [61]. Интересно, что оба гена обнаруживают усиление экспрессии в эмбриональной улитке Igf1-/- мышей, Mash1 транскрипты обнаруживаются в центральной части слухового нерва на глиальной переходной зоне[37], где Atoh1, др. член семейства bHLH транскрипционных факторов [62], как было установлено, играет центральную роль в жизнеспособности корешков нейронов и участвует в функциональном поддержании периферических и центральных слуховых путей [63]. Эти данные указывают на то, что эти bHLH транскрипционные факторы является ключевыми игроками в дифференцировке и жизнеспособности нейронов на месте взаимодействия периферической и центральной нервных систем.

IGF-I способствует более быстрому переходу из слуховых нейральных предшественников к зрелому нейральному состоянию в развивающемся внутреннем ухе кур [12], [64]. Эти данные указывают на то, что IGF-I репрессирует экспрессию Six6 и Mash1 во время нормального развития внутреннего уха прямо или косвенно, чтобы облегчить дифференцировку нейронов

Известно, что IGF-I является ключевым фактором для хода клеточного цикла и репарации ДНК некоторых типов клеток Igf1-/- мышей, включая, нейроны улитки, которые оказываются более мелкими и более незрелыми, чем у мышей дикого типа [17], [18], [65]. Здесь мы показали, что в улитке дефицит IGF-I вызывает увеличение уровней экспрессии IGF1R, хотя обнаруживается определенное снижение в соотношении фосфорилирования тирозина, в увеличении активированной phospho-p38 стресс киназы и снижении уровней активных фосфорилированных форм ERK1/2 и Akt, главных внутриклеточных исполнителей действия IGF-I, указывая тем самым. Что баланс между клеточной пролиферацией, жизнеспособностью и дифференцировкой нарушен. Однако сложность регуляции клеточных процессов доказывается контрастирующим увеличением уровней экспрессии forkhead транскрипционного фактора Foxm1. FoxM1 важен для хода митозов и для транскрипционной реакции во время передачи сигналов , связанных с повреждениями ДНК и checkpoint [42], [66], [67]. Его присутствие в развивающейся улитке ранее не было отмечено. Его усиленная активация в Igf1?/? улитке подтверждена его ядерной локализацией и с помощью ингибирования одной из его нижестоящих мишеней, cyclin-зависимого киназного ингибитора p27Kip1. Напротив, транскрипты др. белков клеточного цикла, таких как , INCENP, экспрессируются на более низких уровнях, указывая на проблемы с расхождением хромосом [68]. В ранней постнатальной улитке Igf1?/? мыши имеется повышенный апоптоз нейронов и задержка созревания нейронов, но нет доказательств изменений в клеточной пролиферации или повреждений клеток [17]. Следовательно, активация FoxM1 компенсирует разбалансированное прохождение через клеточный цикл, вызываемое дефицитом IGF-I.

Информация о др. мишенях IGF-I в улитке получена при анализе in silico промоторов модулированных с помощью IGF-I генов, она выявляет потенциальную MEF2 и его модуляции с помощью IGF-I в улитке. MEF2 является существенным для миогенеза и нейрональной дифференцировки [45], [69]. В обоих типах клеток, IGF-I активирует MEF2 за счёт снижения скорости деградации и предупреждая его транслокацию из ядра в цитоплазму [46], [69]. MEF2D экспрессируется в сенсорных нейронах во время развития и регулируется с помощью TrkA-зависимого ERK5 пути, это способствует выживанию нейронов [70]. MEF2 активируется с помощью Raf/MAPK каскада [46] , а также с помощью p38 MAPK [71]. Здесь мы показали, что MEF2A и D, но не C экспрессируются на высоких уровнях в ядрах нейронов эмбрионального слухового ганглия мышей и что уровни белка MEF2 в ядре ниже в развивающейся Igf1?/? улитке. Эти данные подкрепляют заключение, что MEF2A и D являются ключевыми мишенями для действия IGF-I в улитке и что они могут играть фундаментальную роль во время развития улитки. Впервые MEF2 транскрипционные факторы обнаружены в слуховом ганглии.

Итак, мы показали, что Igf1 и Igf1r экспрессируются в развивающейся улитке мышей в виде комплементарных клеточных паттернов. stria vascularis , по-видимому, является источником IGF-I в улитке. Анализ IGF-I-дефицитных улиток показал, что уровни передач сигналов Akt и ERK1/2 более низкие и что активация p38 значительно выше. Выяснение профиля транскрипции в Igf1?/? улитке выявило потенциальные новые мишени для IGF-I, включая факторы, подобные Six6, Mash1 и Fgf15. Наконец, транскрипционные факторы FoxM1, Mef2a и Mef2d экспрессируются в развивающемся внутреннем ухе, а из субклеточная локализация модулируется с помощью доступности IGF-I. Представленные результаты предоставляют новую информацию о механизмах, с помощью которых IGF-I поддерживает сенсорные клетки и жизнеспособность и дифференцировку нейронов в слуховом рецепторе и выявили новые регуляторные механизмы клеточного цикла во время развития улитки.