Неканонический путь активации NF-κB , который оперирует в основном в B клетках, использует протеолитический процессинг NF-κB предшественника p100 в зрелую p52 субъединицу. Стимуляция субнабора из членов сверхсемейства tumour necrosis factor receptor (TNFR), включая CD40 и BAFF рецепторов, активирует протеин киназу NIK, которая в свою очередь фосфорилирует и активирует IKK-α. IKK-α фосфорилирует p100 по двум сериновым остаткам на C конце, это делает p100 распознаваемым для SCF-βTrCP E3 комплекса. Полиубиквитилирование p100, однако, не приводит к его полной деградации с помощью протеосом. Вместо этого протеосомы деградируют только C конец p100, который содержит ankyrin повторы, делая N-терминальный RHD домен (p52) интактным. Затем p52 димеризуется со своим партнером REL-B, чтобы индуцировать программу генной экспрессии, которая важна для созревания и активации B клеток. Ubiquitin-proteasome путь также превращает p105 в p50 (ref. 5); это в основном конституитивный процесс, хотя некоторые стимулы, такие как phorbol эфир усиливают процессинг p105.
Фосфорилирование IκBs и p100 с помощью IKK является предварительным условием для их ubiquitylation и последующей деградации или процессинга с помощью протеосом. Поэтому важно понять, как IKK регулируется с помощью вышестоящих сигналов. Неожиданно оказалось, что ubiquitylation играет важную роль в активации IKK с помощью механизма независимого от протеосомной деградации. Первый сигнал о роли ubiquitin в активации IKK получен в экспериментах по биохимическому фракционированию с целью идентификации IκB киназы6. было установлено, что эта киназная активность в основном стимулируется с помощью polyubiquitylation in vitro, и что эта активация происходит в отсутствие протеосом или в присутствие протеосомных ингибиторов.
Дальнейшая информация о механизме ubiquitin-обеспечиваемой активации IKK получена в биохимических исследованиях TRAF6, RING-доменового белка, существенного для активации IKK с помощью interleukin-1 (IL-1) и Toll-like receptors (TLRs) (Fig. 1). TRAF6 действует как ubiquitin E3, который совместно с ubiquitin E2 комплексом состоит из UBC13 и UEV1A, он катализирует синтез polyubiquitin цепи, связанной посредством Lys 63 убиквитина7. Это polyubiquitylation активирует протеин киназный комплекс, представленный TAK1, TAB1 и TAB2 (или TAB3)8. TAB2 и TAB3 соединяются преимущественно с Lys 63 polyubiquitin цепи9. Это связывание ведет к активации TAK1, вообще-то благодаря запуску аутофосфорилирования. Активированная TAK1 фосфорилирует IKK-β по двум сериновым остаткам внутри её активационной петли, приводя к активации IKK. TAK1 также фосфорилирует MAPK киназы, такие как MKK6 и MKK7, приводя к активации JNK и p38 киназных путей.
Фосфорилирование IKK-β с помощью TAK1 нуждается в NEMO, который содержит уникальный ubiquitin-связывающий домен
10, 11. Точковые мутации, которые нарушают связывание ubiquitin с помощью NEMO, такие как те, что обнаружены при эктодермальной дисплазии с иммунодефицитом, устраняют активацию IKK. NEMO также polyubiquitylated по разным сайтам вследствие стимуляции клеток разными NF-κB активаторами, и это может вносить вклад в активацию IKK
12. Др. белки в IL-1 пути, как известно, модифицируются с помощью Lys 63 polyubiquitin цепочек, включая IRAK1 и TRAF6, но необходимы дальнейшие исследования для определения, важно ли ubiquitylation любого из этих белков для активации IKK.
