Понимание процесса, с помощью которого клетки воспринимают разные судьбы в нервной системе является фундаментальным. Т.к. многие нейроны обладают сходством в своем развитии, серия молекулярных событий, которая представляет этот процесс. довольно различна для каждого типа нейронов. Rohon-Beard (RB) сенсорные нейроны являются уникальными нейронами. которые существуют у развивающихся эмбрионов амниот и вносят важный вклад в эмбриональную нервную систему. RBs иннервируют кожу и представляют самый ранний механизм, с помощью которого эмбрионы видов. таких как рыбки данио и Xenopus получают информацию о её развитии. Когда их нервные окончания активируются при легком прикосновении, то эмбрионы сокращают мышцы нва противоположной стороне тела, чтобы отстранить прочь туловище от стимула и отплыть в противоположном направлении (Roberts, 2000). Хотя клеточные тела большинства сенсорных нейронов расположены в периферической нервной системе, клеточные тела RB сенсорных нейронов расположены в дорсальной области спинного мозга эмбрионов. Т.к. эти нейроны являются первыми механосенсорными нейронами, функционирующими у эмбрионов, то молекулы, участвующие в их развитии, находятся среди самых ранних, чтобы выполнять роль в спецификации клеточных судеб нейрональной популяции.
RBs формируют neural plate border (NPB), область эктодермы, которая расположена между нервной пластинкой и эпидермальной эктодермой перед нейруляцией. Предыдущие исследования продемонстрировали, что взаимодействия между этими тканями достаточны для образования RB. Кроме того, небольшое количество известных генов, важных для развития RB. экспрессируются в NPB. Напр., промежуточные уровни передачи сигналов BMP, которые наблюдаются в NPB важны для развития этих нейонов (Neave et al., 1997: Nguyen et al,, 2000; Rossi et al" 2008). Транскрипционный фактор prdm1a, стоящий ниже передачи сигналов BMP и экспрессируемый в NPB, также необходим для развития RBs. Эмбрионы рыбок данио с мутацией в prdm1a, известные как narrowminded мутанты, неспособны формировать RBs или обращаться в бегство в ответ на прикосновение к туловищу (Artinger et al., 1999: Hernandez-La-gunas et al., 2005). Предполагаемый prdm1a белок у narrow minded мутантов не содержит ДНК связывающего домена, это предупреждает способность белка действовать как транскрипционный фактор. Очевидно, что prdm1a необходим для развития RBs. Молекулы, которые действуют ниже prdm1a в развитии RB, пока неизвестны.
Экспрессия
prdm1a в NPB предшествует маркерам дифференцированных RBs в NPB, последний из которых впервые обнаруживается на ст. примерно 11 hpf. Понимание роли prdm1a и др. факторов, важных для спецификации клеточных судеб в NPB нуждается в понимании временного периода, в течение которого приобретаются разные NPB судьбы. Можно установить "дату рождения" RBs благодаря тому факту, что нейроны прекращают делиться перед тем как стать полностью дифференцированными. Ранние эксперименты Lamborghini (1980) установили, что у
Xenopus большинство RBs появляется в конце гаструляции. Эти эксперименты проверены включением радиоактивных нуклеотидов в ходе стадии гаструляции, чтобы идентифицировать, когда появляются разные наборы нейронов у эмбрионов. Даты рождения RBs у рыбок данио ещё предстоит исследовать и определить, когда RBs вступают в свои финальные клеточные деления, э то важно для идентификации периода развития, в течение которого эти нейроны приобретают свои судьбы.
Помимо prdm1a и др. транскрипционные факторы, которые экспрессируются в также неоходимы для развития RB нейронов. Напр., содержащий гомеодомен транскрипционные факторы dlx3b и dlx4b экспрессируются в перекрывающихся доменах в NPB у эмбрионов рыбок данио (Ellies et al., 1997) и их де1йствие перекрывается в развитии RBs. Предупреждение трансляции функционального белкового продукта для любого из этих генов, используя антисмысловые morpholinos, оказывает незначительный эффект на развитие RB но инъекции morpholinos для обоих генов вызывает уменьшение или потерю RBs в NPB (Kaji and Artinger, 2004). Пока неизвестно, работают ли эти транскрипционные факторы в том же пути, что и
prdm1a в развитии RB. Кроме того, некоторые транскрипционные факторы, как известно, необходимы для развития некоторых, но не всех RBs, таких как tfap2a и tfap2c, которые необходимы для развития субнабора RBs (Li and Cornell, 2007). Далее, olig4, по-видимому, негативно регулирует RBs, а morpholino против этого транскрипционного факт ора приводит к увеличению RBs (Filippi et al., 2005).
