Во время эмбриогенеза тонкий пространственный и временной контроль генной экспрессии достигается благодаря функциональным сетям взаимодействия семейств транскрипционных факторов. Напр., Drosophila генетики установили качественные особенности транскрипционных факторов, необходимых для спецификации кардиальных предшественников, формирования примордиальной сердечной трубки и завершения образования функционального дорсального сосуда, аналогичного сердцу позвоночных (Tao and Schulz, 2007). Гомологичные гены были идентифицированы у позвоночных; напр., GATA и TBOX семейства транскрипционных факторов, которые как известно, выполняют разнообразные функции во время кардиогенеза (Olson, 2006). Т.о., gata4, gata5, gata6, tbx5, и tbx20 участвуют у животных моделей в транскрипционных программах, контролирующих спецификацию кардиальных клеток, петлеобразование сердечной трубки, формирование камер, дифференцировку и генез клапанов (Brown et al., 2005; Holtzinger and Evans, 2005, 2007; Plageman and Yutzey, 2004). Эти гены необходимы для нормального кардиогенеза и у человека, поскольку специфические мутации в TBX5, TBX20 или GATA4, напр., ассоциируют с определенными синдромами у людей и врожденными дефектами сердца (Basson et al., 1997; Garg et al., 2003; Kirk et al., 2007; Li et al., 1997).
Прогресс в понимании генетической иерархии среди этих генов стал необходим для систем позвоночных, поскольку примордиальные гены подвергаются экспансии в семейства, представленные близко родственными сестринскими генами, кодирующими белки с перекрывающимися паттернами экспрессии, по крайней мере частично, вызывая функциональную компенсацию и сходным образом ДНК и белок-связывающие активности. Три гена, gata4, gata5 и gata6 участвуют в регуляции развития сердца и кишечника (Peter-kin et al., 2005), тогда как ряд TBOX генов потенциально регулирует различные аспекты кардиогенеза даже более экстенсивно (Naiche et al., 2005). Анализ потери функции у рыбок данио показал, что gata4 не нужен для спецификации или дифференцировки кардиомиоцитов. Скорее эмбрионы, истощенные по белку Gata4 , имеют дефекты петлеобразования сердечной трубки спустя 48 ч post-fertilization (hpf) и дают тяжелый "heartstring" фенотип спустя 5 days post-fertilization (dpf), помимо дефектов тканей кишки, производных энтодермы (Holtzinger and Evans, 2005). Сходные фенотипы, результат сравнительно поздних морфогенетических аномалий скорее, чем дефекты в ранней спецификации или дифференцировке, описаны при потере TBOX факторов, включаяTbx5 или Tbx20 (Garr-ity et al., 2002; Szeto et aL, 2002). Предполагается. что белки существенны для более ранних онтогенетических функций, но что это маскируется в исследованиях потери функции за счет компенсации родственными генами и это было подтверждено, по крайней мере, для GATA факторов у рыбок данио (Holtzinger and Evans, 2007; Peterkin et aL, 2007) и мышей (Zhao et al., 2008).
Др. набор транскрипционных факторов, кодируемых с помощью семейства MYC/MAX, регулирует генетические программы, связанные с пролиферацией и клеточным циклом, а также с выживанием и апоптозом (Meyer and Penn, 2008). Они также имеют отношение к болезням, поскольку c-MYC, напр., избыточно экспрессируется в широком разнообразии раковых опухолей человека (Adhikary and Eilers, 2005). MYC и MAX димеризуются посредством своих basic region/helix loop helix/leucine zipper (bHLHzip) доменов и активируют транскрипцию нижестоящих генов путем соединения с консенсусом E-box элементов на ДНК (Blackwood and Eisenman, 1991), тогда как MAD или MXI димеризация с MAX ведет к репрессии нижестоящих генов мишеней или за счет потери MYC-зависимого партнера или за счет связывания, E-box элементов (Ayer and Eisenman, 1993).
