После активации с помощью вышестоящих агонистов (активаторов) phosphoinositide 3-kinases (PI3Ks) генерирует phosphatidylinositol-3,4,5-trisphosphate (PtdIns(3,4,5)P3), PtdIns-3,4-bisphosphate (PtdIns(3,4)P2)
и PtdIns-3-phosphate (PtdIns3P) из их липидных субстратов, которые взаимодействуют с липид связывающими доменами в PI3K эффекторных белках, изменяя их локализацию и/или активность. PtdIns(3,5)P2, четвертый вид 3-phosphoinositide обнаруженный в клетках, генерируется с помощью 5-phosphorylation PtdIns3P с помощью FYVE finger-containing phosphoinositide kinase (PIKfyve; также известной как FAB1) и взаимодействует с PROPPIN (β-propeller that bind phosphoinositide species) доменом165, 166, который обнаружен в 4-х белках млекопитающих с WD40 repeat protein interacting with phosphoinositides (WIPI), которые родственны дрожжевым autophagy related 18 (Atg18)165,166. PIKfyve участвует в эндосомной и/или лизосомной доставке. Lipid phosphatases degrade or interconvert 3-phosphoinositides. Инактивация некоторых из этих lipid phosphatases вызывает заболевания. Сюда входят lipid phosphatases для PtdIns(3,4,5)P3, такая как phosphatase and tensin
homologue deleted on chromosome 10 (PTEN), опухолевой супрессор, который часто инактивирован в раковых опухолях, так что путь class I PI3K постоянно активен167, inositol polyphosphate-5-phosphatase E (IPP5E), инактивация которой участвует в ciliopathies168, 169 и SH2 domain-containing inositol 5-phosphatase type 2 (SHIP2), которая участвует в передаче сигналов инсулина и гомеостазе глюкозы170. Inositol polyphosphate-4-phosphatase (INPP4) является 4-phosphatase для PtdIns(3,4)P2, которая в случае изоформы INPP4B является опухолевым супрессором, который ингибирует передачу сигналов PI3K171. Оборот PtdIns3P регулируется с помощью myotubularin (MTM) phosphatases, некоторые из которых участвуют в нейропатиях и миопатиях157.
GAP, GTPase-activating protein; GEF, guanine nucleotide exchange factor; GPCR,
G protein-coupled receptor.
Поскольку глобальное ингибирование PI3Ks скорее всего вредно для организма, то фармакологическое ингибирование передачи сигналов PI3K нуждается в химических соединениях, которые находят специфические (или группы из) PI3K изоформы. Поэтому важно идентифицировать роли и механизмы действия изоформ PI3K в нормальной физиологии и при заболеваниях.
Class-I-PI3Ks:-signalling-inputs
У млекопитающих class I PI3Ks присутствует во всех типах клеток, при этом
p110δ и p110γ встречаются в больших количествах в лейкоцитах
1.
Субъединицы p110 были первоначально подразделены на группу class IA (p110α, p110β и p110δ), которые соединяются с p85 типа регуляторной субъединицей и группу class IB (p110γ), которая не соединяется
2
(Fig. 2). Вместо этого p110γ соединяется с одной из двух родственных регуляторных субъединиц
p101 (также известной как PIK3R5) и
p87
(также известной как p84, p87PIKAP или PIK3R6), которые не имеют гомологии с др. белками или распознаваемыми доменовыми структурами (Fig. 2).
Субъединицы p85 содержат Src homology 2 (SH2) домены, которые связывают фосфорилированный тирозин (pTyr) в специфической аминокислотной последовательности, а подразделение class I PI3Ks на те, что связывают p85 (class IA) и те которые не связывают (class IB), по-видимому, коррелирует со способностью быть активированными посредством Tyr kinases или
G
protein-coupled receptors (GPCRs), соотв. Однако недавние данные показывают, что большинство субъединиц class I PI3K может быть активировано с помощью GPCRs, или непосредственно с помощью Gβγ белковых субъединиц (в случае p110β и p110γ) или косвенно, напр., посредством Ras (Fig. 3). В самом деле, Ras может быть активирован с помощью Tyr kinases или GPCRs, и он может затрагивать весь class I PI3Ks благодаря своему Ras-binding domain (RBD). Т.о., class IA PI3Ks могут быть более чувствительными к GPCR стимулам по сравнению с тем, что предполагалось ранее. Напротив могут быть ситуации, когда 'классическая' GPCR-связанная p110γ передача сигналов нижестоящих Tyr kinases может быть следствием активации Ras.