bHLH транскрипционный фактор neurogeninl начинает экспрессироваться в домене, предположительно осуществляя свою потенциальную функцию в развитии RB несколько позднее, чем dlx3b и dlx4b безусловно после инициации экспрессии
prdm1a. На ст. 3-х сомитов neurogeninl экспрессируется в виде плотного кластера клеток с высокой экспрессией в трех полосках, наиболее латеральная из которых соответствует NPB (Blader et al., 1997). Потеря функции этого гена вызывает уменьшение RBs (Cornell and Eisen, 2002). Если трансгенные рыбки данио, экспрессирующие GFP под контролем полного регуляторного домена neurogeninl, скрещиваются с
prdm1a мутантами, то экспрессия GFP снижается в NPB (Blader and Strahle, 2003), указывая тем самым, что
prdm1a может регулировать экспрессию neuogeninl. neuroD был описан как мощный активатор нейрональной судьбы, в этом качестве он превращает эктодерму
Xenopus в нейроны (Lee et al., 1995). У рыбок данио neuroD экспрессируется в субнаборе первичных нейронов, включая и RB нейроны и он необходим для дифференцировки нейронов (Korzh et al., 1998).
Чтобы решить вопрос о приобретении судеб ранними клетками в NPB в отношении развития RB была охарактеризована экспрессия генов на границе нервной пластинки и исследованы транскрипционные пути, необходимые для спецификации RB. Мы изучали экспрессию prdm1a в отношении нейральных и эпидермальных маркеров и установили значительное перекрывание с эпидермальным маркером dlx3b, меньшее перекрывание с маркером нейральной эктодермы, sox3, и не выяви ли перекрывания с нейральным геном soxlSa. Анализ дат рождения выявил, что большинство RBs подвергается финальным клеточным делениям у рыбок данио во время стадий гаструляции, когда граница нервной пластинки присутствует у эмбриона,подобно тому как это происходит у Xenopus. Чтобы локализовать prdm1a в молекулярном пути, мы изучали экспрессию генов у prdm1a мутантов на ст. гаструлы. Как было показано ранее dlx3b подавляется у мутантов prdm1a и мы установили, экспрессия близко родственного гена dlx4b также снижается у prdmla-дефицитных эмбрионов. Важно, что мРНК для dlx3b и dlx4b может восстанавливать отсутствующие RBs у prdm1a мутантных эмбрионов. Сходным образом мы установили, что экспрессия neurogeninl снижается или отсутствует в NPB prdm1a мутантов и что мРНК neurogeninl может восстанавливать отсутствующие RBs у prdm1a мутантных эмбрионов. Т.о., мы предлагаем gene regulatory network (GUN) для развития RB, где оба dlx3b/4b также как и neurogeninl и neuroD являются стоящими ниже prdm1a при образовании RB.
DISCUSSION
Мы показали, что prdm1a перекрывается в значительной степени с экспрессией в не нейральной эктодерме dlx3b, чем с нейральными маркерами в развивающемся NPB, и что большая часть RBs рождается на этой стадии гаструлы, prdmla, как было показано, действует выше dlx3b и dlx4b, двух транскрипционных факторов, как известно, необходимых для развития RB. Сходным образом prdm1a,по-видимому, регулирует транскрипцию neurogeninl в NPB. мРНК для dlx3b и dlx4b или neurogeninl может частично восстанавливать презумптивные RBs в NPB.
