Посещений:
КОНТРОЛЬ КАЧЕСТВА БЕЛКОВ В ER

Роль Убиквитилирования

The ubiquitylation machinery of the endoplasmic reticulum
Christian Hirsch, Robert Gauss, Sabine C. Horn, Oliver Neuber & Thomas Sommer
Nature 458, n7237, 453-460 (26 March 2009) | doi:10.1038/nature07962

As proteins travel through the endoplasmic reticulum (ER), a quality-control system retains newly synthesized polypeptides and supports their maturation. Only properly folded proteins are released to their designated destinations. Proteins that cannot mature are left to accumulate, impairing the function of the ER. To maintain homeostasis, the protein-quality-control system singles out aberrant polypeptides and delivers them to the cytosol, where they are destroyed by the proteasome. The importance of this pathway is evident from the growing list of pathologies associated with quality-control defects in the ER.


Рис.1.  |  Protein degradation at the endoplasmic reticulum (ER).


Рис.2.  |  Mechanism of protein degradation in yeast and mammalian cells.


Рис.3.  | Protein homeostasis in the ER.


Рис.4.  |  Processing of N-linked glycans in the yeast and mammalian ER.

Приблизительно 20% белков, кодируемых геномом человека, являются секреторными белками1. Эти белки проходят через endoplasmic reticulum (ER) по пути к месту своего предназначения в мембраны, экзоцитотические и эндоцитотические компартменты или за пределч клетки. Но это далеко не пассивный переход и ER содержит набор молекулярных хаперонов (chaperones), которые помогают белкам упаковываться и ведут к их созреванию. Биогенез белков склонен к ошибкам. Приблизительно треть всех вновь синтезированных белков деградирует ко-трансляционно или разрушается в течение минут после их синтеза2, указывая, что эти полипептиды неспособны поддерживать свою нативную конформацию благодаря мутациям, ошибкам транскрипции и трансляции, дефектам укладки или несбалансированного создания субъединиц. Зрелые белки могут быть повреждены средовыми условиями, такими как облучение высоких энергий, химическими воздействиями или побочными продуктами метаболизма. С неправильной функцией или с дефектной агрегацией белки бросают вызов гомеостазу ER и клетке, как целому. Как результат эволюция создала систему, располагающуюся в ER, protein-quality-control, который оперирует на нескольких уровнях, чтобы поддерживать целостность ER.
Когда полипептиды синтезируются впервые, они защищены от деградации специфической N-сцепленной glycan структурой, это делает возможным их созревание. Позднее, потенциально неправильно упакованные субстраты помечаются уникальным glycan кодом, генерируемым с помощью mannosidases в ER (Fig. 1). Этот сигнал декодируется с помощью ubiquitin лигазы, закрепленной на ER мембране. Белки, определенные на деградацию транспортируются через ER мембрану, ubiquitylated и деградируются с помощью 26S протеосом, с помощью процесса, обозначаемого как ER-associated degradation (ERAD). Неправильно уложенные белки являются не только субстратами, падающими жертвой этой системы; она также регулирует синтез стеролов путем элиминации в пути скорость-ограничивающего энзима, когда стеролы присутствуют в избытке3.
Первоначально биохимические и генетические скрининги позволили исследователям идентифицировать компоненты, которые составляют систему ERAD. Сегодня исследуются функциональные аспекты этой системы, напр., недавно открыто устранение неправильно упакованных glycoproteins. Поскольку ERAD пути, по-видимому, законсервированы от дрожжей до млекопитающих, мы будем использовать дрожжи Saccharomyces cerevisiae для вычленения фундаментальных процессов и распространим наши находки на примеры системы у млекопитающих. Рис. 2 представляет общий обзор соотв. дрожжевых и млекопитающих ERAD факторов в их соотв. клеточных компартментах.