Input through the class I regulatory subunits. Субъединицы p85 предоставляют, по крайней мере, три функции p110 белкам: стабилизацию, инактивацию их киназной активности в базовом состоянии и рекрутирование pTyr остатков на рецепторные и адапторные молекулы. Использование p85 SH2 доменов pTyr уменьшает p85-обусловленное ингибирование p110 изоформ и также приводит их в контакт с их липидными субстратами в мембране.
Помимо их SH2 доменов, которые используют class I PI3Ks с Tyr kinase сигнальными путями, все p85 изоформы обладают Pro-rich богатым N-терминальным N-SH2 доменом (Fig. 2). p85 N-окончания отличны для каждой p85 изоформы и это делает возможным дополнительные сигнальные вводы и выводы, роли которых ещё не исследованы
3. Напр.,
p85α
(также известен как PIK3R1) и
p85β (также известен как PIK3R2) также содержат SH3 домен, второй Pro-rich регион и
BCR
homology (BH) domain (Fig.2), который может обладать прирожденной GTPase-activating protein (
GAP)
активностью членов Rab семейства
4. Сходным образом, имеются некоторые доказательства, подтверждающие, что p85 изоформы могут взаимодействовать с малыми GTPases (такими как Rac, Rho и Cdc42)
3, но это было исследовано только для изолированной p85, а не когда p85 в комплексе с p110.
Млекопитающие имеют 5 самостоятельных изоформ p85 (Fig.2), в принципе дающих до пятнадцати различных p85–p110 комбинаций. В настоящее время роли разных p85 изоформ неизвестны. Будучи ко-экспрессируемые в клетках каждая p85 может связывать любую из изоформ class IA p1105, пока неясно обладают ли эндогенные p85 изоформы предпочтением к специфическим p110 изоформам. Доказательства дифференциального связывания p85 изоформ с рецепторами получены6, 7. Важно исследовать это более систематически, учитывая появляющиеся доказательства селективного рекрутирования p110 изоформ, чтобы активировать рецепторы8-10. Растут также доказательства, что экспрессия субъединиц p85 регулируется по-разному1.
Возможно, что регуляторные субъединицы разнообразят результаты передачи сигналов class I PI3Ks. p85 изоформы, по-видимому, обладают разными биологическими функциями, т.к. нокаут разных p85 изоформ у мышей вызывает разные фенотипы (see Supplementary information S1 (table)). Однако возможно, что потеря субтипа p85 может функционально компенсироваться за счет оставшихся не затронутых p85 субтипов. Кроме того, потеря p85 часто меняет экспрессию p110 субъединиц, это ещё больше мешает интерпретации p85-нокаутных фенотипов3. Некоторые функции p85 могут быть независимыми от PI3K каталитической активности, как это предполагается для потенциальной роли p85α в цитокинезе11. В самом дел. экспрессирующие p85α мутанты, которые не могут больше соединяться с p110
субъединицами в p85α-нокаутных клетках, устраняют дефекты цитокинеза в таких клетках11.
Регуляторные субъединицы p101 и p87 важны для передачи сигналов с помощью Gβγ и Ras к p110γ, хотя их относительный вклад неясен. p87 и p101, которые имеют разное тканевое распределение, по-видимому, дифференциально отвечают на вышестоящие сигналы12 и генерируют разные пулы PtdIns-3,4,5-trisphosphate (PtdIns(3,4,5)P3) (Ref. 13). В самом деле, хотя и p87- и p101-связанные p110γ первоначально генерируют PtdIns(3,4,5)P3
на плазматической мембране, PtdIns(3,4,5)P3, генерируемые с помощью p101–p110γ, вряд ли, поскольку генерируемые с помощью
p87–p110γ, быстро подвергаются эндоцитозу в подвижные, ассоциированные с микротрубочками пузырьки13.
