Внутренние органы позвоночных обладают существенной асимметрией по отношению left-right (LR) оси как в терминах относительного положения, тае и морфологии. Выявлен консервативный молекулярный путь, использующий члена сверхсемейства transforming growth factor- Nodal. У всех проанализированных видов экспрессия
nodal в lateral plate mesoderm (LPM) необходима для собственно позитивной регуляции нижестоящих генов, включая
lefty1/2 и транскрипционный фактор pitx2 в левой-LPM. Аномальная экспрессия этих генов в LPM ассоциирована с аномальным расположением позднее внутренних органов (rev. Hamada et al.,[2002]). Механизмы, с помощью которых нарушается LR симметрия, до конца не выяснены.
INITIAL BREAK OF LR SYMMETRY
Frog and Chick
У Xenopus асимметричное распределение serotonin, хаперонового белка 14-3-3E и ионного насоса H+,K+-ATPase обнаруживается рано, уже в первых нескольких клеточных делениях (Bunney et al.,[2003]; Fukumoto et al.,[2005]; Adams et al.,[2006]). Нарушение такой асимметричной генной активности за счет усиления экспрессии или химического ингибирования приводит к рандомизации экспрессии nodal и положения внутренних органов, указывая тем самым, что асимметричная экспрессия генов обнаруживается на очень ранних ступенях формирования LR паттерна у лягушек. Пока ещё асимметричная локализация H+,K+-ATPase не обнаруживается у эмбрионов кур, блокирование активности H+,K+-ATPase с помощью химических ингибиторов достаточно, чтобы нарушить склонную к левой стороне экспрессию shh вокруг Гензеновского узелка, которая предшествует асимметричной экспрессии nodal у кур и вызвать рандомизацию внутренних органов (Levin et al.,[2002]; Raya et al.,[2004]). Более того, щелевые соединения также необходимы на очень ранних ступенях детерминации LR у кур и Xenopus (Levin and Mercola,[1998],[1999]). разрушение щелевых соединений ведет к потере асимметрии shh у кур и к heterotaxic organ situs у Xenopus. Принимая во внимание физиологическую роль H+,K+-ATPase в перекачке протонов из клеток, чтобы создавать негативный мембранный потенциал, было предположено, что у кур и Xenopus, H+,K+-ATPase может поддерживать асимметричность клеточного потенциала напряжения (voltage potential), это позволяет заряженным, низкого молекулярного веса сигнальным молекулам проходить через щелевые соединения и накапливаться преимущественно на одной стороне эмбриона. Альтернативно, эти две молекулы могут функционировать параллельно, чтобы влиять на секрецию и транспорт LR детерминант (Oviedo and Levin,[2007]).
Mouse
первым проявлением LR асимметрии у мышей является временный, управляемый ресничками левонаправленный ток жидкости в узле. Этот управляемый ресничками ток предшествует и необходим для установления асимметричной передачи сигналов nodal. Мыши, дефицитные по моторным белкам ресничек, таким как KIF3 (a plus-end microtubule motor) и Left/right dynein (Lrd, a minus-end microtubule motor) не обнаруживают заметного тока в узелке и характеризуются рандомизацией внутренних органов (Nonaka et al.,[1998]; Okada et al.,[1999]; Takeda et al.,[1999]; McGrath et al.,[2003]). Сходным образом положение органов нарушено у мышей, дефицитных по Inversin, др. белку ресничек, необходимому для генерации тока в узелке (Okada et al.,[1999]; McGrath et al.,[2003]). Более того, искусственная поддержка левонаправленного тока может направлять развитие в нормальном направлении у lrd и inversin мутантных мышей (Nonaka et al.,[2002]; Watanabe et al.,[2003]), указывая тем самым, что ток в узелке, являющийся критическим компонентом формирования LR паттерна, нарушен у этих мутантов.в
Предложены две модели для объяснения как ток в узелке управляет LR асимметрией. Обе модели отмечают увеличение на левой стороне уровней внутриклеточного кальция как раз ниже нодального тока в процессе детерминации LR оси. Используя иммуногистохимию и lrd-GFP knock-in мышей, McGrath et al. показали, что имеются, по крайней мере, два типа ресничек в узелке мышей: более центрально расположенные подвижные реснички, которые экспрессируют как Lrd, так и Pkd2 , и более периферически расположенные Pkd2-позитивные, но Lrd-негативные неподвижные реснички, которые могут функционировать как механосенсоры (McGrath et al.,[2003]). Pkd2 является проницаемым для Ca2+ каналом, который, как было показано, локализуется преимущественно в ресничках почечных клеток. В клетках почек Pkd2 ощущает ток жидкости и вызывает увеличение уровней внутриклеточного кальция (Nauli et al.,[2003]). Модель двух типов ресничек предполагает, что сенсорные реснички на левой периферии узелка отвечают на ток жидкости, приводящий к накоплению внутриклеточного кальция на левой стороне узелка (Tabin and Vogan,[2003]).