Glycans and protein folding


Первичной функцией системы ER's protein quality-control является удержание неупакованных белков в ER. Hsp70-типа и glycan-зависимые хапероны связывают не-нативные белки, чтобы предупредить их экспорт в Golgi, и действуют совместно с oxidoreductases, чтобы удалять белки, которые имеют неправильные конформации. Общепринятое мнение полагает, что аппарат экспорта принимает только белки, которые получили свою нативную укладку на базе сигналов выхода, вставленных в первичную последовательность полипептида4. Альтернативная модель предполагает, что имеется гибкий стандарт для экспорта белка5, базирующийся на энергетике белковых складок и на клеточно-специфических условиях укладки (Fig. 3 and Box 1).
Большинство полипептидов, синтезируемых в ER модифицируется за счет N-сцепленных олигосахаридов. Oligosaccharyltransferase ковалентно присоединяет glucose3-mannose9-N-acetylglucosamine2 олигосахариды к asparagines в Asn-X-Ser/Thr мотивах полипептидов, которые вступают в ER (Fig. 4). первоначально, N-glycans делают белки более гидрофильными и управляют ко-трансляционной укладкой белков6. Более того, модификации в структуре олигосахаридов предоставляют информацию о существующем состоянии укладки белка. Две самые дальние от середины молекулы глюкозы затем немедленно удаляются с помощью α-glucosidases, присутствующих в ER, чтобы пометить полипептиды как в процессе укладки (Fig. 4). На этой стадии, glycan-зависимые хапероны ассоциируют с белком. В клетках млекопитающих, calnexin или calreticulin соединяются с monoglucosylated гликопротеинами и способствуют их созреванию7. Затем высвобожденная из этих хаперонов ER alpha-glucosidase-II срезает остатки молекул глюкозы, чтобы предупредить повторную ассоциацию с calnexin или calreticulin. Гликопротеины, которые успешно сохранили свою нативную структуру, получают возможность покинуть ER8.
Но что происходит с полипептидами, которые нуждаются в большем ассистировании для созревания? Существует главный сенсор укладки в ER млекопитающих, UDP-glucose:glycoprotein glucosyltransferase (GT, также наз. UGGT), который распознает не-нативные полипептиды и повторно гликозилирует A ветвь олигосахаридов, чтобы инициировать их повторную ассоциацию с calnexin или calreticulin для дальнейшей укладки9 (Fig. 4b). Этот calnexin-calreticulin цикл служит в качестве первого слоя контроля качества белка в клетках млекопитающих. Однако, если полипептид исчерпал свои шансы к созреванию, то дальнейшая стрижка олигосахарида может запустить его деструкцию.