Input through Ras. Ras может быть изначальным путем активации class I PI3K. В самом деле,
Dictyostelium discoideum не обладает субъединицами p85 и её класс class I PI3Ks активируется с помощью GPCR-активированных Ras в ответ на стимуляцию GPCR лигандом циклическим АМФ. Фактически, все p110 субъединицы имеют RBD (Fig. 2).
Ras обладает чётко установленной ролью в активации p110α
14
и p110γ
15, а член семейства Ras
TC21 (также известный как RRAS2)может выполнять роль активации p110δ
16,17. Роль Ras в активации p110β менее ясна, т.к. имеются только косвенные доказательства в пользу
18,19
и против
16.
Вклад Ras, по сравнению с др. воздействиями в активацию PI3K неясне при нормальной физиологии и при болезнях, таких как рак, где Ras может быть активирован постоянно. Также неясно, какие изоформы Ras взаимодействуют с разными членами семейства PI3K, но, по-видимому, имеются рамки для изоформ-избирательных функциональных взаимодействий между Ras и членами семейства PI3K16, 20.
p85 может ингибировать Ras-обеспечиваемую активацию p110α, но эта блокада может быть устранена использованием SH2 доменов p85 с pTyr комплексами21. Это подтверждает, что p85–p110 комплексы чувствительны только к Ras после активации путей Tyr kinase. В случае p110γ, Ras, по-видимому, наиболее важен для p87-обеспечиваемого скорее, чем p101-обеспечиваемого рекрутирования на мембрану p110γ12.
Ras может также индуцировать конформационные изменения в p110γ которые сходны с таковыми, индуцированными с помощью связывания АТФ22.
Недавние исследования обратили внимание на важность воздействия Ras
на активацию PI3K на уровне организма. Инактивирующий knock-in мутагенный подход выявил, что Ras необходим для максимальной передачи сигналов с помощью D.
melanogaster p110 class I PI3K23. Мыши, у которых эндогенный p110α не может больше взаимодействовать с Ras, из-за knock-in мутаций в RBD p110α, погибают перинатально, возможно из-за неспособности развития лимфатических сосудов14. Выживают немногие мыши и они резистентны к туморогенезу, индуцируемому с помощью эндогенного онкогенного Ras, указывая тем самым, что p110α является эффектором онкогенного Ras в развитии рака. Активация Akt в первичных mouse embryonic fibroblasts (MEFs) от p110α-RBD knock-in мышей снижена в ответ на стимуляцию некоторыми Tyr kinase лигандами, но не др., указывая тем самым, что относительная важность Ras в активации PI3K может быть зависимой от стимулов.
Имеются также доказательства роли члена семейства Ras TC21 выше p110δ17. TC21 рекрутирует p110δ на рецепторы антигенов в лимфоцитах и в соответствии с этим TC21-null и p110δ-null мыши обнаруживают сильное сходство своих иммунологических фенотипов17.
Выключение RBD p110γ у мыши блокирует чувствительность p110γ к GPCRs больше, чем делеция p101 регуляторной субъединицы из p110γ 15. Это неожиданно, учитывая, что GPCRs не являются широко известными строгими активаторами Ras в клетках млекопитающих.
Input through small GTPases other than Ras. Помимо Ras, др. малые GTPases могут снабжать сырьем PI3K, или посредством p85 или p110 субъединиц. В самом деле имеются некоторые доказательства того, что p110β может быть активирована за счет соединения с активной RAB5 (Refs 24-26) (Fig.3). Сайт связывания RAB5 на p110β использует RBD и C-терминальную часть спирального домена
27. Неясно, может ли RAB5 также взаимодействовать с др. изоформами class I PI3K. RAB5 присутствует в эндосомных компартментах и в соответствии со способностью p110β связывать эту малую GTPase, p110β был обнаружен в
clathrin-coated vesicles25,26 и участвует в формировании
early
endosome26 и на др. стадиях эндоцитотического пути
28,29.