Альтернативная модель базируется на открытии малых покрытых мембраной объектах, наз. nodal vesicular parcels (NVP), которые перемещаются поперек узелка у мышей в левую сторону (Tanaka et al.,[2005]). Химическое ингибирование Fgf рецепторов показало, что передача сигналов Fgf необходима для продукции NVPs и асимметричной передачи сигналов кальция на левой стороне узелка, но безразлична для генерации левонаправленного нодального тока. Sonic hedgehog (Shh) и retinoic acid (RA) присутствуют в NVPs, а дефекты продукции NVP и ассиметричной передачи сигналов кальция, вызываемые ингибированием передачи сигналов Fgf, могут быть восстановлены с помощью введения экзогенного белка Shh или RA, указывая тем самым, что FGF-зависимое накопление на поверхности морфогенов ммогут быть существенным для продукции NVP (Tanaka et al.,[2005]). Как слияние Shh и RA-содержащих NVPs на левом краю узелка может запускать увеличение внутриклеточных уровней кальция пока неизвестно.
Zebrafish
Блокирование активности H+,K+-ATPase у рабок данио приводит к дефектам LR, указывая тем самым, что подобно курам и Xenopus, рыбки нуждаются в активности H+,K+-ATPase на ранних ступенях формирования LR паттерна (Kawakami et al.,[2005]). Точные механизмы, с помощью которых ранний приток ионов влияет на детерминацию LR у рыбок данио пока неизвестен.
У рыбок данио, подобно мышам, управляемый ресничками ток жидкости необходим для установления LR оси. Kupffer's vesicle (KV), временный эмбриональный орган располагается на заднем конце хорды, это рыбий эквивалент узелка мышей, связанный с формированием LR паттерна (Amack and Yost,[2004]; Bisgrove et al.,[2005]; Essner et al.,[2005]; Kramer-Zucker et al.,[2005]). Нарушение морфогенеза KV с помощью нокдауна двух T-box генов,
ntl и spt, приводит к рандомизированному расположению внутренних органов (Amack et al.,[2007]). Подобно узелку мышей ротации ресничек KV генерируют ток жидкости в KV рыбок данио. Потеря функции белков внтри-жгутикового транспорта, таких как IFT88/Polaris и IFT57/Hippi ингибирует образование ресничек, приводя к потере направленного тока жаидкости в KV и к рандомизации положения органов у рыбок данио (Bisgrove et al.,[2005]; Kramer-Zucker et al.,[2005]; Kreiling et al.,[2007]). Также параллельно мышиному узелку левостороннее увеличение уровней кальция выявляется в ткани, окружающей KV рыбок данио (Sarmah et al.,[2005]), указывая тем самым. что ранние ступени в формировании LR паттерна у мышей и рыбок данио ммогут быть фактически идентичными или очень сходными.
CALCIUM SIGNALING IN LR PATTERNING
Кальций является важной сигнальной молекулой, регулирующей различные биологические процессы. Накопившиеся доказательства указывают на то, что кальций участвует в формировании LR паттерна у всех крупных позвоночных модельных организмов (мышей, кур, Xenopus и рыбок данио). Однако подобно механизмам, с помощью которых нарушается симметрия, роль кальция в формировании LR паттерна, по-видимому, не сильно законсервирована среди позвоночных.
