В коре головного мозга существуют нейральные сети из двух классов нейронов: возбуждающие проекционные нейроны, преимущественно использующие glutamate в качестве нейротрансмиттера и ингибирующие local-circuit интернейроны, составляющие около 20-30% от всех кортикальный нейронов и преимущественно использующие gamma-amino butyric acid (GABA) в качестве нейротрансмиттера.

Кортикальные интернейроны. как было показано, играют жизненно важную роль в модулировании возбудимости нейронов (1) и в интеграции (2), и в генерации временной синхронности и осцилляций в сетях glutamatergic нейронов (3). Кроме того, GABAergic интернейроны также регулируют почти все ключевые ступени развития в коре, от пролиферации, миграции и дифференцировки нейронов (4) до зависящей от опыта утонченности локальных кортикальных петель (circuits) (5).

Традиционно функция GABAergic интернейронов описывалась просто как 'подавляющая' нейрональную активность, подобно регулировщику, который решает когда автомобиль д. ехать и когда стоять; однако теперь стало ясно, что картина сложнее. Продолжив метафору, мы можем сравнить GABAergic функцию интернейронов с музыкальным режиссером симфонического оркестра, чья роль заключается в структуировании и координации всего музыкального представления и интерпретации индивидуальных игроков. Без управления ансамбль не сможет воспроизвести мелодию правильно.

Рассматривая множественные роли, выполняемые GABAergic интернейронами в развитии, функции и пластичности сетей коры, можно прямо предположить, что любое нарушение в развитии GABAergic интернейронов, посредством или генетических или эпигенетических факторов, будет сильно нарушать функции головного мозга. В самом деле, аберрантное развитие GABAergic рефлекторных дуг (circuits) участвует в различных дефектах нейрального развития и в психических нарушениях, таких как шизофрения (6), аутизм (7, 8) и синдром Tourette's (9). Наше понимание механизмов, лежащих в основе развития GABAergic интернейронов, сможет выявлять специфические молекулярные и клеточные субстраты, затрагиваемые при нарушениях нейрального развития.

Наше понимание функции GABAergic интернейронов затрудняется их поразительной гетерогенностью; в самом деле, разные субтипы интернейронов обладают разной морфологией, физиологическими свойствами, паттернами соединяемости и по биохимическим составляющим (10). Умение распознавать, какие параметры д. быть использованы, чтобы недвусмысленно идентифицировать субтипы кортикальных интернейронов, далеко от совершенства среди экспертов в этой области. Несмотря на эти препятствия некоторые исследования предоставили критерии, помогающие различать между основными группами интернейронов. Напр., анализ экспрессии кальций-связывающих белков, таких как parvalbumin (PV), calbindin (CB) или calretinin (CR) и нейропептидов. таких как somatostatin (SST), vasoactive intestinal peptide (VIP), neuropeptide Y или cholecystokinin, показал, что кора содержит три крупные независимые популяции интернейронов: (i) PV, (ii) SST/CB и (iii) CR/VIP-экспрессирующие интернейроны (11). Др. важной характеристикой GABAergic промежуточных нейронов является то, что разные субтипы иннервируют разные домены пост-синаптических glutamatergic клеток. Напр., SST/CB интернейроны избирательно иннервируют дистальные части дендритов нейронов мишеней, тогда как PV интернейроны из избирательно иннервируют тела и проксимальные части дендритов (Fig. 1) (11). Пространственная организация GABAergic синапсов вдоль glutamatergic нейронов предоставляет важную информацию о специфических функциональных ролях, выполняемыми различными субтипами интернейронов (3, 12, 13). Чтобы правильно понять, как GABAergic circuits развиваются и функционируют важно оценить различия между разными субтипами GABAergic интернейронов. Недавние технические успехи существенно ускорили прогресс в этой области. В частности, разработка генетических стратегий, базирующихся на промоторах специфических для типов клеток интернейронов, и флюоресцентные белки репортеры сделали возможным эффективное высокого разрешения мечение специфических классов GABAergic интернейронов в интактных или 'semi-intact' тканях (таких как орган-типические культуры головного мозга) (Fig. 1) (14-16).

