RNAi скрининг по всему геному был осуществлен на культивируемых клетках^1-4 или путем повсеместного замалчивания генов у червей^5,6 или планарий⁷. Чтобы изучать сложные онтогенетические процессы, однако, гены необходимо инактивировать ткане-специфическим образом у интактных животных. Это становится возможным путем создания трансгенной RNAi библиотеки, захватывающей 88% Drosophila⁸ белок-кодирующих генов. Чтобы тестировать пригодность этого нового похода, мы сконцентрировались на пути Notch^9,10. Notch активируется за счет связывания со своими лигандами Delta или Serrate. После связывания лиганда, Notch расщепляется Presenilin и внутриклеточный домен действует в ядре как транскрипционный ко-активатор. Несколько важных Notch регуляторов идентифицированы благодаря их характерным фенотипам наружных сенсорных органов у Drosophila ^11,12. Взрослые сенсорные органы формируются в нотуме (дорсальной части торакса) во время личиночной и куколочной стадии развития Drosophila (Fig. la). Внутри группы эпителиальных клеток, наз. пронейральным кластером, одиночный sensory organ precursor (SOP) отбирается с помощью Notch-зависимого процесса, наз. латеральным ингибированием. Клетка SOP делится на pIIa и pIIb (Fig. la). В то время как pIIa формирует две наружные клетки (волосок и цоколь), pIIb дает апоптическую глиальную клетку и затем две внутренние клетки (нейрон и оболочку) органа. Во время каждого деления белковые детерминанты Numb и Neuralized расходятся в одну из двух дочерних клеток, где Numb ингибирует Notch рецептор, тогда как Neuralized активирует Notch лиганд Delta^10,13. Возникающие различия в передаче сигналов Notch предопределяют неодинаковые судьбы двух дочерних клеток. Т.о., Notch действует как при латеральном ингибировании, так и при asymmetric cell division (ACD) во время развития наружного сенсорного органа. Хотя стержневые компоненты пути Notch действуют в обоих процессах, др. компоненты действуют специфически во время латерального ингибирования (E(spl)¹⁴) или ACD (Numb¹⁵, Sanpodo^16,17).

Шпилечная конструкция в RNAi библиотеке экспрессируется под контролем UAS/GAL4¹⁸. Мы тестировали scabrous-GAL4^l8, pannier (pnr)-GAL4¹⁹ и fzIII-GAL4 (также известный как MS248-GAL4 или P{GawB}MS248)²⁰? используя набор из 40 RNAi линий с нарушением 21 гена. участвующих в развитии наружных сенсорных органов (Supplementary Table 1). Соотв., фенотипы были более сильными, а летальность более низкая с pnr-GAL4, и эта линия была отобрана для широко масштабного анализа. Всего из 20,262 скринированных трансгенных RNAi линий; предполагалось, что будут затронуты 11,619 из 14,139 белок-кодирующих генов (82.2%) in release 5.7 генома Drosophila²¹. По 10 мух каждой было проанализировано и фенотипические аномалии описаны в базе данных (http://bristlescreen.imba.oeaw.ac.at). Т.к. pnr-GAL4 экспрессируется только в центральном регионе нотума (Fig. lb), то латеральные области оставались неизменными и служили в качестве внутреннего контроля. Фенотипы были описаны, используя нормативную лексику (Fig. lb, Supplementary Table 2). Фенотипическое проявление (P_x) выражалось по шкале от 0 (не затронут) до 10 (полностью затронут), как фракция области экспрессии pnr-GAL4 (или фракция наружных сенсорных органов, присутствующих в данной области), которая имела соотв. фенотип. Фенотипы наружного сенсорного органа были классифицированы на 'добавочный' (Р_Gain). 'с потерями' (P_Loss), 'empty or multiple sockets' (P_Sockets)> 'hair cell duplication' (P_Duplication) and 'bristle morphology defects' (P_BMorph). Кроме того, дефекты ориентации были описаны как 'planar polarity defects' (P_poiarity). Морфологические дефекты нотума были классифицированы на 'notum malformation death' (P_MDeath; потеря ткани), 'notum malformation migration' (P_MMigration; thorax closure defects), 'overproliferation' (P_overprolif; notum enlargement) and 'colour' (P_colour). GO анализ терминов показал, что фенотипические группы достоверно обогащены генами, как известно. участвующими в соотв. процессах (Supplementary Table 3). Группа из 211 генов, для которых P_overprolif боле 0 содержит опухолевые супрессоры, такие как Pten и 5 из 7 членов пути Hippo, представленных в библиотеке. Группа из 71 гена с P_Polarity равно или более 4 содержит 4 из 6 стержневых компонентов planar cell polarity (PCP) и 4 др. PCP эффектора. Видимые фенотипы были оценены для 19.6% от всех RNAi линий (3,973 линий, 3,004 генов). Всего из 1,803 линий (8.9% от всех линий, 1,339 генов) были летальными, тогда как 496 lines (2.5% от всех линий, 475 генов) были полулетальными, не связанными с морфологическими дефектами. 65% линий (13,990 линий, 8,681 генов) не обнаруживали фенотипических отклонений (Fig. lc). Т.о., наш скрининг выявил потенциальные фенотипы потери функции в 21.2% (3,004 из 14,139) белок-кодирующих генах генома Drosophila, более половины из которых (1,597 генов, 2,067 линий) не были охарактеризованы ранее.