Moulding the signal for destruction


Полипептиды, которые неспособны приобретать свою нативную структуру, д. быть деградированы, чтобы предупредить бесплодные попытки укладки и избавить ER от перенаселения неправильно уложенными полипептидами. Модель 'mannose timer' предполагает, что удаление маннозных остатков завершает время белка, гарантированное для приобретения нативной конформации10. В самом деле, члены семейства glycosylhydrolase-47 (GH47) в ER инициируют удаление неправильно уложенных полипептидов. У дрожжей GH47 семейство состоит из двух белков. обнаруженных в ER: Mns1 (α1,2-mannosidase) и mannosidase-подобного белка Htm1 (homologue to mannosidase 1, также наз. Mnl1 = mannosidase-like 1). Mns1 удаляет наиболее удаленные от центра остатки маннозы с B ветви N-glycans11 (Fig. 4). Эта ступень стрижки затрагивает практически все гликопротеины в ER , не внося вклада в созревание гликопротеина или жизнеспособность дрожжей12, 13. Делеция гена MNS1, однако задерживает разрушение аберрантных белков13, указывая тем самым, что гликопротеины защищены от деградации вплоть до тех пор, пока Mns1 не превратит mannose9-N-acetylglucosamine2 glycan в mannose8-N-acetylglucosamine2 glycan.
Т.к. Mns1 преобразует белки независимо от их состояния укладки, то одной mannose8 структуры недостаточно для запуска разрушения гликопротеина; дополнительная signature д. отличать дефектные полипептиды от зрелых белков. Htm1 , как первоначально было предположено, функционирует как lectin14, 15, но хотя прямые доказательства всё ещё отсутствуют, очевидно что она участвует в удалении capping α1,2-mannose c C ветви из N-glycans, которые были преобразованы с помощью Mns1 (ref. 16). Последовательное действие Mns1 и Htm1, следовательно, генерирует уникальную структуру, связанной с белком mannose7-N-acetylglucosamine2, которая метит потенциальный субстрат для ERAD. Эта идея объясняет также, почему делеция гена, кодирующего α1,3-mannosyltransferase (Alg3), позволяет обходить потребность в Htm1 во время деградации гликопротеина13. Структура mannose5-N-acetylglucosamine2, обнаруживаемая на N-glycoproteins клеток Δalg3 уже оснащена терминальным α1,6-mannosyl остатком, генерируемым с помощью Htm1. Как Htm1 выбирает свои субстраты, неизвестно. Она образует комплекс с белком disulphide isomerase Pdi1 (ref. 16), так что действие Htm1 может быть ограничено этим субстратом из Pdi1, который ассоциирует с oxidoreductase в течение продолжительного времени.
В клетках млекопитающих, семейство GH47 оказалось состоящим из 4-х членов, обнаруживаемых в ER: ER α1,2-mannosidase-I (ERManI) и три mannosidase-подобных белка, EDEM1, EDEM2 и EDEM3 (ref. 17). Подобно своему дрожжевому ортологу ERManI млекопитающих гидролизует mannose-α1,2-mannose связи, высвобождая остатки маннозы из B ветви18. Обилие ERManI влияет на стабильность субстратов ERAD. Нокдаун ERManI с помощью коротких interfering RNA (siRNA) нарушает деградацию нерасщепленного предшественника asialoglycoprotein рецептора H2a19. Избыточная экспрессия ERManI совпадает с усилением de-mannosylation и разрушением нулевого Hongkong (NHK) варианта α1-antitrypsin20, 21.
Так, у дрожжей действие только ERManI недостаточно, чтобы пометить гликопротеин на деградацию. Возможно ERManI д. кооперировать с членами семейства EDEM, чтобы запустить удаление аберрантных гликопротеинов. Хотя когда-то верили, что они являются лектинами, но теперь имеющиеся данные говорят, что EDEMs являются mannosidases, подобными Htm1. Избыточная экспрессия EDEM1 и EDEM3 совпадает со стрижкой маннозы из гликанов, прикрепленных к субстратам, таким как NHK, BACE451 и α-субъединица T-клеточного рецептора22, 23. Более того, структурное моделирование EDEM белков выявляет поразительносе сходство с ERManI и показывает, что все остатки, важные для каталитической активности ERManI, законсервированы24. Это указывает на то, что, по крайней мере, EDEM1 и EDEM3 также действуют как mannosidases. Как эти энзимы выбирают свои субстраты ещё предстоит установить. EDEM1 взаимодействует с calnexin, при этом он может находить гликопротеины, которые заловлены в ловушку calnexin-calreticulin цикла деградации25, 26.

The ERAD system sorts it out


Неправилно упакованные гликопротеины, которые были преобразованы ER mannosidase I и Htm1, д. в конечном итоге попадаться ubiquitin лигазе для ubiquitylation. Аберрантные субстраты, которые не были гликозилированы разделяют эту же судьбу, хотя события, которые инициируют их деградацию изучены плохо. Обзор ERAD субстратов представлен в Box 2. Гетерогенность дефектов, которые могут появиться, и мнение, что ошибки могут возникать в просветном, трансмембранном или цитозольном домене белка делают необходимыми разные E3 лигазы, которые используют дополнительные факторы для рекрутирования окончательно неправильно упакованных белков.

Different defects require different pathways


У дрожжей имеются две E3 лигазы, которые находят в основном дискретные субстраты. Лигаза Doa10 (degradation of Mat-α2-10) действует на субстраты с повреждениями в их цитозольном домене, тогда как субстраты для HRD (HMG-CoA reductase degradation) лигазы обычно имеют дефекты в их трансмембранном или просветном домене. Чтобы подчеркнуть эти различия, было предположено увеличение срока ERAD: ERAD-C деградирует белки с дефектными цитозольными доменами; ERAD-M распознает повреждения в мембранных доменах; а ERAD-L находит просветные субстраты27, 28. Все три пути начинаются на разных ветвях и сходятся в цитозоле. Белки с множественными дефектами преимущество преобразуются с помощью ERAD-C, который, по-видимому, оперирует быстрее др. путей28. Необходимо отметить однако, что эта терминология базируется на ограниченном наборе субстратов у дрожжей и может быть неприложима ко всему.