DUBs prevent protein kinase activation
Дальнейшее подтверждение идеи, что polyubiquitylation важно для активации IKK получено с открытием некоторых DUBs, которые негативно регулируют NF-κB выше IKK13. Эти энзимы включают CYLD, опухолевый супрессор, участвующий в нескольких болезнях человека, включая cylindromatosis и множественные миеломы, и A20, мощный ингибитор NF-κB. CYLD содержит три cytoskeleton-associated protein (CAP)-Gly домена, сопровождаемые C-терминальным ubiquitin-specific protease (USP) каталитическим доменом14. CYLD обладает высокой специфичностью по отщеплению Lys-63-сцепленных polyubiquitin цепей и , следовательно, предупреждает активацию TAK1, JNK и IKK в некоторых сигнальных путях (Fig. 1). Некоторые мышиные модели с CYLD мутациями были получены в разных лабораториях. Хотя описываемые фенотипы таких мышей не идентичны, избыточное воспаление, ассоциированное с гиперактивацией IKK, наблюдается постоянно13.
A20 содержит N-терминальный ovarian tumour (OTU)-type DUB домен, сопровождаемый 7 zinc-finger доменами на C конце15, 16. Было предположено, что домен OTU у A20 катализирует разборку Lys-63-сцепленных polyubiquitin цепей с белков мишеней, таких как RIP1, ключевого сигнального белка, необходимого для активации IKK с помощью TNF-α17 (Fig. 2). Более того, один из C-терминальных zinc-finger доменов обладает ubiquitin ligase активностью и катализирует Lys-48-сцепленное полиубиквитилирование RIP1, направляя тем самым RIP1 на деградацию с помощью протеосом. Однако A20 расщепляет как Lys 48, так и Lys 63 связи in vitro18. Возможно, что др. клеточные белки ассистируют A20 в выборе субстрата и в специфичности связывания ubiquitin in vivo. В самом деле, A20 ассоциирует с ABINs (A20-binding inhibitors для NF-κB) и TAX1BP1 (TAX1-binding protein 1), каждый из которых содержит ubiquitin-связывающие домены19. В клетках, которые лишены TAX1BP1, A20 неспособен удалять polyubiquitin цепочки с TRAF6 и RIP1, в результате возникает гиперактивация NF-κB. A20 также соединяется с ITCH, HECT-доменовым E3, как известно, играющим важную роль в предупреждении аутоиммунности20. ITCH необходим для TNFα-индуцированной деградации RIP1, это ставит вопрос, ITCH или A20, или оба непосредственно ответственны за RIP1 ubiquitylation и деградацию. Во всяком случае, ключевой механизм ингибирования NF-κB с помощью A20 скорее всего осуществляется благодаря образованию крупного ubiquitin-редактирующего комплекса.
Ubiquitin in innate immunity
Врожденный иммунитет является древним, но высоко эффективным как первая линия защиты против микроорганизмов. Если патоген пробивает брешь в наших физических барьерах, то он выявляется различными иммунными и не иммунными клетками. Обнаружение обеспечивается с помощью рецепторов, которые соединяются с pathogen-associated molecular patterns (PAMPs), элементами патогенов, которые существенны ждя их выживания и обычно отличны от молекул хозяина21. Связывание PAMPs рецепторами хозяина, обозначаемыми pattern recognition receptors (PRR), активирует сигнальные пути, приводя к индукции различных антимикробных молекул, таких как цитокины и chemokines. Некоторые из этих молекул, такие как TNF-α, запускают мощную воспалительную реакцию, которая ограничивает рост патогенов и рекрутирует иммунные клетки к месту инфекции. Другие, такие как type I interferons (IFN-I), не только активируют сигнальные каскады, которые ингибируют репликацию и сборку вирусов, но и также необходимы для активации адаптивной иммунной системы, чтобы искоренить инфекцию.
В отличие от рецепторов антигенов, экспрессируемых на T и B клетках, которые генерируются за счет перестройки и гипермутации соматических генов, PRRs являются рецепторами, кодируемыми зародышевой линией, которые эволюционно законсервированы. Три класса PRR были изучены тщательно: TLRs, NOD-like receptors (NLRs) и RIG-I-like receptors (RLRs). Все эти рецепторы активируют сигнальные каскады, которые ведут к активации MAP киназ и NF-κB. Кроме того, RLRs и некоторые TLRs активируют interferon regulatory factors (IRFs), которые действуют вместе с NF-κB и др. транскрипционными факторами, чтобы индуцировать продукцию IFN-I и др. эффекторных молекул. Ubiquitylation выполняет критическую роль в передаче сигналов всеми тремя классами PRR (Fig. 3). Более того, интенсивные исследования путей передачи сигналов TNF показали, что ubiquitylation контролирует жизнь и смерть клеток за счет скоординированной регуляции NF-κB и apoptosis (Fig. 2).