Рис.1.  |  Heterogeneity of GABAergic interneurons. (a) Diverse classes of interneurons display distinct morphology, physiological properties, biochemical constituents and connectivity patterns. In particular, different classes of interneurons target distinct subcellular compartments of glutamatergic pyramidal neurons, therefore allowing differential control over input, integration, and output of the targeted cell. Interneurons expressing the neuropeptide somatostatin (in yellow) preferentially target pyramidal cell dendrites, while interneurons expressing the calcium binding protein parvalbumin (PV, in green) target the soma and proximal dendrite of post-synaptic cells. An extremely fascinating case is represented by chandelier interneurons that form synapses exclusively along the axon initial segment of projection neurons (in blue). (b) The study of GABAergic circuit development has recently received a boost because of the establishment of methods for the high-resolution labelling of specific subclasses of interneurons in intact or semi-intact living tissue. The right panel shows a PV interneuron in organotypic cultures prepared from mouse cortex. Interneurons are labelled by biolistic transfection with green fluorescent protein (GFP) driven by a promoter specific for PV-interneurons (14). Inserts show perisomatic innervations formed by basket cell axon (green) around the soma of glutamatergic neurons (red, NeuN immunostaining) arrowheads indicate synapses. Scale bars: low magnification, 50 µm; inserts, 5 µm.

В интересах ясности формирования GABAergic circuits интернейронов мы подразделили процесс на отдельные ступени развития: (i) генерацию специфических субтипов GABAergic интернейронов, (ii) миграцию этих типов клеток в соотв. регионы головного мозга, (iii) рост GABAergic клеточных аксонов в направлении специфических пост-синаптических мишеней; и (iv) зависимое от использования формирование и установка количества и сила GABAergic синапсов (Fig. 2).

Рис.2.  |  Time course of GABAergic circuit development. The development of GABAergic circuits is a prolonged process that begins during mid-gestation and is complete only by the end of the adolescence. In the immature brain, GABA-releasing synapses are formed before glutamatergic contacts in a wide range of species and structures and therefore represent the first form of communication between neurons. Early on, GABA action is excitatory and becomes later inhibitory because of the delayed expression of a chloride transporter, leading to a negative shift in the reversal potential for Cl-.

Если первые ступени скорее всего регулируются с помощью генетических программ, то созревание синапсов строго регулируется опытом (experience). Степень, с которой генетический вклад (nature) vs жизненный опыт (nurture) модулируют развитие и функции нейрональных circuits, был предметом длительных дискуссий в последнюю декаду. Т.к. суть фактов, таких как разграничение, чрезвычайно упрощает проблему и не всегда может отражать реальность. Напр., если инициальная проводка базовых circuit, обеспечивающая слух, аномальна в результате генетических пертурбаций, то слуховые восприятия могут быть интерпретированы фундаментально иным образом, чем при нормальном circuit. Слуховые восприятия во время критического временного окна обычно ответственны за точность, с которой формируется сенсорная карта (17). Следовательно, очень возможно, что в этом случае разные circuit, измененные как за счет инициальных генетических нарушений, так и за счет поступающих стимулов, будут строиться и продолжать управлять онтогенетическим процессом по аномальной траектории. Этот сценарий хорошо знаком исследователям, изучающими патогенетический процесс, лежащий в основе развития эпилепсии. В этом случае фундаментальные нарушения в балансе возбуждения и подавления могут быть вызваны мутациями в генах, кодирующих ионные каналы или GABA рецепторные субъединицы (18, 19), приводя в результате кортикальные circuits к аномальной активности, которая со временем приведет к возникновению эпилепсии. Итак, развитие кортикальных circuits, включая циркуиты GABAergic интернейронов, скорее всего использует богатый набор сигналов с существенным взаимодействием между механизмами, прирожденными для нейрональных предшественников, и механизмами внешними по отношению к коре, включая те, которые необходимы для управляемой опытом нейральной активности.