Mechanisms for Generating Asymmetric Intracellular Ca2+ Signaling Around the Node
Повышенные уровни внутриклеточного кальция присутствуют на левой стороне ущелка мышей перед началом асимметричной экспрессии генов (Fig. 1). Две гипотезы с ресничками предполагают. что нодальный ток запускает высвобождение кальция посредством механосенсорных, экспрессирующих Pkd2 ресничек (Tabin and Vogan,[2003]). Эта гипотеза подтверждается данными, что у эмбрионов, лишенных Pkd2, уровни кальция не повышаются на какой-либо стороне узелка (McGrath et al.,[2003]). Однако находки, что блокирование образования NVP с помощью ингибирования передачи сигналов Fgf, предупреждает увеличение уровней кальция вокруг узелка, не влияя на нодальный ток (Tanaka et al.,[2005]), указывает на то, что только механосенсорная модель не способна объяснить, как уровни кальция специфически повышаются на левой стороне. Может ли одна гипотеза заменить др. или эти механизмы действуют параллельно, ещё предстоит определить. Важно определить, продуцируются и транспортируются ли NVPs нормально с помощью нодального тока у мутантов pkd2 и имеют ли Fgf-ингибированные эмбрионы популяцию Pkd2-экспрессирующих сенсорных ресничек. Влияние потери Pkd2 подвижность nodal/KV ресничек непосредственно ещё не было проанализировано. Однако учитывая находки, что подвижность пронефрических ресничек не затрагивается у pkd2 morphants и мутантов рыбок данио (Bisgrove et al.,[2005]; Obara et al.,[2006]; Schottenfeld et al.,[2007]; Sullivan-Brown et al.,[2008]), вряд ли возможно, что pkd2 необходим для подвижности nodal/KV ресничек. Возможно, что Pkd2 экспрессирующие реснички могут служить в качестве сенсоров для NVPs, т.к. реснички, как известно, необходимы для передачи сигналов Hedgehog и Shh, присутствующих в NVPs (Tanaka et al.,[2005]). Однако несмотря на присутствие Shh и ретиноевой кислоты в NVPs, пока нет доказательств асимметричности передачи сигналов Shh или ретиноевой кислоты вокруг узелка (Tabin,[2006]).
Наблюдение perinodal кальциевого фенотипа у lrd (iv) мутантов, которые имеют неподвижные нодальные реснички, неожиданно представило важную информацию, важную для обеих моделей ресничек и NVP. McGrath et al. показали, что уровни кальция отсутствуют в большинстве lrd мутантов (McGrath et al.,[2003]), тогда как Tanaka et al. наблюдали двухстороннее увеличение кальция у большинства lrd мутантов (Tanaka et al.,[2005]). Двухсторонее увеличение кальция у lrd мутантов может согласоваться с NVP моделью, в которой морфоген содержащие частицы генерируются на обеих сторонах узелка и ломаются вблизи точки своего возникновения а отсутствии тока. С одной стороны, потеря повышения кальция д. больше соответствовать механосенсорной модели, в которой Pkd2 содержащие реснички не могут синхронно запускать высвобождение кальция без нодального тока. Дальнейшие исследования необходимы, чтобы разрешить расхождения между моделями двух типов ресничек и NVP и чтобы сформулировать новую модель, объясняющую в точности, как нодальный ток генерирует левостороннее повышение кальция.
Как и у мышей наблюдается временное повышение уровней внутриклеточного кальция на левой стороне KV и рыбки данио нуждаются в Pkd2 для собственно асимметричной экспрессии генов и асимметрии органов. Эти данные указывают на то, что у рыбок данио, как и у мышей, Pkd2 экспрессирующие реснички могут выполнять сенсорную роль, по детекции или тока жидкости или морфогенов, транспортируемых этим током, по трансляции этой информации об асимметрии в асимметричные кальциевые сигналы. Пока неясно, обладают ли рыбки данио NVPs или неподвижными Pkd2-экспрессирующими сенсорными ресничками, было бы интересно определить, являются ли у рыбок данио и др. позвоночных общими эти механизмы запуска асимметрии передачи сигналов кальция на левой стороне узелка.