TNF signalling
Как одна из основных эффекторных молекул реакции врожденного иммунитета, запускаемых с помощью всех PRRs, TNF-α явилась предметом интенсивных исследований. Он осуществляет свои биологические функции прежде всего посредством своего рецептора TNFR1 и в меньшей степени TNFR2. TNFR1 и TNFR2 являются членами основателями сверхсемейства TNFR. Стимулирование некоторых из этих рецепторов, включая TNFR1, может приводить к клеточной гибели. Т.о., путь TNFR1 служит в качестве модельной системы для понимания передачи иммунных сигналов, а также для клеточной гибели.
Связывание TNF-α, который является тримером, ведет к тримеризации TNFR1. TNFR1 рекрутирует сигнальный комплекс (complex I), который включает TRADD, RIP1, TRAF2, и TRAF5, а также cIAP1 и cIAP2 (ref. 22) (Fig. 2). Заметим. что TRAF и cIAP белки в этом комплексе являются RING-доменовыми ubiquitin лигазами. Кроме того, RIP1 polyubiquitylated по специфическому сайту вследствие стимуляции TNF-α, а мутация, которая делает невозможной убиквитилировани RIP1, блокирует также активацию IKK10, 23. Генетические исследования указывают на то, что TRAF2 необходим для полиубиквитилирования RIP1, но нет прямых доказательств, что TRAF2 или TRAF5 катализируют ubiquitylation RIP1 in vitro24. Недавние исследования подтвердили, что cIAP1 и cIAP2 могут катализировать polyubiquitylation RIP1 и необходимы для активации IKK с помощью TNF-α25. Polyubiquitylated RIP1 рекрутирует TAK1 киназный комплекс путем соединения между polyubiquitin цепью и TAB2 или TAB3 (ref. 9). Цепочка polyubiquitin соединяется также с NEMO, рекрутируя тем самым IKK на TAK1 в мембранном рецепторном комплексе, приводя к фосфорилированию IKK с помощью TAK1 (refs 10, 11).
После образования TNFR complex I, death-доменовые белки TRADD и RIP1 отсоединяются от мембранного рецепторного комплекса и ассоциируют с FADD, чтобы сформировать комплекс II в цитозоле22 (Fig. 2). FADD облегчает аутокаталитический процессинг procaspase-8 для созревания caspase-8, которая в свою очередь расщепляет procaspase-3, чтобы инициировать программу апоптоза. Однако апоптоз, индуцированный с помощью TNF-α обычно не происходит, т.к. NF-κB включает продукцию анти-апоптических белков, таких как c-FLIP, мощного ингибитора caspase-8. Чтобы сделать возможным апоптоз, c-FLIP д. быть удален или за счет предупреждения его синтеза или способствуя его деградации. Синтез c-FLIP и др. апоптозных ингибиторов может быть блокирован ингибиторами белкового синтеза, таким как cyclohexamide, или более специфически путем ингибирования пути NF-κB; этот сдвиг баланса в направлении TNFα-индуцированного апоптоза. Деградация c-FLIP обеспечивается с помощью ITCH, ubiquitin лигазы, активность которой усиливается за счет JNK-катализируемого фосфорилирования26.
TNFα-индуцированный апоптоз также ингибируется с помощью cIAPs посредством другого ubiquitin-зависимого механизма. И cIAP1 и cIAP2 соединяются с SMAC (также известным как DIABLO), митохондриальным белком, высвобождаемым в цитозоль при условиях, которые запускают апоптоз27. Связывание SMAC, или малой молекулы SMAC mimetics, с cIAPs индуцирует димеризацию, autoubiquitylation и протеосомную деградацию этих ubiquitin лигаз28-30. В отсутствие cIAPs, ассоциированный с рецептором RIP1 в complex I быстро deubiquitylated с помощью CYLD, так что RIP1 высвобождается в цитозоль, чтобы сформировать complex II, который инициирует апоптоз31. cIAPs также являются ubiquitin лигазами, которые направляют киназу NIK на протеосомную деградацию29. В отсутствие cIAPs, NIK стабилизируется и активирует неканонический путь NF-κB, чтобы запустить продукцию TNF-α, который в дальнейшем способствует апоптической гибели клеток аутокринным способом.