Изоформы p85 могут также взаимодействовать с малыми GTPases (такими как Rac, Rho и
Cdc42)
3, предоставляя альтернативный путь, посредством которого PI3Ks могут действовать ниже малых GTPases. Малые GTPases могут быть активированы в разных мембранных компартментах в клетке
30,31 и могут , следовательно, влиять на субклеточное распределение и активацию PI3Ks, с которыми они взаимодействуют. Мнение, что PI3Ks могут действовать как ниже мономерных малых GTPases (посредством p110 или p85), так и выше этих GTPases (посредством регуляции их guanine nucleotide exchange факторов (
GEFs)
и GAPs), создавая потенциал для существования петель обратной связи (PI3K→GTPase→PI3K), которые затруднительно выявить экспериментально.
Input through GPCRs. GPCRs передают свои сигналы внутриклеточно посредством аллостерической активации
heterotrimeric G proteins.
In vitro, Gβγ субъединицы непосредственно активируют p110β и p110γ, но не p110α и p110δ
24,32-34, и имеются доказательства, что p110β и p110γ также активируются с помощью GPCRs посредством этого пути в интактных клетках
29,35,36. Более того, некоторые сообщения объявляют, что активные GTP-связанные Gα могут ингибировать p110α
37,38
(Fig. 3).
GPCRs могут также активировать Tyr kinases и Ras, которые могут в свою очередь активировать изоформы class I PI3K , которые не прямо чувствительны к Gβγ
субъединицам, таким как p110δ
39-41. GPCRs могут также модулировать PI3Ks путем непосредственного соединения с p85 посредством Tyr-X-X-Met мотивов. обнаруженных в некоторых GPCRs
42. PI3Ks могут быть также рекрутированы на GPCR сигнальные комплексы, возможно посредством ассоциации с GPCR-взаимодействующими белками, такими как β-arrestin, GRB2-associated
binding (GAB) белки или GPCR kinases (GRKs). Физиологическое значение и молекулярные детали того, как такие GPCR пути используют изоформы PI3K ещё не определены чётко, но они безусловно подходят к специфическим условиям и рассмотрены в
Supplementary
information S2 (
box).
Simultaneous inputs into PI3Ks inside cells. Ещё предстоит рассмотреть, как множественные, сопутствующие сигналы затрагивают активацию изоформ class I PI3K внутри клеток. Исследователи в основном тестируют эффекты одиночных стимулов на активацию class 1 PI3K, которые является искусственными поскольку в физиологическом контексте клетки конфронтируют с множественными стимулами одномоментно. В действительности полная активация некоторых изоформ PI3K может нуждаться в множественных вышестоящих стимулах; напр., p110β, как известно, синергически активируется с помощью Gβγ субъединиц и pTyr пептидов in vitro24,32,43,44.
Мнение о сопутствующих PI3K стимулах особенно важно для раковых клеток, в которых многие вышестоящие сигналы, которые снабжают сырьем PI3K постоянно активированы и/или разрегулированы, возможно активируют множественные изоформы PI3K сразу. Это может помочб объяснить, почему доминирующая роль специфических изоформ PI3K в нетрансформированных клетках, по-видимому, теряется в раковых клетках. Такая потеря специфичности передачи сигналов считается характерной для дегенеративных систем, ведущих к тому, что обозначается как увеличение энтропии путей сигнальной трансдукции
45. Напр., p110δ, которая часто играет доминантную роль по сравнению с др. class IA PI3Ks в нетрансформированных лейкоцитах
10,46.
В иммортализованный и трансформированных лейкоцитах относительное значение
p110δ снижается, несмотря на сходные уровни экспрессии p110δ
10,46. В иммортализованных макрофагах, напр., p110δ имеет общую роль в передаче сигналов PI3K с p110α
10. Это не связано с мутациями или повышенной относительной экспрессией p110α в этих клетках, а коррелирует с повышенным рекрутированием p110α на рецепторы в этих клетках по сравнению с первичными клетками
10, посредством механизмов, которыя пока неясны.
Class I PI3Ks: signalling outputs
Мыши, мухи и черви с инактивирующими мутациями в каждой из class I PI3Ks были получены (see Supplementary information S1 (table)). Они выявили удивительно отличающиеся фенотипы потери каждой из изоформ, указывающие на уровень неперекрываемости в общем результате передачи сигналов p110 изоформ, по крайней мере, в нетрансформированных клетках. Доступны малые молекулы ингибиторы для class I PI3Ks млекопитающих, делающие этот путь также пригодным для фармакологических испытаний.