Чтобы определить величину ложно-негативных случаев, мы составили список генов, необходимых для передачи сигналов Notch и/или для ACD, исходя из Flybase и недавно опубликованной информации. 42 из отобранных 50 генов были представлены в RNAi библиотеке (Supplementary Table 4) и 24 давали ожидаемые фенотипы. 8 генов не были проанализированы из-за ранней летальности (6 генов) или сильных деформаций нотума (cdc2 и bre1). Возникающая в результате величина ложно-отрицательных случаев составляла 29.4% (10 из 34 генов) что хорошо согласуется с ранее описанными данными для трансгенных RNAi⁸. Длинные двунитчатые РНК шпильки, как известно, вызывают эффекты вне мишеней (off-target)²². Неспецифические фенотипы могут быть также генерированы за счет избыточной экспрессии генов вблизи мест инсерции трансгена. Мы поэтому получали вторую шпилечную конструкцию или получали вторичную RNAi линию из NIG-FLY stock centre для 73 генов (136 линий), которые давали видимые фенотипы (Supplementary Table 5). Сходные или идентичные фенотипы наблюдались для 63.0% генов (46 генов, 82 линии). Интересно, однако, что мы смогли подтвердить 88% (22 из 25 генов), чьи фенотипы были подтверждены более чем одной линией библиотеки, хотя большинство из этих линий были независимыми инсерциями одного и того же трансгена. Мы также отобрали 43 несущественных генов (72 линии) с известными взрослыми фенотипами (или отсутствием таковых; Supplementary Table 6). Для 93% из них (40 генов, 67 линий), наш скрининг идентифицировал корректный фенотип. В трех случаях наблюдаемые фенотипы были отличными от тех, что были описаны, но это может быть объяснено описанием клеточной функции (эндоцитоз для orange, Ras активность для Neurofibromin 1, и передача сигналов cAMP для dunce), когда RNAi вызывала фенотипы более сильные, чем описанные аллели. Во всяком случае, эти данные показывают, что величина ложно-позитивных случаев при нашем скрининге менее 7%.