MGA (MAX-gene-associated) является транскрипционным фактором, который принадлежит как к TBOX, так и MYC семействам, кодируя как Tbox, так и Myc-подобный bHLHzip домен. Мышиный MGA белок был первоначально идентифицирован в двугибридных экспериментах как партнер связывания MAX, и крупный Mga, как было установлено, кодирует белок в 3,006 аминокислот (Hurlin et al., 1999). MGA связывает E-box последовательности MAX-зависимым способом и T-box последовательности MAX-независимым способом; метод репортера подтвердил способность MGA регулировать транскрипцию с промоторов, содержащих или T-box или E-box сайты связывания. Это исследование также показало, что уровни MAX предопределяют, будет ли MGA функционировать как активатор или репрессор. Кроме того, усиление экспрессии MGA ингибирует образование фокусов фибробластами, трансфицированными Мус и Ras, это позволяет предположить, что MGA может действовать как супрессор опухолей (Hurlin et al., 1999). Фенотип потери функции для Mga не описан.
Благодаря своим особым структурным свойствам, MGA является кандидатом на роль интегрирующей регуляции программ жизнеспособности, пролиферации и дифференцировки клеток, исходя из его способности функционировать посредством TBOX- и MYC-управляемых путей транскрипции. GATA факторы также могут функционировать в контексте MYC регуляторных сетей (Rylski et aL, 2003). Более того, ранее мы идентифицировали кардиальный энхансер для гена
gata4, который содержит сайт связывания для белков семейств генов TBOX и MYC (Heicklen-Klein and Evans, 2004). Поэтому мы исследовали, существуют ли функциональные взаимоотношения между MGA, TBOX или GATA факторами, используя рыбок данио, учитывая преимущества метода потери функции и способность осуществления эпистатического анализа. Здесь представлена первая характеристика гена
mga не млекопитающих и описан его фенотип потери функции. Мы показали, что
mga необходим для развития органов, производных сердца и кишки и что он функционирует, чтобы регулировать субнабор ранних мезэнтодермальных маркеров, включая tbx6, и чтобы предопределять соотв. уровни Gata4, необходимые для петлеобразования первичной сердечной трубки.
DISCUSSION
Наше исследование показало, что TBOX транскрипционный фактор mga важен для эмбриогенеза рыбок данио и регулирует нормальное развитие головного мозга, сердца кишечника, что согласуется с его обычным паттерном экспрессии. Мы полагаем, что наш подход успешно выявил транскрипт mga, поскольку множественные morpholinos из разных последовательностей дают одинаковый фенотип. Единственным ограничением подхода является то, что morpholinos истощают белок Mga с самых ранних стадий развития. Т.к. mga экспрессируется матерински и транскрипты экспрессируются широко во время раннего развития, то некоторые или все аспекты morphant фенотипа могут быть обусловлены относительно косвенными эффектами дерегуляции ранних паттерн-формирующих программ. Однако наши наблюдения подтвердили, что mga действует по-разному в разных системах органов, это может отражать уникальную структурную характеристику белка с потенциалом взаимодействия как с TBOX- , так и MYC-управляемыми программами.
Функция mga в развитии головного мозга, по-видимому, связана с жизнеспособностью клеток. Морфогенез головного мозга нарушен у morphant эмбрионов и это коррелирует с распространенным p53-зависимым апоптозом. Фенотип дегенерации головного мозга может быть вызван off-target эффектами, которые были обнаружены при использовании некоторых morpholinos (Robu et aL, 2007). Однако по некоторым причинам мы верим, что это может отражать нормальную функцию mga. Во-первых, паттерн апоптоза в точности совпадает с нормальным паттерном экспрессии транскриптов mga в развивающемся головном мозге. Во-вторых, тот же самый фенотип воспроизводится с использованием трех morpholinos с отличающимися последовательностями, нацеленными или на трансляцию или сплайсинг и не наблюдается при использовании не подходящих др. к др. контрольных morpholino. В-третьих, мы не выявили увеличения экспрессии N-терминально укороченной p53 изоформы, которая, как было показано, ассоциирует с off-target эффектами (данные не показаны). Наконец, фенотип может быть нормализован с помощью ко-инъекции gata4 morpholino. Это указывает на то, что апоптоз, вызываемый в головном мозге посредством супрессии mga-регулируемой программы, которая обычно ограничивает gata4. Формальная проверка этой гипотезы нуждается в экспериментах по восстановлению РНК, которые особенно затруднительны для этого очень большого гена.