Asymmetric Extracellular Ca2+ Signaling Around the Chick Node
У кур повышенные уровни внеклеточного кальция были выявлены на левой стороне Гензеновского узелка и была разработана модель для объяснения того, как эти повышенные уровни кальция могут влиять на LR асимметричную экспрессию генов (Raya et al.,[2004]). В этой модели, повышенный внеклеточный кальций на левой стороне, как полагают, потенциирует передачу сигналов Notch, приводя к усилению экспрессии уровня Notch лиганда delta-like 1 (dll1) или left (Fig. 1). Симметричная экспрессия
dll1 и потеря на левой стороне
nodal наблюдались у эмбрионов, обработанных calcium chelator BAPTA, показывая тем самым, что асимметричная передача сигналов кальция существенна для LR асимметричной экспрессии генов. Raya et al. таже использовали модель культивируемых клеток, чтобы показать, что путем увеличения концентрации кальция в культуральной среде, реакция репортера активности Notch на лиганд может быть усилена. Избыточная экспрессия доминантно-негативной формы
dll1 в perinodal области кур ведет к потере левосторонней экспрессии
nodal , помещению передачи сигналов Notch выше передачи сигналов Nodal в каскаде LR асимметричной генной экспрессии. было бы интересно определить, существуют ли какие-либо взаимоотношения между асимметрией внеклеточного кальция, выявляемой у кур, и асимметрией внутриклеточного кальция, выявляемой у мышей и рыбок данио. Напр., повышение внутриклеточного и внеклеточного уровней кальция могут идти рука об руку у всех трех организмов. Интересно, что потребность в передаче сигналов Notch в формировании LR была тажк описана у модельных рыбок данио и мышей (Krebs et al.,[2003]; Raya et al.,[2003]; Gourronc et al.,[2007]), но этого пока не удается связать с уровнями внутриклеточного или внеклеточного кальция.
Ca2+ Signaling in Zebrafish LR Patterning
Недавние работы на модельных рыбках данио открыли дополнительные роли кальция в формировании LR паттерна, которые стоят выше нодального тока: регуляция морфогенеза KV и функционирование KV ресничек. (Fig. 1). Получение картины внутриклеточных уровней кальция у эмбрионов рыбок данио показало, что временное высвобождение кальция происходит в регионе щитка (shield) и dorsal forerunner cells (DFC, предшественников KV; Schneider et al.,[2008]). Два независимых исследования показали, что обработка с помощью thapsigargin, Ca2+ ATPase ингибитора, который предупреждает накачивание Ca2+ обратно в эндоплазматический ретикулём, нарушает формирование KV и рандомизирует асимметричную экспрессию генов и асимметрию органов (Kreiling et al.,[2008]; Schneider et al.,[2008]). Однако механизмы. с помощью которых действие thapsigargin вызывает дефекты LR остаются неизвестными. Было показано, что thapsigargin вызывает временное повышение цитоплазматического Ca2+ из ER (Thastrup et al.,[1990],[1994]). Увеличение в цитозоле Ca2+ обнаруживается у эмбрионов, которые были обработаны низкой концентрацией thapsigargin (0.5 M for 2 hr) (Kreiling et al.,[2008]) , тогда как отмечается репрессия притока Ca2+ у эмбрионов, обработанных высокими пульсовыми воздействиями thapsigargin (2.5 M for 10-20 min; Schneider et al.,[2008]). Обусловлено ли это расхождение разными методологиями, использованными для измерения уровней цитозольного Ca2+, или различия в дозе и времени воздействия нуждаются в тщательных исследованиях. Однако находки. что эмбрионы, обработанные др. агентами, которые супрессируют высвобождение Ca2+ вызывают фенотипы, сходные с таковыми у эмбрионов. обработанных высокими концентрациями thapsigargin, указывая, что ингибирование DFC регионального притока Ca2+ мешает формированию LR паттерна посредством нарушения миграции и соединения DFC и супрессии образования KV (Schneider et al.,[2008]).