Notch действует дважды во время развития наружных сенсорных органов²³. Во время латеральной ингибиции потеря или избыточность передачи сигналов Notch увеличивает или снижает количество наружных сенсорных органов, соотв. Во время ACD, усиление передачи сигналов Notch вызывает удвоение волосков или множественные цоколи, тогда как снижение передачи сигналов Notch заставляет все дочерние клетки принимать внутреннюю судьбу и приводит к кажущемуся отсутствию наружных сенсорных органов. Т.о., Notch регуляторы могут быть отнесены к категориям loss, gain, socket и duplication. Мы поэтому использовали фенотипы генов, как известно, вовлеченных, в передачу сигналов Notch и ACD (data not shown), чтобы получить компаундные категории, которые бы включали все или большинство из этих позитивно-контролируемых генов. Категория asymmetric cell division (ACD) (P_Loss равно или более 7 или P_Duplication >0 или P_Sockets >0) составляла до 226 генов (262 линий) и включала bora, bazooka, Delta, musashi, Notch, numb, Presenilin, sanpodo, tramtrack и twins. Категория латерального ингибирования включала все гены, для которых P_Loss >7. Кроме того, мы повторно скринировали все картинки генов, где P_Gain >0 и сохранили только те, где добавочные внешние сенсорные органы были сгруппированы вместе, указывая тем самым га множественность SOP клеток из одного пронейрального кластера. Возникающая в результате категория латерального ингибирования содержит 233 генов (264 линий). Анализ всех генов в этих категориях показал (Supplementary Table 3), что GO термины 'asymmetric cell division' и 'nervous system development' достаточно часты в ACD категории. Категория латеральной ингибиции избыточно представлена GO терминами 'neurogenesis', 'Notch signalling pathway' и 'cell fate commitment'. Мы поэтому использовали эти категории в различных вторичных подходах для идентификации генов. действующих глобально в пути Notch или более специфически во время ACD.

Dj время развития крыльев потер функции Notch ведет к появлению вырезок на крыльях или образованию более широких крыловых жилок²⁴. Чтобы идентифицировать генеральные Notch регуляторы, мы экспрессировали RNAi шпильки в крыловых имагинальных дисках для 201 гена (226 линий) в категории 'lateral inhibition'. Анализировали по 10 мух в отношении крыловых жилок и фенотипа края крыла (Fig. 2, Supplementary Fig. 1 and Supplementary Table 7). Все др. аномалии крыльев также регистрировались и подразделялись на фенотипические классы (Supplementary Fig. 2). В дополнение к 7 известным членам пути Notch (Notch, mind bomb 1, Delta, groucho, extra macrochaetae, Presenilin and O-fucosyltransferase 1 (O-fut1)), этот вторичный анализ идентифицировал 23 гена, об участии которых в передаче сигналов Notch не было известно.

Передача сигналов Notch активирует транскрипционный фактор Suppressor of Hairless (Su(H)). Идентифицированные гены д. участвовать в каскаде сигнальной трансдукции, действуя параллельно с Su(H) или действуя как мишени для Su(H). Чтобы выяснить это мы использовали lacZ репортер для активности Su(H)²⁵ (Supplementary Table 7). В развивающихся крыловых дисках этот репортер экспрессируется вдоль границы дорсо-вентральных компартментов (Fig. 2c). Когда мы инактивировали потенциальные Notch регуляторы вдоль границы передне-заднего компартментов, используя patched (ptc)-GAL4, то 8 генов (11линий) вызывали потерю P-galactosidase окрашивания в области, где границы перекрываются (Fig. 2d-k). Помимо самого Notch и известных Notch регуляторов mind bomb 1 и O-fut1, идентифицировано 5 генов, которые действуют выше Su(H)-обусловленной активации транскрипции.

Передача сигналов Notch тесно связана с эндоцитотическим трафиком¹³. Интересно, что один из вновь идентифицированных Notch регуляторов (CG5608) является гомологом VAC14 , гена дрожжей, который контролирует перенос мультивезикулярных тел²⁶. Vac14 является вышестоящим активатором PtdIns(3)P 5-киназы Fab1 (известной также как PIKfyve)²⁶. Хотя функция Drosophila CG5608 не была проанализирована, но Notch накапливается с Delta во внутриклеточных пузырьках в мутантных fab1 клетках Drosophila²⁷. Дальнейший анализ CG5608 RNAi фенотипа может помочь понять связь между синтезом phosphoinositide и передачей сигналов Notch. Это особенно интересно. т.к. потеря Vac14 ведет к нейродегенерации у мышей²⁸, и многие линии доказательств связывают путь Notch с нейродегенерацией²⁹.