RBs Are Born During Gastrulation in Zebrafish
Наши данные по времени возникновения сходны мс предыдущими находками с использованием aH-thymidine у Xenopus. когда большинство RBs появлялось во время гаструляции (Lamborghini, 1980). Это указывает на то, что у обоих видов большинство RBs заканчивает свои терминальные клеточные деления примерно во время закрытия нервной трубки и за несколько часов перед тем как они посылают отростки и становятся функциональными. Это занимает период между временем когда рождаются RBs и периодом, в течение которого они становятся функциональными, это указывает на то, что серия сигнальных молекул и транскрипционных факторов скорее всего необходима для RBs, чтобы стать полностью функциональными. Мы сфокусировались на ранних стадиях развития RB? изучая молекулы, участвующие в спецификации RB.
Epidermal Ectoderm Contributes Significantly to RB Neurons
Трансплантационный анализ, при котором создавались эктопические взаимодействия между нейральной и эпидермальной эктодермой у Xenopus показал, что нейральная и эпидермальная эктодерма вносят вклад в RBs (Rossi et al., 2008). Мы показали, что маркеры как нейральной, так и эпидермальной эктодермы перекрываются с экспрессией NPB маркера prdm1a, но что перекрывание с dlxSb значительнее, чем с нейроэктодермальными маркерами sox3 или soxl9a. Это указывает на то,что в противоположность тому, что было показано для Xenopus при экспериментальных условиях, имеющий первостепенное значение вклад ткани в NPB in situ скорее всего преимущественно не нейральной эктодермы скорее, чем нейральной. Отсутствие очевидного перекрывания prdm1a с маркерами или нейральной или эпидермальной ткани позднее в гаструляции указывает на то, что более старый NPB отличен от каждой из этих тканей.
RBs and Neural Crest Cells Require a Similar Set of Genes at the Developing NPB
Др. популяция клеток, клетки нервного гребня, также возникает из NPB. Клетки нервного гребня являются популяцией подобной стволовым клеткам, которые формируются в развивающихся эмбрионах позвоночных и в последствии дифференцируются в разнообразные наборы разных типов клеток, включая большую часть периферической нервной системы. Молекулы, важные для развития клеток нервного гребня активно исследуются и была предложена neural crest gene regulatory network (NC GRN). Эта сеть базируется в первую очередь на экспрессии этих факторов у множественных позвоночных и у хордовых. Сеть включает индукторы, гены, которые необходимы для индукции судеб клеток нервного гребня (BMPs, FGFs, и Wnts), NPB спецификаторы, гены, экспрессируемые в домене NPB (zicl, msxl, msx2, dlx3, dlx5, pax3, and pax7), спецификаторы нервного гребня, гены, которые экспрессируются в домене нервного гребня (snail 1, snail2, sox8, sox&, soxlO, foxd-3, ap-2, twist, c-myc, и члены семейства id), и некоторые эффекторные гены, которые экспрессируются в специфических субнаборах производных клеток нервного гребня (Sauka-Spengler and Bronner-Fraser, 2008).
Т.к. и RBs и клетки нервного гребня возникают из NPB, то некоторые из молекул, которые принимают участие в образовании NC GRN,особенно индукторы и спецификаторы NPB скорее всего важны для развития обоих типов клеток. В самом деле, передача сигналов BMP необходима для прравильного развития как RBs, так и клеток нервного гребня (Marchant et al., 1998: Neave et al, 1997; Nguyen et al., 1998; Rossi et al., 2008; Tribulo et al., 2003). Ген prdm1a, кроме того необходимый для развития RB рыбок данио, также существенен для развития клеток нервного гребня большей части туловища, prdm1a мутанты обнаруживают уменьшение премиграторных клеток нервного гребня туловища и многих производных нервного гребня туловища (Artinger et al., 1999). Благодаря его функции в развитии как RBs, так и клеок нервного гребня туловища prdm1aскорее всего действует на уровне спецификацификаторов NPB.