Keynotes from ERAD in yeast


HRD лигаза является закрепленным на мембране комплексом, представленным, по крайней мере, 5 самостоятельными субъединицами. Hrd1/Der3 характеризуется 6 трансмембранными доменами и цитозольным RING-finger доменом, который ubiquitylates белки мишени из лигаз29,30, Hrd1 взаимодействует с Usa1 (U1-Snp1 associating-1)27, the адаптором для Der1 (degradation in the ER-1)31. Обращенный в просвет домен HRD комплекса состоит из двух белков: Hrd3 и Yos9 (yeast OS-9 homologue)27, 32-34. Последний оснащен mannose-6 phosphate receptor homology (MRH) доменом, который распознает N-glycans, содержащие терминальную α1,6-сцепленную маннозу35, структуры, генерируемые с помощью Htm1 (ref. 16). Мутации в MRH домене устраняют связывание N-glycans и тем самым нарушают CPY* (CPY с мутацией glycine в arginine в позиции 255) и др. гликозилированные полипептиды35, указывая на то. что Yos9 связывает распознавание неправильно упакованных гликопротеинов с ubiquitin-протеосомной системой. Однако делеция Yos9 или удаление сайта гликозилирования в CPY* не нарушает взаимодействия между субстратом и HRD лигазой33, 34. Какова же функция Yos9 или glycans на CPY*, если они не нужны для связывания субстрата? MRH домен у Yos9 может сканировать клиентские белки на наличие mannose7-N-acetylglucosamine2 glycan без вовлечения в стабильное взаимодействие. Вместо этого др. компоненты комплекса могут присоединяться к неправильно уложенным полипептидам. В самом деле, Hrd3 связывает аберрантные белки и оказывает предпочтение гидрофобным полипептидам34. Также ассоциированным с Yos9 является Hsp70 хаперон Kar2 (karyogamy 2)33, показывая, что домен, обращенный в просвет, у HRD лигазы может взаимодействовать с неправильно упакованными белками с помощью разных способов.
Хотя и спекулятивная, следующая модель может объяснить, как нежелательные полипептиды отбираются с помощью HRD комплекса для удаления их из ER. Эскортируемые Kar2, не-нативные полипептиды достигают до HRD лигазы. Эти полипептиды могут быть или терминально неправильно упакованными видами или белками, которые в конечном итоге созревают. Затем, Hrd3 соединяется с потенциальным субстратом, вообще-то посредством гидрофобных участков внутри субстрата. Между тем, Yos9 инспектирует клиентские белки на присутствие терминальной α1,6-сцепленной маннозы. Лишь субстраты, которые конкурентно распознаются Yos9 и Hrd3, будут ubiquitylated с помощью Hrd1, при этом гликопротеины, которые несут mannose8-9 glycans, будут высвобождаться для дальнейшей повторной укладки.
Избыточная экспрессия Hrd1 в отсутствии Yos9 и Hrd3 ведет к смешанной деградации расположенных в ER белков33, подтверждая, что Hrd3 и Yos9 могут действовать как охранники, чтобы гарантировать, что только законные субстраты будут достигать цитозоля для ubiquitylation. К тому же Hrd1 действует вместе с растворимым E2 энзимом Ubc1 (ubiquitin-conjugating enzyme 1) и с Ubc7, который рекрутируется на ER мембрану благодаря взаимодействию с Cue1 (coupling of ubiquitin conjugation to ER degradation 1)29, 36.
Вторая E3 лигаза, присутствующая в ER мембране дрожжей, это Doa10. Этот белок впервые выделен при скрининге факторов. которые деградируют растворимый транскрипционные репрессор Matα2 (ref. 37). C идентификацией некоторых связанных с мембраной субстратов, Doa10 оказался также связанным с ERAD путем. Doa10 характеризуется N-терминальным RING-finger и 14 трансмембранными доменами38. Несмотря на сложную мембранную топологию субъединичный состав комплекса относительно прост: единственными идентифицированными кофакторами Doa10 являются E2 энзимы Ubc6 и Ubc7. Последний рекрутируется на ER мембрану с помощью Cue1 (ref. 36).