Потеря наружных сенсорных органов может вызываться или за счет усиления передачи сигналов Notch во время латерального ингибирования или за счет передачи сигналов Notch во время ACD²³ (Fig. 3a). Чтобы разрешить это затруднение мы исследовали присутствие клеток SOP с помощью экспрессии green fluorescent protein (GFP) fс промотора phyllopod (phyl) (Fig. 3b). Ген phyl экспрессируется в пронейральном кластере и затем ограничивается SOP³⁰. GFP был слит с доменом асимметричной локализации Partner of numb (Pon) , так что конструкция может быть использована для анализа асимметричной сегрегации белка. Мы анализировали, по крайней мере, по 3 куколки для каждого из 80 генов (91 линии) в категории ACD (Fig. 3b, Supplementary Fig. 3 and Supplementary Table 8). 33 гена (33 линии) вызывали полную потерю SOPs внутри домена экспрессии pnr, тогда как 6 genes (8 линий) вызывали частичную потерю SOP. 8 генов (13 линий) увеличивали количество SOP, указывая, что они необходимы для латерального ингибирования. Важно, что 7 из этих генов были тестированы с MS1096-GAL4 (также известным как P{GawB}Bx^MS1096) и 5 вызывали фенотип потери функции Notch в крыльях (Supplementary Table 7), демонстрируя, что они являются генеральными регуляторами передачи сигналов Notch. Наконец. мы идентифицировали 28 генов (31 линия), которые могут играть роль в ACD, т.к. количество SOP было нормальным, но не образовывались дифференцированные наружные сенсорные органы.

Чтобы различить трансформации судеб клеток от дефектов дифференцировки, мы проанализировали 23 из этих генов (26 линий) , используя маркеры, специфичные для типов клеток (Fig. 3c and Supplementary Table 9). Четкие трансформации наружных клеток во внутренние наблюдалось для 6 генов (6 линий), тогда как др. обнаруживали или нормальной образование клонов или аномалии, которые не могут быть объяснены изменениями судеб клеток. Всё это вместе с 128 дополнительными генами (146 линий), для которых потеря функции вызывала caused P_Sockets >0 или P_Duplication >0? мы идентифицировали 134 регулятора ACD.

Один из них capricious (caps), трансмембранный белок, участвующий во внеклеточных взаимодействиях во время образования границ компартментов^31,32 и нейронального targeting³³. В ответ на caps RNAi, клетки SOP генерировали две pIIb клетки, фенотип. обычно наблюдаемый для генов, участвующих в активации Notch (Fig. 3c). В самом деле, caps^c18fs мутантные клоны обнаруживают фенотипы, указывающие на потерю передачи сигналов Notch (Supplementary Fig. 4), указывая тем самым, что Caps может участвовать в генерации клеточной адгезии между сигнал-посылающими и -воспринимающими клетками во время передачи сигналов Notch/Delta.

Гены или белки в сигнальном пути часто взаимодействуют генетически или физически. Было сделано несколько попыток картировать такие взаимодействия на уровне всего генома^34-36, но это не позволило сделать функциональную оценку. Чтобы создать функционально действующую карту передачи сигналов Notch, мы сначала скомбинировали все гены в категории 'lateral inhibition' или 'asymmetric cell division' и добавили гены, уже участвующие в передаче сигналов Notch, которые не выглядели позитивными в нашем скрининге. Для каждого гена мы выискивали данные по дрожжевым двугибридным, генетическим, биохимическим и др. взаимодействиям из разных баз данных (see Methods). Мы сохраняли только взаимодействия с партнерами, содержащимися также в нашем наборе кандидатов и удаляли все гены без партнеров по взаимодействию. Полученная в результате генетическая сеть (http://bristlescreen.imba.oeaw.ac.at) включала 780 взаимодействий между 177 генами, только 42 из которых ранее были известны, как действующими в сигнальном пути Notch во время развития нарушенных сенсорных органов (Fig. 4 and Supplementary Fig. 5).