Outputs of the class I PI3K catalytic activity. Class I PI3Ks генерирует PtdIns(3,4,5)P
3 липид, который быстро превращается с помощью PtdIns 3- и PtdIns 5-фосфатаз в PtdIns(4,5)P
2 PtdIns(3,4)P
2,
соотв. (Fig. 1). Ключевая PtdIns 3-фосфатаза является phosphatase and tensin homologue deleted on chromosome 10 (
PTEN),
которая часто инактивируется при раке, приводя к активации PI3K. PTEN может при некоторых условиях преимущественно соединяться с p110β, но эта связь не универсальна (see
Supplementary
information S3 (box)).
PtdIns(3,4,5)P3 PtdIns(3,4)P2 координируют локализацию и функцию многих эффекторных белков, которые связывают эти липиды посредством их PH домена47. Сюда входят Ser/Thr и Tyr протеин киназы (такие как Akt и BTK,
соотв.), адапторные белки (такие как GAB2) и регуляторы малых GTPases (GAPs и GEFs)20. PtdIns(3,4,5)P3 и PtdIns(3,4)P2 в основном генерируются на плазматической мембране, хотя эти липиды могут также присутствовать в эндосомных компартментах48 и даже в ядре49,50.
Некоторые доказательства указывают на то, что взаимодействие RAB5 с p110β
может генерировать PtdIns(3,4,5)P3, которые затем превращаются в PtdIns3P с помощью PtdIns 5- и PtdIns 4-фосфатаз26. Class I PI3Ks т.о., могут, в принципе, также вносить вклад в пул PtdIns3P и иметь перекрывающиеся эффекторы с классом II и классом III PI3Ks. Относительное значение class I PI3Ks для продукции PtdIns3P клетками неясно.
Помимо своей липид киназной активности некоторые PI3Ks также обладают протеин киназной активностью51, но их физиологические субстраты остаются неизвестными. Эта протеин киназная активность отличается между изоформами class IA PI3K52,53, так что это может вносить вклад в изоформ-селективный результат PI3K.
Scaffolding functions of class I PI3Ks. Class I PI3Ks, по-видимому, не имеет стабильных партнеров по связыванию помимо своих bona fide регуляторных субъединиц, но может функционировать как каркас для др. белков54. Это иллюстрируется связыванием p110γ с phosphodiesterase 3B55 и с изоформами protein kinase C (PKC)56. Роль каркаса для p110β была также предположена28,29, но не были описаны специфические партнеры по связыванию. p85 может также иметь несколько временных или низкого сродсва партнеров по связыванию3.
Downstream effectors of class I PI3Ks beyond Akt. Исследования передачи сигналов PI3K были в основном сфокусированы на Akt и её нижестоящих мишенях. Активация Akt обычно происходит одновременно с активацией PI3K, но это происходит не всегда. Напр., когда 3T3-L1 адипоциты стимулируются с помощью инсулина, то Akt фосфорилирование всё ещё происходит, когда увеличение клеточных PtdIns(3,4,5)P3 и PtdIns(3,4)P2 блокировано с помощью p110β ингибирования57. Хотя Akt может быть чувствительной ко многим очень небольшим количествам PtdIns(3,4,5)P3 и PtdIns(3,4)P2, так что даже существенная редукция в уровнях 3-phosphoinositides всё ещё делает возможной активацию Akt, одинаково возможно, что PtdIns(3,4,5)P3 и PtdIns(3,4)P2, генерируемые с помощью p110β, не связаны с Akt фосфорилированием в этих условиях. Также отсутствует прямая корреляция между p110α мутациями (и предположительно активацией
p110α ) и активацией Akt58,84
(see below).