Mammalian ligases


Вообще-то не неожиданно, очень многие лигазы были охарактеризованы по их участию в ERAD у млекопитающих лучше, чем у дрожжей. Известны два белка млекопитающих, гомологичных дрожжевому Hrd1: HRD1 (или Synoviolin) и gp78 (также наз. AMFR, по опухолевому autocrine motility factor receptor)39-41. HRD1 является частью комплекса, связанного с дрожжевой HRD лигазой, т.к. он использует человеческий ортолог Hrd3, SEL1L (suppressor of Lin12-like protein)42, HERP (Usa1 у дрожжей)43, 44, Derlin 1-3 (семейство Der1 representatives)45, 46 и OS-9 (амплифицирован в osteosarcoma, человеческий ортолог Yos9)47, 48. Клетки млекопитающих экспрессируют две формы OS-9: OS-9.1 и сплайс-вариант, OS-9.2, у которого отсутствуют 55 аминокислотных остатков. Оба белка взаимодействуют с SEL1L и связывают неправильно уложенный вариант NHKα1-antitrypsin47, 48. В соответствии с сообщениями о его дрожжевом аналоге Yos9,соединение не нуждается в N-linked glycans, т.к. взаимодействия сохраняются, когда не-гликолизированный вариант NHK (NHK-QQQ) используется в качестве субстрата47. Однако, отсутствие гликанов не ведет к деградации клиентского белка. Снижение уровней OS-9 с помощью siRNA нарушает деградацию NHK и увеличивает количество секретируемой NHK. Избыточная экспрессия OS-9 прежде всего снижает секрецию NHK без усиления деградации47. Т.о., OS-9 может служить двум целям: при физиологических концентрациях он кооперирует с SEL1L, чтобы облегчить устранение неправильно уложенных белков; при избыточной экспрессии избыток OS-9 делает неспособным контакт с HRD лигазой и не-нативные белки сохраняются в просвете ER.
Др. ортологом млекопитающих Yos9 является XTP3-B (XTP3-transactivated protein B или Erlectin)47, 49. Этот белок имеет два MRH домена и взаимодействует с SEL1L. Подобно OS-9, XTP3-B связывает NHK и его не глюкозилированный вариант. Избыточная экспрессия XTP3-B задерживает деградацию обоих субстратов, тогда как siRNA против XTP3-B не оказывает влияния на стабильность NHK49. Соотв. субстраты для XTP3-B всё ещё далеки от идентификации; напротив, XTP3-B может сохранять незрелые белки в ER и предупреждать их агрегацию, также как и избыточная экспрессия OS-9.
HRD1 защищает клетки от индуцируемого стрессами апоптоза50, подкрепляя более широкую роль в убиквитилировании поврежденных ER белков. Среди субстратов, идентифицированных для HRD лигазы, находятся укороченные и неправильно уложенные формы Ribophorin, наз. RI332 (ref. 42), несобранные секреторные Igµ цепочки51 и не гликозилированный вариант Igκ легкой цепи52. В ER, эта Igκ легкая цепь существует в виде полностью окисленной формы, оснащенной двумя дисульфидными мостиками, и частично восстановленный вариант с одним дисульфидным мостиком52. Лишь частично восстановленная молекула взаимодействует с Derlin-1 и HERP, указывая тем самым, что один дисульфидный мостик в окисленной форме Igκ легкой цепи восстанавливается прежде чем легкая цепь рекрутируется на лигазу52. Продукт human cytomegalovirus (HCMV) гена US11 (unique short region protein 11) также использует компоненты HRD лигазы, т.к. она нуждается в SEL1L и Derlin-1 , чтобы направлять MHC-class-I тяжелые цепи на деструкцию42, 45, 46.