Чтобы идентифицировать предполагаемые комплексы, мы использовали Molecular Complex Detection (MCODE) и нашли 9 кластеров из высоко взаимосвязанных узлов (Fig. 4). В сетях межбелковых взаимодействий, такие кластеры представляю белковые комплексы и/или генетические пути. Один комплекс центрирован на Notch и Delta. Он включает Notch-модифицирующие энзимы, такие как O-fucosyltransferase и белки Notch сигнального пути, такие как Presenilin комплекс и ядерный белок Hairless. Он также включает guanine nucleotide exchange factor, белок Trio, который, как было показано, взаимодействует с Notch³⁷, но не был до этого функционально связан с передачей сигналов Notch. Второй комплекс включает известные ACD регуляторы G-oα47A, Rapsynoid (также известный как Pins) и Bazooka. Т.о., сетевой анализ генетических данных может успешно предсказывать пути, которые обеспечивают даже сложные многоклеточные процессы.

Чтобы оценить возможность прогнозирования нашей сети, мы тестировали комплексы, в которых большинство членов до этого не было известно, как участвующие в регуляции передачи сигналов Notch. Комплекс 9 содержит contains the importin α protein Karyopherin α3 (Kap-α3) , а такжеe importin α export receptor Cas (Fig. 5a). Cas мутанты, как было показано ранее, вызывают дефекты ACD³⁸. В мутантных клонах Kap-α3 (Fig. 5b, c) мы наблюдали сильно проявляющиеся трансформации судеб клеток, сходные с таковыми Cas. Соседние гены по отношению к комплексу 9 включают компоненты ядерных пор Nup358 и Nup50 (CG2158) (Fig. 5a). Во всех случаях RNAi вызывает трансформации клеточных судеб, характерные для повышенной активности Notch, указывающие на то, что ядерный импорт ингибирующих компонентов является скорость лимитирующим для Notch пути. Такой компонент был постулирован ранее³⁸, а идентификация критического importin-α может облегчить его биохимическую идентификацию. Поскольку Kap-α3-Cas комплекс также содержит ядерный Lamin (Fig. 5a), то наши данные могут предоставить объяснение некоторых аспектов laminopathies. Интересно, что нарушение регуляции передачи сигналов Notch, как предполагалось ранее, критически вовлечено в некоторые laminopathies, исходя из фенотипа их стволовых клеток³⁹.

Предполагаемый комплекс 5 (Fig. 5d) содержит субъединицы COP9 signallosome (CSN). RNAi 6 из 7 субъединиц CSN приводили к случайной генерации двух pIIa клеток (1 равно или более Р_Duplication равно или менее 3), что согласуется с ингибирующей функцией пути Notch (Fig. 5e, f and Supplementary Fig. 6). Фенотипы, также наблюдались в митотических мутантных клонах clones по CSN4 или CSN5 (Fig. 5g, h). CSN это isopeptidase, которая удаляет Nedd8 конъюгаты с Cullin-RING класса E3 ubiquitin лигаз и предупреждает их деградацию⁴⁰. В самом деле дефекты латерального ингибирования также наблюдаются у Cullin-3 (gft)мутантов⁴¹ , указывая тем самым, что Cullin-3 может иметь отношение к нахождению CSN во время передачи сигналов Notch.

Our data show that genome-wide loss-of-function analysis by RNAi can be used to study complex developmental processes. From a comprehensive phenotypic database we extracted genes involved in Notch signalling by secondary screening or integration with other types of genome-wide analysis. Vacl4 may regulate PtdIns(3,5)P2 synthesis and trafficking of Notch or its ligand Delta into multivesicular bodies. Kap-rx3 is a cargo for Cas and might control the nuclear import of a rate limiting inhibitory signalling component. Finally, the COP9 signallosome regulates Cullin-1 (linl9) and Cullin-3 (ref. 42), which in turn could regulate ubiquitylation of Notch or essential Notch pathway members. We describe an additional 23 uncharacterized genes and 5 putative protein complexes for which the mechanistic connection to Notch signalling is less clear. Most of those act downstream or in parallel to Su(H). So far, only a few functionally important nuclear targets of Notch have been identified. Our analysis could considerably expand the list of nuclear Notch targets and provide insight into how Notch regulates the various cell fate and morphology decisions in which it has been implicated.

In addition, we report a wide range of morphological phenotypes that can be used to derive groups of genes potentially involved in planar polarity, proliferation control, cell migration and apoptosis. The possibility to perform secondary screens on those groups illustrates the enormous power of transgenic RNAi now available to study development on a genome-wide level.