TLR signalling
TLRs, названы по Toll белку у Drosophila, состоят из 12 членов (TLR1-9 и TLR11-13) у мышей и 10 у человека (TLR1-10)32. Они являются связанными с мембраной рецепторами, содержащими цитоплазматический Toll-IL-1 receptor (TIR) домен, который обеспечивает взаимодействие с сигнальными адапторами. TLRs часто подразделяют в соответствии с их клеточной локализацией. Эндосомные TLRs (TLRs 3, 7, 8 и 9) переносятся из эндоплазматического ретикулема в эндосомы, где они могут заниматься PAMPs, находящимися в просвете, из эндоцитозированных микробов. Остальные TLRs располагаются на плазматической мембране, где они ощущают внеклеточные PAMPs. Каждый TLR распознает отдельный PAMP и вместе они могут узнавать широкий круг патогенов, включая бактерии, вирусы, грибы и простейших. Передача сигналов, инициируемая этими рецепторами. достигает кульминации в активации NF-κB и в определенных случаях (TLRs 3, 4, 7, 8 и 9), IRFs.
Сигналы, инициируемые с помощью TLRs и IL-1R трансдуцируются посредством их TIR и следуют по сходному пути (Fig. 1). TIR из этих рецепторов, за исключением TLR3, взаимодействуют с TIR из адаптора MyD88. MyD88 в свою очередь рекрутирует белки из семейства IRAK. IRAK4 рекрутируется на рецепторный комплекс, фосфорилирует и активирует IRAK1 и IRAK2, которые затем способствуют олигомеризации TRAF6, который активирует свою ubiquitin лигазную активность. Как отмечалось ранее, вместе с E2 complex UBC13-UEV1A, TRAF6 катализирует Lys 63 polyubiquitylation, приводя к активации TAK1, IKK и MAPK.
TLR3 и TLR4, после связывания со своими лигандами (двунитевой РНК или липополисахаридом, соотв.) взаимодействуют с др. TIR-содержащим адаптором. наз. TRIF, который соединяется с TRAF6 и RIP1, чтобы активировать NF-κB путь. TRIF также соединяется с IKK-подобными киназами TBK1 и IKK-ε, которые фосфорилируют IRF3. Фосфорилированные IRF3 димеризуются и вступают в ядро, где они ассоциируют с NF-κB и с activating transcription factor 2 (ATF2), чтобы сформировать enhanceosome комплекс, который индуцирует IFN-β. Др. TLRs, которые могут индуцировать IFN-I, включают TLR7, TLR8 (только у человека) и TLR9. TLR7 и TLR8 соединяются с однонитевой РНК, происходящей из вирусов, тогда как TLR9 соединяется с не метилированными ДНК CpG. Это соединение рекрутирует цитозольный сигнальный комплекс, состоящий из MyD88, IRAKs и TRAF6. Этот комплекс, будучи собранным на мембранах эндосом специализированных дендритных клеток, таких как plasmacytoid dendritic cells (pDCs), активирует не только NF-κB, но и также IRF7, который является мастером регулятором IFN-I, особенно IFN-α. Активация IRF7 нуждается в UBC13 и в интактном RING-доменовом TRAF6, указывая тем самым, что polyubiquitylation также важно для активации IRF семейства транскрипционных факторов
33. Однако механизмы, с помощью которых убиквитилирование обеспечивает активацию IRF с помощью эндосомных TLRs, ещё предстоит выяснить.
NLR signalling
NLRs это крупное семейство цитозольных белков, которые образуют трехсоставную структуру34. Все NLRs содержат центральный nucleotide-binding domain (NBD, также известный как NACHT домен), который связывает АТФ и обеспечивает олигомеризацию, и С-терминальную LRR область, участвующую в распознавании PAMPs или участвующую в аутоингибировании. На своих N концах NLRs имеют домен caspase activation and recruitment domain (CARD), pyrin domain (PYD), baculovirus IAP repeat (BIR) или кислый активационный домен; эта область участвует в рекрутировании нижестоящих сигнальных белков. Два из наиболее хорошо изученных NLRs, NOD1 и NOD2, обнаружены в эпителиальных клетках кишечника, где они обнаруживают присутствие peptidoglycans, происходящих из стенок бактериальных клеток. Мутации в NOD2 сцеплены с болезнью Crohn's, воспалительным заболеванием кишечника.