Gp78 и человеческий HRD1 имеют более 50% гомологичных последовательностей в своих трансмембранных доменах. В отличие от Hrd1, который нуждается в Cue1, чтобы ассоциировать с Ubc7, gp78 оснащен G2BR (UBE2G2-binding region) доменом дистальнее своего RING-finger домена, который рекрутирует E2 UBE2G2 (ubiquitin-conjugating enzyme E2G 2, ортолог дрожжевого Ubc7) на лигазу53. Среди мишеней gp78 находится Pi Z вариант α1-antitrypsin54 и орфановые субъединицы T-рецептора, такие как TCRα53 b Cd3δ39. Более того, gp78 убиквитилирует HMG-CoA reductase55, демонстрируя, что роль ERAD системы в метаболизме стерола широко законсервирована. Др. gp78 субстратом медицинского значения является KAI1, четырежды пронизывающий белок, который супрессирует раковые метастазы56. Подавление gp78 с помощью siRNA повышает уровни KAI1 и это совпадает со снижением метастатической агрессивности опухолевых клеток56.
Наиболее вероятным кандидатом на роль ортолога у млекопитающих Doa10 является TEB4 (ref. 57). Оба белка обладают одной и той же трансмембранной топологией38 и N-терминальным RING-finger доменом. Хотя TEB4 убиквитилирует сам себя, субстраты этой лигазы ещё не известны57.
Кроме того эти лигазы, которые обладают очевидным сходством с дрожжевыми энзимами, некоторые ERAD лигазы млекопитающих характеризуются тем, что не имеют эквивалентов у грибов. ER белок RMA1 (RING-finger protein with membrane anchor 1) является ubiquitin лигазой, законсервированной от Arabidopsis до человека58. RMA1 взаимодействует с UBE2J1, а избыточная экспрессия лигазы уменьшает концентрацию cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR)58. RMA1 прежде всего осуществляет мониторинг укладки N-терминального домена CFTR во время или сразу после трансляции58. После трансляции цитозольная E3 лигаза CHIP (carboxyl terminus of Hsp70-interacting protein) ослабляет RMA1 и осуществляет мониторинг укладки CFTR58. CHIP содержит в себе U-box, который структурно родственен RING-finger мотиву и tetratricopeptide repeat домену, который взаимодействует с Hsp70 и Hsp90 (ref. 59). Комбинация связывающей хаперон и ubiquitin-protein лигазной активности указывает на то, что CHIP надзирает за Hsp70-обеспечиваемой укладкой белка и запускает протеосомную деградацию субстратов, которые безвозвратно упакованы неправильно.
Др. фактор, который кооперирует с RMA1 это BAP31 (B-cell receptor-associated protein 31). Это интегральный мембранный белок, участвующий в сортировке разных наборов ER мембранных белков. BAP31 взаимодействует с компонентами Sec61 пор, E3 белком RMA1 и Derlin-1 (ref. 60). Поскольку siRNA-обеспечиваемый нокдаун BAP31 стабилизирует CFTR, то BAP31 может быть хапероном вновь синтезируемых CFTR полипептидов и отклоняющихся варианттов, которые не поддаются укладке и отправляются посредством RMA1 и Derlin-1 на деградацию.
Мутации в ubiquitin лигазе Parkin ассоциируют с ювенильной формой болезни паркинсона61. Экспрессия дефектного Parkin запускает накопление Pael-R в ER, сопровождаемое дегенерацией dopaminergic нейронов, признак болезни Паркинсона. Parkin убиквитилирует Pael-R in vitro, хотя и с низкой эффективностью. В комбинации с CHIP, это убиквитилирование существенно усиливается62.
Цитозольный SCF комплекс является ubiquitin лигазой, состоящим из Skp1, Cul1, Roc1 (также наз. Rbx1) и F-Box белка. Среди огромного набора F-Box белков, которые предопределяют специфичность к субстрату SCF лигазы имеются два нейрон-специфических фактора, Fbs1 и Fbs2 (F-box белок, распознающий цепочки сахаров). Оба белка обладают сахар-связывающим доменом, который соединяется с наиболее внутренней частью N-сцепленных glycans63. Субстраты SCFFbs1 комплекса пока не охарактеризованы, но ясно, что это могут быть цитозольные гликопротеины, избежавшие классических ERAD путей или высвободившиеся из ER благодаря повреждению липидного бислоя.