Поскольку эмбрионы с потерей функции dlx3b и dlx4b обнаруживают уменьшение количества RBs, но развитие NCCs туловища не изменено у этих морфанов (Kaji and Artinger, 2004). Это указывает на то, что dlx3b и dlx4b находятся среди самых ранних транскрипционных факторов, необходимых дифференциально для RBs, но не для NCCs в NPB. Гены dlx в позиционировании, как известно, играют роль в позиционировании NPB у Xenopus (Woda et al., 2003), а dlxSb считается спецификатором NPB в соответствии с NC GRN (Sauka-Spengler and Bronner-Fraser, 2008). Тот факт, что у рыбок данио гены dlx более специфически необходимы для RBs, но не NPB клеточных судеб в целом может подчеркивать различия между видами в отношении NC GRN.
dlx3b, dlx4b, and neurogeninl Are Required Downstream of prdm1a in RB Development
Наши эксперименты по восстановлению показали, что dlx3b и dlx4b функционируют ниже prdm1a в развитии RB. Анализ экспрессии показал, что т.к. neurogeninl также действует ниже prdm1a, то dlx гены и neurogeninl,по-видимому, не регулируют один др. Такая двойная потребность в dlx и neurogeninl может добавляться к регуляции, необходимой, чтобы специфицировать только RBs в NPB домене (see below ).
Хотя эти данные в комбинации подтверждают эпистатические взаимоотношения, мы не можем подтвердить линейный путь или направленные взаимодействия этих транскрипционных факторов, базируясь просто на паттернах экспрессии и экспериментах по восстановлению. Однако мы предсказываем, что существуют сложные взаимодействия между prdm1a, dlx3b, и neurogeninl,которые действуют клеточно автономно в одной и той же клетке, но также клеточно неавтономно между соседними клетками. Наши данные по экспрессии для prdm1a и dlx3b обнаруживают некоторое перекрывание в экспрессии во время ранней гаструляции. указывая тем самым, что они могут действовать клеточно автономно,т способствуя приобретению судьбы RB. В согласии с этим и предыдущие эксперименты, показавшие, что prdm1a необходим клеточно автономно для развития RB (Artinger et al., 1999). Однако мы также показали, что dlx3b/dlx4b необходимы клеточно неавтономно для формирования RB (Kaji and Artinger, 2004). Т.о., dlx3b может функционировать в соседнем с prdm1a домене, чтобы очистить регион, где могут формироваться RB нейроны. Для клеточно неавтономного сигнала, чтобы передать информацию соседним клеткам, д.быть необходим секретируемый фактор. Базируясь на нашей работе по Xenopus и на предварительных экспериментах на рыбках данио, сигнал скорее всего используется передачей сигналов BMP и остается только прямо это протестировать.
Ген neurogeninl, как было показано, действует клеточно автономно, чтобы нормализовать клетки нервного гребня, экспрессирующие foxd3 в отсутствие функционального mind bomb, ubiquitin лигазы, необходимой для передачи сигналов Notch (Cornell and Eisen, 2002). Скорее всего neurogeninl также действует клеточно автономно при развитии RB нейронов.
Однако возможно, что он действует также клеточно неавтономно. Мы знаем из наших результатов, что dlx3b/4b не может восстанавливать neurogeninl мутантов, подтверждая тем самым, что имеется расщепление в пути на этом уровне. Т.к. и neurogeninl и dlx3b могут оба восстанавливать развитие RB нейронов, то мы предположили, что dlx3b/dlx4b и neurogeninl независимо восстанавливают RBs, т.к. они способны независимо влиять на экспрессию neuroD. Дальнейшие эксперименты необходимы, чтобы увеличить наше понимание этих взаимоотношений.
RB Neurons Are Restricted to Forming Only at the NPB
Мы показали, что prdm1a необходим и достаточен для развития RB. Избыточная экспрессия prdm1a повышает количества RBs в спинном мозге (Hemander-Lagunas et al. 2005) и обнаруживается тенденция в отношении увеличения RBs раньше в домене NPB у более молодых эмбрионов. На обеих стадиях развития увеличение RBs было ограничено областью эмбриона, в которой они обычно обнаруживаются. Т.о., prdm1a может быть первичным механизмом, c помощью которого RB нейроны ограничиваются NPB доменом. Сходным образом избыточная экспрессия dlx3b/4b и восстановленные эмбрионы продуцируют RB нейроны в домене NPB. Однако избыточная экспрессия neurogeninl дает эктопические RBs как внутри границы нервной пластинки, так и в не нейральной эктодерме, указывая тем самым, что neurogeninl может превращать не-нейральную эктодерму в нейральную. Поскольку dlx и neurogeninl действуют ниже prdm1a,по-видимому, независимыми способами, то это может быть дополнительным механизмом, c помощью которого RBs специфицируются только в NPB домене.