Кстати, относительно мало внимания было уделено малым GTPases, которые действуют ниже PI3Ks. PI3Ks могут регулировать членов семейств Rac, Ras и Arf GTPases посредством регуляции их GEFs и GAPs
20. Более того, это может происходить PI3K изоформ-селективным способом, зависимым от малой GTPase. Напр., в то время как Rac позитивно регулируется всеми изоформами PI3K, RhoA негативно регулируется с помощью p110δ
10,59,60 и p110α при этом каждая из них не затрагивает
10 или позитивно контролирует RhoA
61, возможно способом, зависимы от типа клеток. Всё это указывает на то, что потенциал дифференциальных сигнальных исходов, стоящих ниже специфических изоформ PI3K, параллелен возможности более универсальной активации Akt.
Mutation of class I PI3Ks in cancer
Роль PI3K при раке интенсивно исследовалась и стало ясно, что компоненты пути PI3K универсальной разрегулированы при раке. Ниже мы суммируем мутации, которые были задокументированы в субъединицах PI3K и их эффекты на передачу сигналов.
Selective mutation of p110α Samuels et al. секвенировали предсказанные киназные домены восьми PI3K и восьми PI3K-подобных генов при раке и нашли тумор-специфические мутации (соматические) только в
PIK3CA, гене, кодирующем p110α
62. Дополнительные исследования по секвенированию, такие как оценка
p110δ гена (
PIK3CD) при лейкемии
63-67, показали, что PI3K мутации при раке присутствуют только в
PIK3CA. Это в основном missense мутации, вызывающие аминокислотные замены. Мутации были найдены по всей кодирующей области p110α, но большинство находилось в 'регионах горячих точек', таких как киназный домен и соседний спиральный домен, с RBD заметно негативным для таких мутаций
68,69. Описаны также небольшие делеции и инсерции в
PIK3CA (Ref. 67
и см. также
COSMIC).
Некоторые
PIK3CA остатки, которые мутируют при раке законсервированы в др. классах IA PI3Ks
70. Интересно, что интродукция мутаций, гомологичных p110α Glu545Lys мутации в ген, кодирующий p110β (
PIK3CB) вызывала лишь слабую активацию этого белка
71, указывая тем самым на дифференциальную регуляцию p110α и p110β.
Амплификация гена
PIK3CA при раке впервые описана в 1999 (Ref. 72),
также является общераспространенной
1, описана также амплификация и
PIK3CB, PIK3CD и
PIK3CG
при раке
1.
How do mutations in PIK3CA cause p110α activation? Хотя увеличение основной липидной киназной активности некоторых мутантных p110α белков и было задокументировано73,74, в точности, как большинство мутаций PIK3CA меняет активность p110α остается неизвестным. Накапливаются доказательства подтверждающие, что разные мутации могут индуцировать с избыточной функцией p110α посредством различных молекулярных механизмов, таких как изменение позиции и подвижности активационной петли или увеличение позитивного поверхностного заряда p110α и , следовательно, увеличение рекрутирования на клеточные мембраны75,76. Увеличение позитивного поверхностного заряда p110α может быть также важным для мутаций горячей точки His1047Arg 77, это ведет к изменению ориентации остатка 1047, сдвигу конформации двух петель киназного домена, который контактирует с клеточной мембраной. Это может позволить p110α с His1047Arg мутацией к менее зависимому от сигналов доступу к липидному субстрату в мембранах.
Хорошо известный механизм активации p110α с помощью мутаций это мутации в горячей точке Glu545Lys спирального домена, которые смягчают базовую репрессию p110α с помощью p85α78. Активация, обеспечиваемая с помощью мутаций этого спирального домена можно поэтому рассматривать как эквивалент связывания pTyr пептидов с p85α–p110α комплексом. В соответствии с этой интерпретацией, p110α белки с мутациями в спиральном домене обладают более высокой базовой активностью, которую больше невозможно увеличить с помощью pTyr пептидов79,80.
Signalling output of PIK3CA mutations. Пока неясно. почему p110α избирательно мутаирует при раке. p110α может комбинировать имеющие отношение к раку функциональные характеристики, не являющиеся общими с др. PI3K изоформами, такие как широкое тканевое распространение, изоформ-специфическая роль в факторе роста и метаболической передаче сигналов8,57,
более высокая специфическая активность81,82 эффекторная роль, стоящая ниже более широкого ранга членов семейства Ras, чем у др. class I PI3Ks16.