Crossing the membrane


Прежде чем неправильно упакованные белки будут убиквитилированы и деградированы, они могут пересечь ER мембрану. Эта ступень экспорта обозначается как дислокация или ретротранслокация. Как белки экстрагируются из ER неизвестно, но предлагаемые идеи захватывают пределы от ухода посредством Sec61 транслокона64, 65, с помощью реакции, которая напоминает обратный процесс импорта, до образования липидных капель, которые облегчают выход полипептидов из ER66.
HRD kvufps связывают важные события на обеих сторонах ER мембраны: рекрутирование субстрата на сторону, обращенную в просвет, и убиквитилирование белка на её цитозольной стороне33, 34, 67. Отсюда следует, что проход (conduit) для экспорта белка д. быть поблизости от лигазы. Вообще-то HRD комплекс сам по себе отправляет аберрантные белки в цитозоль. Ассоциированы с HRD лигазой члены семейства Derlin, которые рассматриваются как подходящие кандидаты для компонентов транслокационного канала. Три белка этой группы обнаруживают слабую гомологию с дрожжевым Der1 и образуют гетеро-олигомеры др. с др.45, 46. Derlin-1 взаимодействует с HCMV белком US11, и MHC class I тяжелых цепей также присутствует в этом комплексе45, 46. Если протеосомы ингибируются фармакологически, то происходит дегликозилирование тяжелых цепей в ассоциации с Derlin-1 (ref. 45). N-glycanase, энзим, который дегликозилирует class I тяжелых цепей, ограничен цитозолем65, 68, 69. Ассоциация между Derlin-1 и молекулами тяжелых цепей д., следовательно, происходить или во время или непосредственно после дислокации субстрата. Дополнительные доказательства, что Derlin белки могут выводить аберрантные ER белки в цитозоль, получены при наблюдении, что ATPase ассоциирует с различными клеточными активностями, AAA+-ATPase p97 (Cdc48 у дрожжей), взаимодействует с Derlin-1 и Derlin-2 (refs 70, 71). Cdc48 вносит вклад в движущие силы, которые мобилизуют ERAD субстраты из ER мембран. Derlin-1 не нужен для US2-обеспечиваемой деградации тяжелых цепей45, но он может выполнять в целом др. функцию или д. существовать альтернативный выход из ER .

Membrane release and destruction


Перемещения аберрантных белков через мембрану ER нуждаются в силе, чтобы получить направленность. Кроме того, субстраты д. быть высвобождены из мембраны, чтобы стать доступными для протеосом. И транспорт и высвобождение нуждаются в энергии и могут быть связаны. Энергия частично необходима для убиквитилирования субстрата, это является обязательным условием для дислокации72, 73. Др. зависимая от энергии ступень обеспечивается с помощью Cdc48 (p97 у млекопитающих)73-77. Эта AAA-ATPase формирое гомогексамеры, которые ассоциируют с кофакторами Ufd1 (ubiquitin fusion degradation 1) и Npl4 (nuclear protein localization 4), чтобы мобилизовать аберрантные ER белки из ER мембраны. Молекулярный механизм этого процесса неясен. В соответствии с моделью 'molecular ratchet'78, скоординированные циклы гидролиза АТФ индуцируют конформационные изменения в комплексе и подталкивают высвобождение из мембраны субстратов, которые прикреплены к N концу p97. В др. модели богатая guanidyl среда из arginine-rich кольца в основании комплекса формирует 'denaturation collar', которая расправляет субстраты посредством денатурации79. Чтобы направить механическую силу на субстраты Cdc48 комплекс д. быть закреплен на ER мембране. Следовательно, Cdc48 взаимодействует с UBX (ubiquitin regulatory X) доменом закрепленного на мембране белка Ubx2 посредством механизма, который зависит от убиквитилирования субстрата80, 81. Белком кандидатом у млекопитающих для этой функции являетсяUBXD2 (или ERASIN)82.
Когда субстраты polyubiquitylated и экстрагированы из мембраны, они направляются к протеосомам посредством действия Rad23 (radiation sensitive 23) и Dsk2 (dominant suppressor of Kar1)83, 84. Эти гомологичные адапторные белки имеют C-терминальный UBA (ubiquitin-associated) мотив, который связывает polyubiquitin цепочки, прикрепленные с помощью lysine на ubiquitin остатке 48, и N-терминальные UBL (ubiquitin-like) домен, чтобы наводить адаптор и субстрат на протеосомы, которые распознают polyubiquitylated субстраты посредством своих субъединиц Rpn10 (regulatory particle non-ATPase 10)85 и Rpn13 (refs 86, 87). Кроме того, Dsk2 и Rad23 могут защищать polyubiquitin цепочку от действия ubiquitin hydrolases. В этом каноническом пути лишь E3 лигаза polyubiquitylates субстраты. У дрожжей имеется второй путь, в котором субстрат сначала моно- или ди-убиквитилируется с помощью лигазы84. Дальнейшее удлинение цепи катализируется с помощью U-Box белка Ufd2, который взаимодействует с Cdc48 (ref. 84). Cdc48 ограничивает действие Ufd2 прикреплением короткой oligoubiquitin цепочки из 4-6 молекул, которые достаточно велики для распознавания с помощью Rad23 и Dsk2 (ref. 84). Это возрастающее увеличение убиквитиновой цепи может создавать направленность, необходимую для направления субстратов к протеосомам.
Поскольку N-glycanase взаимодействует с Rad23 (ref. 88) и возможно с др. компонентами ERAD аппарата, то гликопротеины освобождаются от своих олигосахаридов, когда они достигают цитозоля. Эта ступень стрижки не является критической для деградации89, 90, но удаление основной массы боковых групп может облегчить попадание субстратов в канал, который ведет к активному сайту камеры протеосомы. Перед протеосомной деградацией deubiquitylating энзимы удаляют polyubiquitin цепочку с субстрата и ubiquitin части подвергаются рециклингу91-93.