Доказательства того, что ubiquitylation участвует в сигнальной трансдукции с помощью NLRs получены в исследованиях NOD1 и NOD2, которые могут активировать NF-κB и MAPK (Fig. 3). Бактериальная инфекция преимущественно индуцирует гомо-олигомеризацию NOD белков, это позволяет им рекрутировать RIP2 (известный также как RICK), CARD-домен-содержащую протеин киназу. Подобно RIP1, RIP2 активирует IKK посредством механизма, который зависит от TAK1 и Lys 63 polyubiquitylation
35, 36. Мишенями для Lys 63 polyubiquitylation являются RIP2 и NEMO, а убиквитилирование обоих требует UBC13 и члена семейства TRAF (TRAF2/5 или TRAF6)
35-39. Более того, ubiquitylation RIP2 ограничивается с помощью A20, а макрофаги, лишенные A20, обнаруживают усиление передачи сигналов NF-κB signalling и усиливают продукцию провоспалительных цитокинов в ответ на лигнад NOD2
40. Мутация, ассоциированная с болезнью Crohn's в NOD2, нарушает его способность стимулировать NEMO polyubiquitylation, а также его способность активировать IKK
35. Итак, эти результаты предоставляют строгие доказательства, что Lys 63 polyubiquitylation играет ключевую роль в передаче сигналов NOD.
RLR signalling
Существуют три RLRs, RIG-I, MDA5 и LGP2, каждый из которых содержит РНК helicase домены, которые участвуют в распознавании вирусной двунитевой РНК в цитозоле32. Кроме того, RIG-I и LGP2 содержат С-терминальный регуляторный домен, который соединяется с uncapped 5'-triphosphorylated однонитчатой вирусной РНК, которая отличается от др. клеточных РНК тем, что обычно модифицируется или покрывается шапочкой (capped) на 5' конце. N концы у RIG-I и MDA5 также содержат тандемные CARD домены, которые взаимодействуют с CARD доменом нижестоящего сигнального адаптора MAVS (также известного как IPS-1, VISA или CARDIF). LGP2, однако, лишен N-терминальных CARDs и, как полагают, выполняет роль по регуляции передачи сигналов RIG-I и MDA5. MAVS содержит трансмембранный домен, который направляет его в митохондриальную наружную мембрану и эта локализация является важной для активации IKK и TBK1/IKK-ε в цитозоле. Активация этих киназ с помощью MAVS ведет к активации NF-κB и IRF3, приводя к продукции IFN-I и др. антивирусных молекул.
Недавние исследования показали, что Lys 63 polyubiquitylation играет ключевую роль в передаче сигналов RIG-I (Fig. 3). В результате вирусной инфекции, RIG-I модифицируется с помощью Lys-63-сцепленных polyubiquitin цепочек по лизиновым остаткам внутри второго CARD домена, и эта модификация усиливает связывание RIG-I с MAVS41. Убиквитилирование RIG-I катализируется с помощью TRIM25, RING-доменовой ubiquitin лигазы. Клетки, лишенныеTRIM25, дефекты в отношении продукции type-I interferons в ответ на вирусную инфекцию. Более того, точковая мутация сайта убиквитилирования RIG-I нарушает его способность индуцировать IFN-I. Дальнейшее подтверждение важной роли ubiquitylation в активации RIG-I получено благодаря находке, что CYLD может ингибировать вирусную индукцию IFN-I путем реверсии Lys-63-сцепленного полиубиквитилирования RIG-I (refs 42, 43).