Помимо регуляции формирования KV уровни цитозольного Ca2+ в DFC/KV также модулируют подвижность ресничек. NCX4a (известный также как slc8a4a) и Na,K-ATPase 2 (также известная как atp1a2a) являются двумя генами, необходимыми для гомеостаза кальцияв DFC и KV (Shu et al.,[2007]). Нокдаун NCX4a и Na+,K+-ATPase 2 в DFC/KV нарушает передачу сигналов nodal и рандомизирует асимметрию органов, указывая тем самым на роль NCX4a и Na+,K+-ATPase 2 в формировании LR паттерна. Общая морфология KV, количество и длина KV ресничек, по-видимому, нормальны у NCX4a и Na+,K+-ATPase 2 морфанты (эмбрионов, которым инъецировали morpholino). Однако реснички внутри KV у этих эмбрионов неподвижны, т.к. это демонстрируется отсутствием KV тока жидкости и прямым наблюдением с использованием высокоскоростного видео. NCX функция является одним из первичных механизмов, с помощью которого кальций выталкивается из клеток, а Na+ градиент, устанавливаемый с помощью Na+,K+-ATPase помогает управлять выталкиванием кальция посредством NCX (rev. Blaustein and Lederer,[1999]). На ст. бластулы у NCX4a и Na+,K+-ATPase 2 морфантов уровни внутриклеточного кальция глобально повышены. Интересно, что усиление передачи сигналов кальция путем инъекций конституитивно активной формы Calcium/calmodulin-dependent protein kinase II (CaMKII) также ведет к дефектам асимметрии органов, а снижение активности CaMKII за счет химического ингибитора KN-62 способно устранять дефекты асимметрии органов и KV ток у NCX4a и Na+,K+-ATPase 2 морфантов (Shu et al.,[2007]). Более того, ингибирование CaMKII также было способно супрессировать дефекты LR у эмбрионов, обработанных A23187, calcium ionophore, которые позволяют кальцию из внеклеточных пространств проникать в клетки, увеличивая внутриклеточные его уровни. Т.о., увеличение уровней цитозольного Ca2+ ингибирует подвижность KV ресничек за счет CaMKII обеспечиваемого пути.
Большинство доказательств роли кальция в подвижности KV ресничек получено при нокдауне ipk1, киназы. которая превращает inositol 1,3,4,5,6-pentakisphosphate (IP5) в inositol hexakisphosphate (IP6; Sarmah et al.,[2007]). Внутриклеточный мессенджер IP6 ещё раньше был связан с предачей сигналов кальция в многочисленных исследованиях. Нокдаун ipk1 (также известной как ippk) у рыбок данио редуцирует приток Ca
2+ в ткани вокруг KV и, скорее всего, нокдаун NCX4a и Na
+,K
+-ATPase 2 приводит к потере подвижности KV ресничек и онтогенетическим LR дефектам (Sarmah et al.,[2005],[2007]). KV реснички у ipk1 морфантов также более короче, чем в норме, это указывает на участие передачи сигналов кальция на регуляцию биогенеза также KV ресничек(Sarmah et al.,[2007]). Необходимы дальнейшие исследования, чтобы определить, являются ли дефекты KV ресничек у ipk1 морфантов результатом аберрантной передачи сигналов кальция или др. путь контролируется с помощью
IP6.
REMAINING QUESTIONS
While the mechanisms by which symmetry is initially broken appear to be divergent among vertebrates, recent findings suggest that directional fluid flow in a ciliated node-like structure might be a common feature of the early steps of vertebrate LR axis formation. Nodal or KV flow has been noted in numerous fish and mammalian species (Okada et al.,[2005]). Recently, a cilia-driven leftward fluid flow was also noted in the gastrocoel roof plate in Xenopus (Schweickert et al.,[2007]). Blocking the cilia-driven nodal flow resulted in laterality defects, indicating that directed fluid flow precedes and is required for asymmetric nodal expression in Xenopus as it is in fish and mammals. The Lrd protein has been reported to be located in the cilia of Hensen's node (Essner et al.,[2002]), suggesting that cilia-driven flow may also be present in Hensen's node. It will be interesting to investigate whether these cilia drive directional fluid flow and influence LR determination in the chick embryo as they do in all the other major vertebrate model organisms.