Также контроль p110α может быть не столь тонким и может быть нужда только в одиночном входящем сигнале, чтобы стать активированным по сравнениюp110β, который может нуждаться как в Tyr kinases, так и GPCRs для своей активности. Воспроизведение активации с помощью одиночной мутации д. быть более тяжелым в достижении для p110β, чем p110α.
Воздействие мутантного
PIK3CA на пути передачи клеточных сигналов изменчиво и не всегда коррелирует с Akt фосфорилированием. Более того, разные мутации могут иметь разные биологические исходы, как это демонстрируется с помощью усиленного метастатического фенотипа, вызываемого с помощью мутаций Glu545Lys по сравнению с мутациями His1047Arg
83. Даже если Akt активирован это не всегда ведет к активации сигнальных путей ниже Akt. Это отсутствие корреляции между присутствием мутаций
PIK3CA и устойчивым состоянием или ростовым фактором стимулированной активностью PI3K и Akt впервые было установлено вскоре после открытия мутаций
PIK3CA84. Это было тщательно исследовано в недавнем сложном анализе раковых клеток, несущих мутантную
PIK3CA, который подтвердил, что многие из этих клеток обнаруживают минимальную активацию Akt и нижестоящей передачи сигналов
58,85. В некоторых случаях клетки с мутантной p110α, по-видимому, обладают зависимостью от 3-phosphoinositide-dependent protein kinase 1 (
PDK1) и её киназного субстрата
SGK3 (Ref.58). Т.о.,
PIK3CA мутации не необходимы и недостаточны для полной активации пути Akt.
Somatic p85α mutations can activate p110α, p110β
and p110δ. Конституитивная активация p110α также достигается с помощью мутаций
PIK3R1, который кодирует p85α а также p55α и p50α
58,86,87. Большинство мутаций p85α было найдено в SH2 и в inter-SH2 доменах, а доказательства указывают на то, что некоторые из этих мутаций устраняют ингибирующее действие p85α на p110α , а также на p110β и p110δ, и т.о., составляет потенциально более широкую активацию передачи сигналов PI3K после активации p110α
58,86. Интересно, что мутации в др. PI3K регуляторных субъединицах, включая гены, кодирующие p85β (
PIK3R2) и p55γ (
PIK3R3), были низкими или отсутствовали, указывая тем самым на изоформ-специфическую роль p85α при раке.
The class II PI3Ks
Class II PI3Ks был открыт на базе гомологии их последовательностей с class I и class III PI3Ks скорее, чем в функциональном контексте и его физиологическая роль всё ещё неясна. Они отсутствуют в дрожжах и единственная изоформа найдена у D. melanogaster и C. elegans (see Supplementary information S1 (table)). Млекопитающие имеют три изоформы class II PI3K: PI3K-C2α,
PI3K-C2β и PI3K-C2γ (Fig. 2). PI3K-C2α и PI3K-C2β обнаруживают широкое, но не повсеместное тканевое распределение, тогда как паттерн экспрессии PI3K-C2γ, по-видимому, более ограничен1. Фармакологические ингибиторы с избирательностью к class II PI3Ks не описаны. Относительная рефрактерность PI3K-C2α к pan-PI3K ингибиторам LY294002 и wortmannin88,89 часто используется для задействования этого class II PI3K изоформ в передаче сигналов и биологических реакциях, но эти эксперименты трудно интерпретировать.
Class II PI3Ks: signalling inputs. Class II PI3Ks, по-видимому, преимущественно и постоянно ассоциирует с внутриклеточными мембранами с низким уровнем в цитозоле90-94. PX домен на C-терминальномl расширении PI3K-C2α может связывать PtdIns(4,5)P2 (Refs 95,96), но значение этого неясно. В самом деле, делеция или этого домена или C-терминального C2 домена в PI3K-C2α не затрагивает её основной связанной с мембраной локализации при избыточной экспрессии в клетках91.
