Olfactory sensory neurons (OSNs) экспрессируют по одному из 1,000 генов обонятельных рецепторов (Chess et al., 1994; Malnic et al., 1999; Rawson et al., 2000). Те, которые экспрессируют один и тот же рецептор распределены широко по обонятельному эпителию (OE), хотя они могут быть ограничены широко определяемыми зонами (Ressler et al., 1993; Vassar et al., 1993). Несмотря на их относительно широкое распределение, их аксоны конвергируют в один и тот же гломерул обонятельной луковицы (OB; Ressler et al., 1994; Vassar et al.. 1994: Mombaerts et al., 1996). Несколько линий доказательств подтверждают мнение, что обонятельные рецепторы играют инструктивную роль в конвергенции аксонов и их доставке (Mombaerts, 1996; Wang et al., 1998; Gogps et al., 2000). Достигнув гломерулы, аксоны д.вступать, ветвиться, находить синаптические сайты и прекращать рост (Halasz and Greer, 1993; Klenoff and Greer, 1998; Kasowski et al., 1999). Вполне возможно, что эти последние ступени созревания OSN регулируются с помощью механизмов, отличающихся от тех, которые регулируют конвергенцию и наведение аксонов.

Ветвление кончиков аксонов является первой ступенью формирования паттерна синапсов в большинстве развивающихся нейральных путей. В некоторых системах нейротрофины, как было установлено, способствуют ветвлению аксонов в регионах мишеней. Напр., nerve growth factor (NGF) регулирует ответвление латералей кожных сенсорных нервов в коже (Diamond et al., 1992), а в зрительной системе Xenopus brain-derived neurotrophic factor (BDNF) стимулирует обширное ветвление оптического нерва в optic tectum (Cohen-Cory and Fraser, 1995). Недавно идентифицированный ген slit2 участвует в обеспечении ветвления аксонов in vitro и может служить в качестве позитивного регулятора для интерстициального ветвления аксонов спинальных сенсорных нейронов in vivo (Wang et al., 1999).

В данном исследовании изучали эффекты Sonic hedgehog (Shh) как регулятора вступления аксонов в гломерулы и ветвления аксонов. Shh выполняет несколько важных ролей во многих аспектах нейрального развития позвоночных (Goodrich and Scott, 1998; Marti and Bovolenta, 2002; Sanchez-Cama-cho and Bovolenta, 2008). Он секретирует сигнальную молекулу, генерируемую с помощью аутопротеолитического расщепления белка предшественника и модифицируемую с помощью cholesterol группы на активном N-терминальном пептиде (Shh-N; Porter et al.. 1995). Shh, как известно, регулирует поведение клеток ретинального ганглия ростовых конусов и , следовательно, играет важную роль в формировании паттерна нейрональных соединений в зрительной системе (Trousse et al., 2001; Sanchez-Camacho and Bovolenta, 2008).

Здесь мы предоставили in vivo и in vitro доказательства. что Shh может участвовать в двух аспектах развития аксонов OSN: регуляции вступления аксонов в гломерулы и ветвлении OSN аксонов после их вступления. Пространственный и временной паттерны экспрессии shh указывают на то, что дендриты OB mitral и tufted клеток участвуют в разрешении OSN аксонам вступать в гломерулы и ветвиться в областях мишенях. Нейтрализация функции Shh предупреждает аксоны от вступления в гломерулы и от ветвления.

Вполне возможно, что аксоны обонятельных нейронов реагируют на сигналы Shh способом, противоположным тому, что наблюдается в ганглиолярных клетках сетчатки.

Образование гломерул изучено у беспозвоночных и позвоночных, но некоторые из молекулярных сигналов, участвующих в этом процессе, неясны. Большинство исследователей сравнивает образование гломерул как инициируемое взаимодействием между аксонами OSN и OB (Oland et al., 1988: Valverde et al., 1992; Oland and Tolbert, 1998; Bailey et al., 1999; Treloar et al., 1999). Морфологические изменения во время инициации гломерул исследованы в деталях у крыс. Согласно сообщениям Treloar et al. (1999) и Bailey et al. (1999), OSN аксоны сначала сливаются в protoglomeruli на ст. E19. Присутствие глиальных клеток необходимо при раннем образовании гломерул (Oland et al., 1988). Протогломерулы развиваются в зрелые гломерулы во время ранней постнатальной жизни у грызунов. Образование гломерул может следовать ростро-каудальному градиенту внутри OB. В наших экспериментах временная и пространственная экспрессия Shh коррелирует с этой возможной онтогенетической последовательностью образования гломерул. Многие типы клеток участвуют в образовании гломерул во время постнатального развития (Bailey et al., 1999; Treloar et al., 1999; Blan-chart et al., 2006). Хотя Shh-N пептид регулирует поведение роста аксонов OSN in vitro, но блокирование функции Shh на 5-й день после рождения, по-видимому, не меняет размера гломерул в обонятельных луковицах. Во время постнатального развития помимо врастания аксонов OSN, происходят одновременно и некоторые др. онтогенетические события. Сюда входят разветвления окончаний обонятельных аксонов, врастание незрелых аксонов обонятельных нейронов, созревание иннервированных обонятельных аксонов (из GAP43-позитивных в OMP-позитивные), врастание дендритов periglomerular нейронов и образование митральными клетками дендритных пучков внутри гломерул (Halasz and Greer, 1993: Malun and Brunjes, 1996; Klenoff and Greer, 1998; Lee et al., 2008). Следовательно, кратковременное снижение врастания GAP43-позитивных аксонов может необязательно изменять размеры существующих гломерул. Разумно предположить, что если функция Shh блокирована в течение более длительного периода времени, то размеры гломерул могут быть изменены.