Первой ступенью построения GABAergic circuits является генерация разнообразных и самостоятельных клеточных типов интернейронов. Как же возникает такое разнообразие субтипов GABAergic интернейронов во время развития? В отличие от кортикальных проекций нейронов, которые происходят из дорсальной части telencephalon и мигрируют радиально в кортикальную mantle зону, большинство кортикальных интернейронов, происходящих из вентральной части (subpallial) telencephalon, мигрирует тангенциально в развивающуюся кору мозга (20, 21). GABAergic интернейроны возникают из множественных пролиферативных регионов subpallial telencephalon, включая lateral, medial (MGE) и caudal (CGE) ганглиолярные возвышения и вообще-то переднюю entopeduncular область и область вокруг основания обонятельных луковиц (20, 21). Все эти регионы предшественников экспрессируют гены транскрипционных факторов Dlx1, Dlx2 и Mash1, которые контролируют время дифференцировки и вносят вклад в приобретение 'proto-GABAergic' фенотипа происходящими из subpallial кортикальными интернейронами (22, 23). У приматов по иному, чем у грызунов, субпопуляция кортикальный интернейронов происходит из Dlx-экспресирующих предшественников, расположенных в pallium, зачатке собственно коры (24).

Существуют две возможные модели того, как возникает разнообразие интернейронов в telencephalon. Одним из возможных сценариев являет тот, согласно которому предшественники, экспрессирующие транскрипционные факторы из семейства Dlx продуцируют 'protointerneurons', дифференцировка которых в специфические субклассы зависит прежде всего от эпигенетических факторов, присутствующих в коре. Вторая возможность заключается в том, что разные типы интернейронов, происходят из пространственно и во времени сегрегировавших пулов экспрессирующих Dlx предшественников. Недавние исследования подтвердили этот последний сценарий, показав, что из трех основных групп кортикальных GABAergic интернейронов, PV интернейроны и SST/CB интернейроны могут происходить из MGE, тогда как CR/VIP интернейроны могут происходить из CGE (25). Эти находки указывают на то, что разнообразие интернейронов устанавливается рано во время нейрогенеза. при этом пространственные и временные различия вносят вклад в развитие самостоятельных классов интернейронов. Как это было продемонстрировано для нейронов спинного мозга (26), генерация разнообразия кортикальных интернейронов может базироваться прежде всего на онтогенетический экспрессии специфических комбинаций гомеодоменовых белков в разных пулах предшественников. Однако подтверждение этой гипотезы нуждается в идентификации дополнительных транскрипционных факторов с ограниченными паттернами экспрессии. Тем не менее, прогресс в идентификации регуляторов судеб кортикальных интернейронов, скорее всего, предоставит информацию для понимания механизмов, лежащих в основе патогенеза некоторых болезней мозга. Пример подобного управления получен в генетических исследованиях синдрома Rett. Этот синдром является результатом нарушения нейронального развития, это является ведущей причиной умственной задержки у женщин и вызывается мутациями X-сцепленного гена, кодирующего methyl-CpG-binding protein 2 (MeCP2) (27). Транскрипционный фактор Dlx5, один из факторов, регулирующих дифференцировку и созревание GABAergic интернейронов переднего мозга (28), был идентифицирован как прямая мишень для MeCP2 (29), это открывает возможность, что GABAergic функция нарушена у пациентов с синдромом Rett.