Эффект истощения Mga в кишечнике и сердце не связан с апоптозом. Функция mga в органах, произошедших из кишки, скорее всего, обусловлена ранними дефектами энтодермы, поскольку обнаруживается соотв. неспособность у морфантов на ст. 48 hpf поддерживать удлинение желточно-кишечного протока. Интересно, что этот признак фенокопирует gata4 морфантов. Мы не определяли ни обычные изменения в уровнях транскриптов gata4 в первичной кишечной трубке mga морфантов, ни устранения дефектов желточно-кишечного протока при истощении gata4. Это указывает на то, что mga и gata4 функционируют в органогенезе ранней кишки и что mga не является негативным регулятором гена gata4 в этом контексте. Напротив, по крайней мере, некоторые аспекты в кардиального фенотипа могут быть приписаны потере нормального контроля за уровнями gata4. С помощью уменьшения избытка Gata4, дефект раннего петлеобразования сердца может быть устранен у mga морфантов. Неясно, функционирует ли Mga белок непосредственно на gata4 регуляторных элементах, хотя и TBOX- и E-BOX-связывающие сайты присутствуют а известном gata4 кардиальном регуляторном элементе (Heickl en-Klein and Evans, 2004). Mga может действовать непрямо, регулируя функцию др. TBOX белков, поскольку некоторые ко-экспрессируются с gata4 в развивающемся эмбрионе.
Анализ микромассивов показал значительное увеличение транскриптов для lefty2r, негативного регулятора передачи сигналов nodal. Это было оценено с помощью qPCR данных, которые показали, что на ст. 12 сомитов уровни транскриптов lefty2 в 30-раз увеличены по сравнению с контролем (not shown). Однако мы не смогли найти строгие доказательства, что передача сигналов nodal сильно нарушена у mga морфантов, поскольку многие известные гены мишени для nodal не меняли своей экспрессии. Скорее субнабор ключевых регуляторов для развития мезэнтодермы разрегулирован, включая sox17, cas и tbx6. Эти ранние альтерации могут приводить к последующим изменениям в уровнях gata4 и к дефектам энтодермы. Интересно, что tbx6, помимо взаимодействия генетически с mga, также является TBOX белком наиболее тесно связанным эволюционно с mga (Lardelli, 2003).
Итак, mga необходим для нормального органогенеза и функции GATA/TBOX регуляторной сети. Фенотипы органов при потере функции mga и gata4 удивительно сходны, истощение mga ведет к увеличению уровней транскриптов gata4. Это указывает на то, что истощение или избыточная экспрессия Gata4 дает сходные фенотипы. Это известная характеристика TBOX белков (Zweier et al., 2007), но ранее её не связывали с GATA факторами. Необходимо непосредственное тестирование способа нахождения gata4 особенно в домене экспрессии mga. Дополнительным признаком является потенциал mga интегрировать, помимо прочего, регуляторные программы MYC пути, связывая тем самым программы жизнеспособности клеток, пролиферации и дифференцировки. Мы измеряли повышенные уровни транскриптов для некоторых членов семейства MYC у mga морфантов, хотя предварительные попытки устранить фенотип с помощью истощения MAX (тем самым в принципе снижение активности MYC) оказались безуспешными (data not shown). Однако, MGA был обнаружен в мультимерных белковых комплексах, которые включают MAX, E2F-6, DP-1, HP17 и YAF2, а также гистоновые methyltransferases, указывая, что функция MGA связана со многими сигнальными путями (Ogawa et al., 2002). В отношении жизнеспособности клеток, интересно, что MGA и YAF2 обнаруживаются в co-complex, поскольку семейство RYBP/YAF2 белков, как было установлено, кодирует про-апоптические функции. У рыбок данио, yaf2 ингибирует caspase 8-обеспечиваемый апоптоз (Stanton et al., 2006). Будущие структурно-функциональные исследования позволят установить, действует ли mga в самостоятельно или перекрывающихся программах, ассоциированных с TBOX- и MYC-регулируемыми путями.
Сайт создан в системе
uCoz 