How is leftward fluid flow established in the node? In the mouse, the nodal cilia are tilted posteriorly, and fluid dynamic modeling confirmed that rotation of posteriorly tilted cilia is capable of generating a net leftward flow (Nonaka et al.,[2005]). In the zebrafish, cilia are distributed densely on the dorsoanterior surface and lightly on the ventral surface of KV (Kreiling et al.,[2007]) and in Xenopus, cilia in the gastrocoel roof plate are polarized to the posterior pole of cells (Schweickert et al.,[2007]). Thus, it is clear that cilia are not randomly distributed in the node or its equivalent structures. Molecular mechanisms that establish the pattern of cilia distribution in the node are worth studying in the near future. Furthermore, once asymmetric intracellular calcium levels have been established on the left side of the mouse node and zebrafish KV, they must somehow be converted into asymmetric gene expression. The specific pathways influenced by calcium that are relevant to LR patterning should be a focus of further investigation.
Studies in the zebrafish have revealed multiple roles for Ca2+ in the formation and function of KV cilia. Interestingly, Xenopus embryos treated with the calcium ionophore A23187 also have defects in organ laterality (Toyoizumi et al.,[1997]). In light of the finding that Xenopus has a structure analogous to the zebrafish KV and mouse node, Ca2+ may play a role in regulating the motility of its cilia as well. Another interesting finding from the zebrafish studies is that the repression and elevation of intracellular Ca2+ levels influence LR patterning by different cellular mechanisms. Inhibiting calcium release interferes with DFC migration and KV formation, whereas elevating intracellular calcium levels inhibits KV cilia motility without affecting KV morphogenesis or KV cilia biogenesis. How Ca2+ flux directs KV morphogenesis is currently not known. An accumulation of -catenin was detected in the nuclei of thapsigargin treated zebrafish and Xenopus embryos, suggesting an antagonistic relationship between Ca2+ and the Wnt/-catenin pathway during KV morphogenesis (Schneider et al.,[2008]). However, the causative relationship between Ca2+ and Wnt signaling in guiding DFC migration needs further investigation. Furthermore, the mechanism by which calcium regulates nodal cilia motility also requires further investigation. Calcium levels have been proposed to modulate dynein-regulated microtubule sliding, and thereby affect the waveform of Clamydomonas flagella and the motility of sea urchin sperm flagella (Brokaw,[1979]; Gibbons and Gibbons,[1980]; Nakano et al.,[2003]; Wargo et al.,[2004]). Because CaMKII is known to be an important component of calcium signaling in zebrafish LR development, it is possible that CaMKII directly or indirectly regulates dynein activity in KV cilia. Alternatively, proper calcium homeostasis and signaling might be required for the biogenesis of ultrastructurally normal motile KV cilia.
Studies in the past decade have delineated a conserved molecular cascade involving nodal signaling that functions to transmit LR axis information globally. However, very little is known about how individual organs interpret and respond to these signals. In the zebrafish model, mutants have been identified that have defects in the laterality of one organ but not the others. For example, normal cardiac laterality, but a low penetrance of visceral organ laterality defects, has been reported in heart and mind, a mutant deficient for Na,K-ATPase 1B1 (also known as atp1a1; Shu et al.,[2003]; Ellertsdottir et al.,[2006]) and lost-a-fin, a zebrafish mutant in the type I BMP receptor, Alk8, has cardiac looping defects but normal visceral laterality (Chen et al.,[1997]). Consistently, BMP4 signaling is required for cardiac, but not visceral laterality (Chocron et al.,[2007]). These findings suggest that the heart and the visceral organs respond to global LR signals independently. It has been noted that asymmetric BMP4 expression in the newly fused heart is required for proper placement and morphogenesis of the developing zebrafish heart (Chen et al.,[1997]). In an elegant cell tracing study, Smith et al. further demonstrate that BMP signaling regulates the direction of cardiac progenitor cell migration and thereby directs cardiac laterality (Smith et al.,[2008]), providing a mechanism by which one organ's laterality is specified. How the sodium pump directs visceral organ-specific laterality is worth pursuing and genetic and molecular dissection facilitated by the zebrafish model is likely to assist the investigation of mechanisms used by each organ to interpret global LR signals.
Сайт создан в системе
uCoz