Однажды сгенерированные, GABAergic интернейроны перемещаются на длительные расстояния, чтобы достичь места окончательного расположения в коре. Какие сигналы наводят GABAergic интернейроны на места их окончательного предназначения? Наше знание этого процесса очень схематично, но ясно, что миграция незрелых GABAergic интернейронов из subpallium в развивающуюся кору нуждается в хемоотталкивающих и хемопривлекающих факторах. Хемоотталкивающие сигналы необходимы, чтобы предупредить миграцию интернейронов из ганглиолярных возвышений в структуры телэнцефалона, отличные от коры. Это показано, напр., с помощью роли semaphorin-neuropilin взаимодействий в ограничении доступа мигрирующих кортикальных интернейронов в развивающийся striatum (21). Напротив, передача сигналов NRG1/ErbB4 , как было показано, способствует миграции GABAergic интернейронов со своего места возникновения в кору (30). Роль передачи сигналов NRG1/ErbB4 в развитии кортикальных GABAergic интернейронов вызывает ещё больший интерес, т.к. NRG1 задействован в чувствительности к шизофрении (31), и головной мозг пациентов с шизофренией действительно обнаруживает альтерации специфических классов GABAergic интернейронов (6). Т.к. вполне возможно, что NRG1 вносит вклад в патогенез нарушения только у определенной группы пациентов, поэтому важно протестировать существование корреляции между аномальным NRG1 генотипом и дефектами миграции у человека.

Удивительным свойством циркуитов GABAergic интернейронов является то, что аксоны разных классов GABAergic интернейронов находят ограниченные субклеточные домены у своих пост-синаптических партнеров. Возможно, что субклеточная локализация GABAergic синапсов строго детерминирует роль отдельных субтипов интернейронов в ходе процессинга нейрональных сетей (3, 12, 13). Следовательно, неправильное расположение GABAergic синапсов может строго влиять на процессинг и пластичность коры. Кстати, молекулярные механизмы, лежащие в основе субклеточной организации кортикальных GABAergic синапсов полностью неизвестны.

Тем не менее недавние эксперименты показали, что молекулярные сигналы играют критическую роль в этом процессе. Избирательная perisomatic иннервация или иннервация дистальных частей дендритов кортикальных glutamatergic клеток с помощью PV- или SST-экспрессирующих интернейронов возникает и собственно в культурах кортикальных органотипических срезов, указывая тем самым, что такое избирательное помещение синапсов, по-видимому, использует молекулярные метки в коре и sensory-независимые формы активности (15). Т.к. качественные особенности этих молекулярных меток в кортексе неизвестны, поэтому существенный прогресс достигнут пониманием сходного феномена иннервации axon initial segment (AIS) клеток Пуркинье с помощью basket интернейронов в мозжечке. Нейроны Пуркинье, которые составляют единственный продукт коры мозжечка. получают два набора ингибирующих GABAergic ввода, basket и stellate интернейроны. Stellate клетки избирательно иннервируют дендриты клеток Пуркинье. Basket клетки иннервируют специфически AIS клеток Пуркинье (Fig. 3). Аксоны basket клеток, по-видимому, сначала контактируют с телами клеток Пуркинье (32). Они перемещаются постепенно направленно к AIS без остановки на телах, влезая вверх по дендритам (32). После достижения AIS, аксоны basket клеток выпускают множественные терминальные веточки и формируют специфические синапсы. Четко выраженная направленность роста аксонов basket клеток указывает на присутствие сигналов наведения вдоль поверхности клеток Пуркинье. В частности, недавно была установлено непосредственное участие цитоскелетного белка ankyrin G и молекуля клеточной адгезии neurofascin 186 (NF186) в направлении синапсов basket клеток на AIS (Fig. 3) (32).

Рис.3.  |  Mechanisms directing GABAergic innervation at the axon initial segment (AIS) of cerebellar Purkinje neurons. (a) Subcellular organization of glutamatergic and GABAergic inputs along Purkinje (Purk) neurons in cerebellum. PF, parallel fiber; CF, climbing fiber; St, stellate cell; Bsk, basket cell. Stellate cell target specifically Purkinje neuron dendrites, while basket cells form specialized synapse at the AIS. (b) A model describing the role of neurofascin (NF186) and ankyrin G in basket cell synapse formation. The neurofascin gradient (in red) along the AIS-soma of the Purkinje cell directs basket axons (green) to the AIS. The neurofascin oligomers cross-linked by ankyrin G promote synapse formation and stabilization at the AIS [adapted from (13)].