Adjusting the capacity of folding and disposal


Средовые изменения и онтогенетические процессы сильно меняют рабочую нагрузку ER. Чтобы поддерживать ER гомеостаз скоординированная программа, известная как unfolded protein response (UPR) приводит в порядок способность к укладке ER , чтобы удовлетворить спрос и задействует деструктивный путь, если необходимо94. Сенсорные белки Ire1 (inositol requiring enzyme 1) у дрожжей и IRE1, PERK (dsRNA-activated protein kinase-like ER kinase) и ATF6 (activating transcription factor 6) у млекопитающих определяют повышенные уровни неупакованных полипептидов в просвете ER и передают сигнал для усиления экспрессии промоторов укладки и деструктивных модулей. Более того, клетки используют дополнительные стратегии, чтобы сохранить ресурсы в тяжелые времена. Если UPR индуцируется, то отобранные мРНК деградируют с помощью механизма, который нуждается в IRE1 (ref. 95). Мишени этого пути включают белки, которые увеличивают рабочую нагрузку ER без внесения вклада в качество воспроизведения. Удаление сигнальной последовательности или внесение сдвига рамки стабилизирует мРНК, которые иначе деградируют, указывая тем самым, что мРНК преобразуется на ER мембране вообще-то с помощью самого IRE1. Дополнительный путь отвергает вступление определённых секреторных белков в ER96. Во время острого стресса грузовые белки, такие как PrP (prion protein) перенаправляются в цитозоль для немедленной деградации протеосомами, хотя BiP продолжает поступать в ER. Химерный PrP оснащен BiP сигнальной последовательностью и может проникать в ER клеток под стрессом, указывая тем самым. что этот процесс в основном регулируется с помощью белковых сигнальных последовательностей, хотя лежащие в основе структурные различия неясны. Механизмы, которые регулируют, какие белки будут допущены в ER коллективно обозначаются как 'pre-emptive quality control'.

Future perspectives


More and more pieces of the ERAD pathway are coming to light, yet even some basic questions remain unresolved. How do Htm1 and members of the EDEM family recognize their targets? Does Htm1 use Pdi1 for this purpose, and does calnexin confer specificity to the actions of EDEM1? Are other members of the EDEM family also associated with chaperones? Which mechanisms govern the recognition of misfolded proteins that bear no glycans? Perhaps an ERAD component binds to non-native proteins, and the probability of their breakdown increases with the duration or frequency of the interaction? The HRD ligase binds substrates through Hrd3. Is this contact critical for substrate selection? How are substrates handled after Yos9 has recognized the correct glycan code, and how does the HRD ligase release proteins that are not suitable for degradation? Which factors make up the pore that shuttles aberrant proteins into the cytosol? What is the function of the ubiquitin-binding domains found in several of the cytosolic ERAD components? Perhaps these domains contribute to the directionality of the ERAD pathway. This could be accomplished if downstream components have a higher affinity for ubiquitin than factors that act earlier in the pathway. With these questions in mind, it would be useful to have an in vitro system that recapitulates the breakdown of a misfolded glycoprotein. Now that most of the ERAD factors have been identified, as well as the glycan detected by Yos9, it might be possible to establish such a system.
Сайт создан в системе uCoz