Стоящий ниже RIG-I, ubiquitin также участвует в передаче сигналов с помощью MAVS. MAVS содержит два консенсусных TRAF6-связывающие сайты и др. мотив последовательностей для связывания с TRAF2 или TRAF3. Рекрутирование TRAF2 и TRAF6 на MAVS, как полагают, важно для активации NF-κB, mjulf как рекрутирование TRAF3 ведет к активации IRF3 (ref. 44). Подобно TRAF2 и TRAF6, TRAF3 содержит N-терминальный RING-домен, который способен активировать IRF3 (ref. 44). В согласии с TRAF3 polyubiquitylation, играющем важную роль в передаче сигналов MAVS signalling, DUBA, вновь идентифицированный DUB, специфически разбирает Lys-63-linked polyubiquitin цепочки на TRAF3, вызывая ингибирование TBK1 и IRF3 (ref. 45).
Ubiquitin in adaptive immunity
Благоприобретенный иммунитет находится под контролем T и B клеток, которые экспрессируют чрезвычайно широкий круг антигенных рецепторов. T-cell receptors (TCRs) распознают чужеродные пептиды - major histocompatibility complex (MHC) комплексы, представляемые antigen-presenting cells (APCs), которые включают дендритные клетки. Будучи активированными с помощью PAMPs, дендритные клетки презентируют патогенный пептид, связанный MHC, а также др. T-клеточные ко-стимулирующие молекулы на их поверхности. Инициальная активация, или запуск (priming), T клеток нуждается во взаимодействии MHC peptide-TCR, а также во взаимодействиях между ко-стимулирующими лигандами и их рецепторами. Активация T клеток инициирует адаптивную фазу иммунной реакции. T клетки, которые получают адекватные MHC и ко-стимуляцию, клонально увеличиваются и выполняют эффекторные функции. CD8
+ T клетки выполняют важную роль в антивирусной защите путем привлечения инфицированных клеток благодаря взаимодействию между MHC-I и TCRs и непосредственному их лизису. CD4
+ T клетки действуют в первую очередь как клетки помощники путем секреции цитокинов, чтобы управлять иммунной реакцией, обеспечиваемой др. эффекторными клетками, такими как CD8
+ T клетками и B клетками. B клетки, которые формируют др. плечо адаптивной реакции, активируются благодаря прямому контакту с антигеном посредством своих B-клеточных рецепторов. После активации B клетки пролиферируют, созревают в плазматические клетки и секретируют антитела.
TCR signalling
Будучи занятым MHC, связанным с родственным (cognate) пептидным эпитопом, комплекс TCR инициирует каскад фосфорилирования тирозина, приводя в результате к активации serine-threonine киназы PKCθ. PKCθ индуцирует образование комплекса, известного как CBM, состоящего из CARMA1, BCL10 и MALT1 (Fig. 3). Образование этого комплекса в конечном итоге ведет к активации IKK. MALT1 содержит сайты связывания для TRAF2 и TRAF6, а рекрутирование TRAF6 на CBM комплекс индуцирует E3 ligase активность у TRAF6, способствуя его олигомеризации
46. описаны некоторые мишени ubiquitylation для TRAF6, включая BCL10, MALT1, NEMO и сам TRAF6
46-49. Lys 63 polyubiquitylation этих белков, как полагают, является механизмом рекрутирования и активации TAK1 и IKK комплексов в ответ на TCR стимуляцию. Роли TAK1 и Lys 63 polyubiquitylation в этом TCR сигнальном пути были продемонстрированы с использованием мышиных моделей, лишенных TAK1 или UBC13 в T-клеточных клонах
50-53. Генетическое устранение TAK1 или UBC13 ведет к тяжелому дефекту в активации IKK и MAPK с помощью TCR стимуляции в тимоцитах и к существенной потере периферических Т клеток. Однако в одной работе было показано, что условные делеции UBC13 в др. типах клеток, таких как макрофаги и фибробласты, ингибируют MAPK, но не активацию NF-κB с помощью IL-1β b TNF-α
54, тогда как в др. исследовании было показано, что делеция одного аллеля UBC13 ингибирует активацию NF-κB с помощью множественных провоспалительных стимулов
55. Т.о., потребность в UBC13 в пути NF-κB может зависеть от типа клеток и стимулов. Возможно, что в некоторых путях др. E2, такие как UBC5, могут замещать UBC13, чтобы обеспечить активацию NF-κB
6.