Недавние исследования показали, что CHL1, др. член семейства L1CAMs (L1 cell adhesion molecules), вносит вклад в наведение на мозжечок stellate аксонов, чтобы иннервировать дендриты клеток Пуркинье (33). Итак. эти находки показывают, что разные члены L1CAMs могут вносить вклад в субклеточную организацию синапсов различных субтипов интернейронов, по крайней мере, в мозжечке. Интересно, что ankyrin G, NF186 и CHL1 экспрессируются в коре (34, 35), но ещё предстоит определить, вносят ли они вклад в субклеточную организацию GABAergic синапсов вдоль кортикальных glutamatergic нейронов.

Одной из поразительных характеристик GABAergic интернейронов является обширность их поля иннервации. Напр., PV-интернейрон образует плотное аксональное ветвление, которое иннервирует сотни нейронов, каждый с множеством пучков синапсов на теле и проксимальных частях дендритов (Fig. 4) (36). Обширный паттерн иннервации не достигается вплоть до конца юности как у грызунов, так и приматов (14, 37, 38), давая увеличенный временной промежуток, во время которого опыт может ваять тонкую архитектуру области GABAergic иннервации (Fig. 4) (14, 39-41). В самом деле, лишение сенсорных восприятий во время критического постнатального периода существенно задерживает созревание GABAergic синапсов в зрительном и соматосенсорном кортексе (14, 39).

Рис.4.  | The maturation of GABAergic synaptic innervation in the post-natal cortex is a prolonged, activity-dependent, process. (a) Top panels show single parvalbumin (PV) interneurons in organotypic cultures prepared from cortex of post-natal day 5 (P5) mice and maintained in the incubator for the desired time periods. Interneurons are labelled by biolistic transfection with green fluorescent protein (GFP) driven by a PV interneuron-specific promoter. Bottom panels show details of perisomatic innervation formed by basket cell axon (green) around the soma of glutamatergic neurons (red, NeuN immunostaining). At equivalent post-natal day 11 (EP11 = P5 + DIV6), PV-interneuron axons are still poorly branched and form few distinct synaptic boutons (arrowheads) contacting the post-synaptic glutamatergic cells. At EP28, axon branches are more numerous and form perisomatic terminal forks carrying strings of synaptic boutons (arrowheads), [adapted from (14)]. Scale bars: top panels, 50 µm; bottom panels, 5 µm. (b) During post-natal development, the innervation field of PV interneurons becomes more complex, because of the increase in the number of post-synaptic cells innervated by single interneurons and in the number of synapses formed on each innervated cell. Neural activity strongly modulates this process (14). The molecular mechanisms mediating the effects of neural activity on the maturation of GABAergic synaptic innervation are currently under study.

Каковы клеточные и молекулярные механизмы, лежащие в основе зависимого от опыта созревания и пластичности ингибирующих синапсов? Первой молекулой, для которой было установлено её участие в этом процессе, это neurotrophin BDNF. BDNF способствует образованию GABAergic синапсов в культуре гиппокампа и коры (42-44) и созреванию иннервации вокруг тел клеток в зрительном кортексе (45). Т.к. BDNF продуцируется только с помощью glutamatergic клеток в коре и передача сигналов BDNF зависит от активности, то это может в принципе подгонять количество и силу GABAergic синапсов на glutamatergic клетках мишенях, в соответствии с активностью последних.

Недавно, Chattopadhyaya et al. (46) показали, что передача GABA сигналов сама мощно регулирует созревание GABAergic иннервации в в коре подростков. В частности, синтез GABA в одиночных PV интернейронах регулирует как количества клеток, иннервируемых с помощью интернейронов, и количества синапсов, формируемых каждой иннервируемой клеткой (46). Это согласуется с предыдущими находками. показавшими, что передача сигналов посредством glutamate регулирует почти все аспекты образования glutamatergic синапсов (47-50). В качестве ключевых медиаторов нервных сообщений, нейротрансмиттеры были изучены особенно тщательно, чтобы увязать функциональную нейротрансмиссию с морфогенезом и доводкой синапсов. С др. стороны, дефекты в нейротрансмиссии, как на пре- так и пост-синаптическом уровне, обнаруживали потенциал строго нарушать в целом образование и пластичность синапсов, приводя тем самым к нарушению функции кортикальных circuits.