Mitral и tufted клетки не рассматриваются как существенные для инициации образования гломерул. У моли, напр., не наблюдается очевидного нарушения в инициации образования гломерул, если mitral-подобные клетки удаляли хирургически во время развития (Oland and Tolbert, 1998). Это, по-видимому, верно и для млекопитающих. У Tbr-1 нокаутных мышей mitral и tufted не способны развиваться в OB. Но даже в отсутствие mitral и tufted клеток обонятельные аксоны, экспрессирующие один и тот же обонятельный рецептор способны конвергировать и вступать в луковицу в свои "соответствующие" позиции (Bulfone et al., 1998). Хотя эти исследования предоставляют доказательства, что mitral и tufted клетки несущественны для инициации конвергенции OSN аксонов и образования протогломерул, они не исключают возможности, что mitral/tufted клетки играют роль по обеспечению распознавания мишеней и иницииации образования синапсов.

Mitral и tufted клетки экспрессируют semaphorin ЗА (Sema ЗА), который как было показано обладает chemorepellent функцией (т.e., он ингибирует удлинение аксонов и вызывает коллапс ростовых конусов; Giger et al., 1998). Рецептор Sema ЗА, neuropilin-1, экспрессируется первичными обонятельными нейронами (Kawamaki et al., 1996). Kobayashi et al. (1997) проделали эксперименты in vitro, чтобы продемонстрировать, что OSN аксоны кур прекращают рост (collapse), когда Sema ЗА присутствует в культуре. Эти находки строго подтверждают мнение, что mitral/ tufted клетки участвуют в воздействии на поведение роста аксонов OSN в OB.

Это исследование предоставило доказательства, что Shh является частью молекулярного комплекса, который регулирует рост OSN аксонов в гломерулах. Если функция Shh блокирована на ст. между P0 и P5, то наблюдается тяжело нарушенное врастание незрелых обонятельных аксонов в гломерулы. Между PO и P5, обонятельные аксоны разных стадий созревания обычно обнаруживаются в гломерулах. Некоторые д. вступать в гломерулы будучи готовыми или уже в основном зрелые (т.e., они вступили в гломерулы до PO и прекратили свой рост); они д. быть OMP-позитивными и GAP43-негативными. Аксоны от недавно сгенерированных нейронов должны сразу же вступать в гломерулы и д. быть ещё GAP43-позитивными и OMP-негативными. А некоторые от ещё более недавно сгенерированных нейронов всё ещё д. расти в направлении своих гломерул мишеней и д. быть GAP43-позитивными и OMP-негативными. Эта находка, что ингибирование функции Shh ведет к накоплению незрелых аксонов OSN в слое нервов и к снижению количества терминальных веточек аксонов OSN в гломерулах, вместе с нашим знанием об экспрессии рост ингибирующих молекул, всё это говорит об участии Shh в обеспечении вступления аксонов в гломерулы или непосредственно или косвенно путем устранения ингибирования репеллента.

Помимо Sema ЗА и Shh, некоторые др. молекулы могут участвовать врегуляции роста и формировании синапсов в OB. Напр., некоторые могут действовать, предупреждая рост аксонов OSN вне слоя гломерул (Gonzalez and Silver, 1994; Kaf-itz and Greer, 1998). Эти рост регулирующие сигналы могут продуцироваться mitral/tufted клетками, juxtaglomerular нейронами и/или глиальными клетками. Вступление аксонов в гломерулы и ветвление может использовать сложную интеграцию как позитивных, так и негативных сигналов. Наши исследования указывают на то, что Shh может служить как один из сигналов в этом процессе.

Характерное поведение OSN аксонов, когда они вступают в гломерулы это образование веточек. Мишенями продуцируемые факторы играют важную роль в ветвлении аксонов и терминальной arborization во многих системах (Diamond et al., 1992; Cohen-Cory and Fraser, 1995; Wang et al., 1999). Наши in vitro доказательства подтверждают мнение, что Shh является одним из сигналов. участвующих в ветвлении аксонов OSN. Когда OSNs обрабатывались Shh-N in vitro, то наблюдалось достоверное увеличение числа точек ветвления аксонов. Пока неясно, почему OSN аксоны неспособны вступать в гломерулы, когда блокирована функция Shh. Вполне возможно, что Shh обеспечивает общее распознавание сигнала от мишени, чтобы помочь OSN аксонам иннервировать область гломерул. Возможно, что Shh служит в качестве сигнала. способствующего росту аксонов OSN. Мы наблюдали незначительное увеличение удлинения аксонов OSN, когда пептид Shh добавлялся in vitro. Следовательно, остановка незрелых OSN аксонов в нервном слое может быть обусловлена нарушением деликатного баланса между ингибирующими и способствующими сигналами в гломерулах для OSN аксонов. Если один из способствующих сигналов отсутствует, то создаются условия, негативные для роста, и OSN аксоны остаются в нервном слое.