Ubiquitin in autoimmunity
T-клеточные предшественники, происходящие из костного мозга, мигрируют в тимус, где они подвергаются сложному процессу отбора, прежде чем стать зрелыми Т клетками, которые распространятся по всему телу. Отбор Т клеток в тимусе имеет целью ограничить созревание только теми клетками, которые будут активироваться, когда их TCRs столкнутся с чужеродными пептидами в контексте MHC. Большинство self-peptide-MHC-распознающих Т клеток делетируется, чтобы предупредить аутоиммуннную активацию. Эта последняя функция, обозначаемая как 'central tolerance' не является совершенной, это позволяет созревать некоторым потенциально аутореактивным Т клеткам. Эти Т клетки обычно не представляют угрозы, благодаря дополнительной системе надзора, наз. 'peripheral tolerance', которая поддерживается посредством индуцируемой антигеном клеточной гибели или инактивации (anergy) Т клеток в отсутствие ко-стимуляции. Аутореактивные Т клетки могут также быть супрессированы за счет действия regulatory T (Treg) клеток. Некоторые E3 ubiquitin лигазы участвуют в поддержании центральной и периферической T-клеточно толерантности (Fig. 4).
Ubiquitin ligases in central tolerance
В тимусе Т клетки, которые производительно генерируют TCR, которые распознают MHC хозяина, переживают 'позитивный отбор'. Затем, чтобы гарантировать, что вредные аутореактивные Т клетки не проникнут на периферию, где они могут нападать на собственные ткани, тимус делетирует эти клетки, которые связывают self-peptide-MHC комплексы с высоким сродством в процессе 'negative selection'. Тимусные дендритные клетки и medullary epithelial cells (mTEC) представляют широкий круг собственных пептидов на их MHC для негативной селекции Т клеток. Зрелые Т клетки, покидающие тимус, толерантны к набору peripheral tissue antigens (PTAs). Экспрессия PTAs в mTECs клетках контролируется с помощью ядерного белка AIRE, мутации которого оказались сцепленными с аутоиммунной болезнью человека APECED (известной также как APS1)56, 57. AIRE содержит предположительно N-терминальный CARD, сопровождаемый SAND доменом и двумя PHD мотивами. Рекомбинантный полной длины AIRE или PHD1 только может совместно с E2 (UBC4 или UBCH5b), индуцировать ubiquitylation in vitro. Мутации в PHD1, обнаруженные у пациентов с APECED, как было установлено, устраняют активность E358. Однако этот результат спорный59, поэтому вопрос, действует ли AIRE как физиологически относящийся к делу E3, предстоит выяснить.
Как и в случае AIRE-дефицитных мышей, мыши, лишенные TRAF6, формируют воспалительные инфильтраты в различных органах
60. Делеция TRAF6 нарушает организацию тимуса и созревание mTEC и ведет к снижению экспрессии AIRE в тимусе. TRAF6 и NIK необходимы для REL-B экспрессии, которая в свою очередь необходима для экспрессии AIRE в тимусе. Недавнее исследование показало, что CD40 и RANK обеспечивают активацию TRAF6, NIK и IKK-β d mTECs
61.
Ubiquitin ligases in peripheral T-cell tolerance
Cbl-b является членом Casitas B-lineage lymphoma семейства белков и является RING-содержащим E3, как известно, регулирующим передачу проксимальных TCR сигналов62, 63. Нарушения в гене, кодирующем Cbl-b у мышей ведут к гиперактивации PCKθ, Akt и NF-κB. T клетки, лишенные Cbl-b могут быть активированы независимо от CD28 ко-стимуляции и также резистентны к индукции anergy. Из Cbl-b мишеней для убиквитилирования, phospholipase C-gamma1 (PLC-γ1), по-видимому, имеет наибольшее отношение к индукции anergy64, 65. Во время индукции anergy T клеток, Cbl-b ubiquitylates PLC-γ1, инактивируя или деградируя её, предупреждая тем самым Т клетки от полной активации. Cbl-b поставляется для деградации с помощью HECT-доменовой ubiquitin лигазы Nedd4, которая способствует активации Т клеток66.