Model for RB Gene Regulatory Network
Базируясь на этих и предыдущих данных мы предлагаем упрощенную временную эпистатическую модель для развития RBs в NPB (Fig. 9A). Во-первых, индукция судеб NPB нуждается в передаче сигналов DVH/ Эмбрионы рыбок данио с мутациями в сигнальном пути DVH обнаруживают отсутствие детерминации судеб RB нейронов и клеток нервного гребня, указывая , что они необходимы для индукции этих судеб. Кроме того, экспрессия prdm1a теряется в NPB, но не др. регионах эмбриона, указывая тем самым, что передача сигналов DVH действует выше prdm1a в NPB (Hernan-dez-Lagunas et al., 2005). Эта находка в комбинаии с данными на Xenopus показывает, что DVH4 может индуцировать RBs, подтверждая, что передача сигналов DVH вносит вклад в индукцию NPB, которая компетентна формировать клеточные судьбы NPB и экспрессировать prdm1a (Neave et al., 1997; Nguyen et al., 2000; Rossi et al.. 2008). Анализ эмбрионов с мутацией в prdm1a показал потребность в нем для RBs (Artinger et al., 1999; Hemandez-Lagunas et al., 2005), предыдущие эксперименты также выявили потребность в dlx3b и dlx4b в развитии RB. Данные представленные здесь показывают, что dlx3b и dlx4b действуют ниже prdm1a в спецификации RBs. Важно, что экспрессия bmp2b зависит функционально от dlx3b и dlx4b (Kaji and Artinger, 2004), подтверждая, что передача сигналов DVH может действовать на многих точках вдоль пути. Подобно генам dlx neurogeninl также действует ниже prdm1a в спецификации RB, но на пути, который,по-видимому, отличен от такового для dlx3b и dlx4b. Анализ экспрессии neuroD у мутантов prdm1a и dlx3b/dlx4b морфантов в комбинации с предыдущими сообщениями об их экспрессии у эмбрионов с потерей функции neurogeninl, подтверждая, что экспрессия neuroD может быть ступенью, на которой эти отдельные пути конвергируют в развитии RB.
Чтобы поместить эти данные в пограничный контекст развития RB, мы сконструировали схему классификации, которая начинает выявлять важных игроков в развитии RB в предполагаемые компоненты RB GRN. Кроме того, мы включили др. гены, которые, как было показано, необходимы для развития RB (Fig. 9B). Индукторы границы нервной пластинки включают Wnts, также как и DVH и мы считаем prdmla спецификатором , поскольку он экспрессируется в NPB и будучи мутантным обнаруживает эффект как в спецификации клеток нервного гребня, так и нейронов RB. Гены tfap2a/c (Li and Cornell, 2006), dlx3b/4b (this work and Kaji and Artinger, 2004), neuroD и neurogeninl (Cornell and Eisen, 2002),по-видимому, действуют как спецификаторы RB, т.к.они экспрессируются в RBs и потеря их функции ведет к дефектам в развитии RB, затрагивая или нет клетки нервного гребня.
Наконец, msxB, msxC, и msxE являются потенциальными эффекторами RB, которые необходимы ниже для инициальной спецификации дифференцировки нейрональных судеб RB (Phillips et al, 2006). Ген olig4, как было показано, является важным игроком в развитии RBs и клеток нервного гребня, но ещё необходимо определить согласуется ли это с моделью (Filippi et al., 2005). Т.к. это первая попытка выявления RB GRN, то эта схема классификации скорее всего будем модифицирована на базе будущих экспериментов. Дальнейшие исследования выявят взаимоотношения между молекулами, существенными для развития NPB и RB. Дальнейшие исследования смогут помочь лучше определить генетический каскад и выявить потенциал для петель обратной связи во время ранних стадий развития RB.
Данные представленные здесь вносят вклад, важный для нашего понимания о процессах клеточной спецификации RB сенсорных нейронов, которые находятся среди самых ранних механосенсорных нейронов, которые функционируют у эмбрионов. Упрощенная модель, которую мы представили для RB GRN, позволяет выдвигать гипотезы для проверки в последующих исследованиях становления судеб клеток границы нервного гребня.
Сайт создан в системе
uCoz 