Хотя нейральные трансмиттеры обычно ассоциированы с нервными коммуникациями в зрелом головном мозге, системы множественных трансмиттеров, как было показано, влияют на различные аспекты развития нервных circuits (51). Синтез и передача сигналов GABA инициируются во время средины беременности, задолго до начала синаптических сообщений и участвуют в многочисленных процессах нервного развития, включая клеточную пролиферацию, миграцию и дифференцировку (4). В нейронах взрослых открытие GABAA рецепторных каналов делает возможным приток allows C^l- и ведет к гиперполяризации мембранных потенциалов. Это в основном обусловлено способностью K⁺-Cl^- котранспортера KCC2 выталкивать Cl^-, поддерживая эффективный градиент Cl^- . Т.к. нейрональная экспрессия KCC2 низка во время раннего развития, GABA служит в качестве возбуждающего скорее, чем ингибирующего нейротрансмиттера (Fig. 2) (52). Трофические эффекты GABA на пролиферацию, миграцию и дифференцировку клеток во время эмбрионального и перинатального периодов в основном объясняются за счет её деполяризующего действия в незрелых нейронах (52), которое запускает приток и передачу сигналов кальция (53).Позднее передача сигналов GABA регулирует созревание GABAergic синапсов на стадии, когда GABA уже вязала на себя ингибирующую функцию в коре (46), но механизмы, лежащие в основе этого действия всё ещё неизвестны.

Итак, эти находки подтверждают, что альтерации синтеза и передачи сигналов GABA из-за генетических или средовых причин, могут в принципе затрагивать почти все стадии образования кортикальных circuit, приводя тем самым к нарушению развития головного мозга. Напр., SNPs в 5' регуляторной области гена Gad1 (кодирует GABA-синтезирующий энзим GAD67) ассоциируют с началом в детстве шизофрении (54). Это интересный результат, т.к. уменьшение уровня экспрессии GAD67 в дорсальном латеральном пре-фронтальном кортексе является наиболее согласующейся молекулярной патологической находкой у индивидов с шизофренией (6). Однако, могут ли и как эти генетические варианты непосредственно влиять на регуляцию уровней экспрессии Gad1, всё ещё неизвестно. С др. стороны, многосторонняя роль GABA во время возникновения кортикальных circuits привлекает наше внимание к возможным повреждающим эффектам действия лекарств на GABA рецепторы, особенно benzodiazepines или определенных антиэпилептических агентов, на развитие головного мозга. Доказательства из клинических исследований и экспериментов на животных указывают на то, что антиэпилептические лекарства могут вмешиваться в нормальное развитие головного мозга (55). В частности. предварительные наблюдения указывают на то. что некоторые антиэпилептические лекарства влияют на миграцию нейронов (56). Необходимы дальнейшие исследования, чтобы понять долговременные последствия использования этих лекарств на специфическое развитие кортикальных circuit.

Aberrant development of GABAergic circuits has been implicated in various neurodevelopmental and psychiatric disorders such as schizophrenia, autism and Tourette's syndrome. Our understanding of the mechanisms underlying the development and plasticity of GABAergic interneurons will likely indicate which cellular substrates might be affected in neurodevelopmental disorders. In return, identifying the genetic variants implicated in these disorders may generate major insights into the normal development and function of GABAergic interneurons. Because of the startling yet daunting complexity of GABAergic interneuron circuits, progresses in this field will be strongly aided by the establishment of experimental systems and strategies that allow efficient genetic perturbation of distinct classes of GABAergic interneurons in living intact tissue.