GRAIL другой RING-доменовый E3, который играет роль в периферической толерантности67. Будучи стимулированными, T-клеточные гибридомы, которые эктопически экспрессируют GRAIL, обнаруживают снижение уровней mhfycrhbgnjd и белков IL-2 и IL-4. Эта anergic реакция зависит от GRAIL's RING домена, что указывает на важность его лигазной активности. повышенные уровни GRAIL обнаружены в anergized CD4+ T клетках, а также в CD4+CD25+ Treg клетках64. GRAIL , как недавно было установлено, катализирует Lys-63-linked polyubiquitylation of RhoGDI, это ведет к ингибированию активности Rho A GTPase68. GRAIL способствует также ubiquitylation и деградации CD40L, , который, как известно, вносит вклад в ко-стимуляции Т клеток69.
HECT-доменовый E3 ITCH играет ключевую рольв в периферической толерантности Т клеток70. Разрушение ITCH in vivo вызывает нарушение Т-клеточной толерантности, приводя к лимфоидной гиперплазии. При tolerizing условиях, T клетки, дефицитные по ITCH, продуцируют более высокие уровни TH2 цитокинов, таких как IL-4, и обнаруживают более значительную пролиферацию, чем клетки дикого типа71. ITCH фосфорилируется с помощью JNK, и это фосфорилирование усиливает его ubiquitin лигазную активность, приводя к polyubiquitylation и деградации JunB72. В TH2 клетках, JunB соединяется с промотором гена IL-4 и необходим для его транскрипции. Следовательно, в отсутствие ITCH, JunB стабилизируется, приводя к смещенной (skewed) Th2 реакции и аутоиммунитету. Др. субстратом для ITCH является TIEG1, транскрипционный фактор, необходимый для TGFβ-индуцируемой экспрессии FoxP3, который необходим для поддержания Treg клеток73. ITCH катализирует polyubiquitylation TIEG1; однако, эта ubiquitylation активирует TIEG1 вместо отправки его на деградацию. Т.о., ITCH обеспечивает периферическую T-клеточную толерантность посредством индукции Treg клеток.
Roquin, предполагаемый RING-доменовый E3, также может способствовать периферической толерантности
74. Roquin-мутантные Т клетки экспрессируют высокие уровни IL-21 и поверхностной ICOS, ко-стимулирующей молекулы. Усиленная экспрессия ICOS ведет к нарушению толерантности, к возникновению фенотипа, напоминающего системную красную волчанку (systemic lupus erythematosus). Roquin содержит N-терминальный RING домен, сопровождаемый ROQ доменом и zinc-finger доменом. сходным с тем, что обнаруживается у белков, которые соединяются с и регулируют стабильность мРНК. Roquin может регулировать стабильность ICOS мРНК, хотя неизвестно, нуждается ли эта регуляция в Roquin's RING домене.
Perspectives
The examples presented here provide only a glimpse into the expanding role of ubiquitylation in the regulation of immune responses. It is clear that polyubiquitylation is important not only for terminating immune responses through the destruction of immune regulatory proteins, but also for initiating and amplifying immune responses, as exemplified by the role of Lys-63-linked polyubiquitylation in the activation of protein kinases in the NF-κB and IRF pathways. As more components of the ubiquitin system, such as E3s and DUBs, are linked to the immune system, one challenge will be to understand the biochemical mechanisms underlying immune regulation by ubiquitin. Key to this mechanistic understanding is the identification of the substrates of ubiquitylation. Because de-ubiquitylation and degradation occur rapidly, the steady-state levels of the ubiquitylated intermediates in cells are normally very low. Fortunately, technological advances such as the use of mass spectrometry, which can identify proteins and map modification sites with very high sensitivity, should aid the discovery of the physiological substrates of ubiquitylation.
Equally important to substrate identification is the identification of the 'readers' of the ubiquitin signal. The discovery of nearly 20 types of UBD in the past few years should provide a boost to the identification of ubiquitin receptors involved in the immune system. If we know both the ubiquitylation targets and the ubiquitin receptors, it may be possible to biochemically reconstitute and reconstruct the ubiquitin signalling events as they happen during immune responses in vivo. A deep mechanistic understanding of ubiquitin signalling would be extremely
Сайт создан в системе
uCoz