Class II PI3Ks не обладает регуляторными субъединицами, вышестоящие сигналные импульсы могут передаваться посредством их удлиненных N- и C-концов (Fig. 2). Представлены доказательства умеренной активации class II PI3Ks с помощью Tyr kinase и
GPCR лигандов97-99> (Fig.1). Молекулярный механизм активации class II PI3K с помощью этих агонистов неясен, но они могут участвовать в релокализации цитозольного пула энзима на плазматическую мембрану100. Такая релокализация может достигаться за счет взаимодействия class II PI3Ks с ассоциированными с мембраной адапторными белками или комплексами. такими как GRB2 и EPS8–ABI–SOS1 комплекс в случае epidermal growth factor (EGF)101-103 или clathrin90,104-106, возможно с вовлечением Pro-rich регионов в N-терминальном расширении.
Class II PI3Ks могут также рекрутироваться и активироваться с помощью мембран-связанных GTPases, таких как
TC10 (Refs 107,108) (Fig. 1), возможно посредством RBD, который присутствует во всех class II PI3Ks (Fig.2). Однако прямое взаимодействие между TC10 и class II PI3Ks ещё не установлено, а Ras, как было показано, не активирует и не связывает PI3K-C2β
92. Описывается возможная роль кальция в прямой и косвенной регуляции class II PI3Ks
92,100,109(Fig.1).
Class II PI3Ks: signalling outputs. In vitro class II PI3Ks может превращать PtdIns и PtdIns4P в соотв. 3-phosphoinositide липиды. Взаимодействие PI3K-C2α с clathrin было описано, как активирующее эту киназу и изменяющее её специфичность к субстрату in vitro, так что она может более эффективно фосфорилировать PtdIns4P в PtdIns(3,4)P2 и превращать PtdIns(4,5)P2 в PtdIns(3,4,5)P3 (Ref. 88). Необходимы дальнейшие исследования для оценки in vivo субстрата для class II PI3Ks, но имеющиеся доказательства указывают на то, что в клетках class II PI3Ks генерируют PtdIns3P108-112.
При базовых не стимулированных условиях клетки содержат существенный пул PtdIns3P, который в основном располагается в эндосомах
113-115.
PtdIns3P маркируют (earmarks) внутриклеточные органеллы для связывания и сборки эффекторных молекул, которые взаимодействуют с ними посредством PX или FYVE доменов (Fig. 1). Они включают липидную киназу FYVE finger-containing phosphoinositide
kinase (
PIKfyve; также известную как FAB1), которая превращает PtdIns3P в PtdIns(3,5)P
2, протеин киназы (такие как
SGK3), GAPs (такие как RGS domain- и PHOX domain-содержащий белок (
RGS-PX1; также известен как SNX13)), p40 и p47 субъединицы NADPH оксидазы и различные белки с сортирующими и каркасными функциями в мембранном транспорте (такие как early endosome antigen 1 (
EEA1), hepatocyte growth factor-regulated Tyr kinase substrate (
HRS; также известен как HGS и
VPS27), endosomal sorting complexes required for transport (ESCRT) компоненты, autophagy-linked FYVE белок (
ALFY;
также известный как WDFY3), kinesins и члены семейства сортировки nexin)
47,116-118.
Пока неясно до какой степени class II PI3Ks вносит вклад в активацию белков, упомянутых выше. Во-первых, существуют противоречивые результаты относительно степени, с которой class II PI3Ks вносят вклад в уровень устойчивого состояния PtdIns3P. В самом деле, в то время как стабильное RNA interference (RNAi)-обусловленное подавление PI3K-C2α не затрагивает базовых уровней PtdIns3P108, временная избыточная экспрессия kinase-dead PI3K-C2α снижает уровни устойчивого состояния tdIns3P и PtdIns(3,4,5)P3 (Ref. 119). Причина этого расхождения неясна. Class II PI3Ks может также вносить вклад в продукцию PtdIns3P в ответ на клеточную стимуляцию, но это продемонстрировано лишь в немногих случаях. Одним из примеров является PI3K-C2α , которая после стимуляции инсулином L6 мышечных клеток, по-видимому, начинает концентрироваться на плазматической мембране, чтобы генерировать здесь агонистом-стимулированный пул PtdIns3P , но отсутствуют доказательства относительного увеличения PtdIns3P в эндосомах108.
Class II PI3Ks: biological outputs. Исследования на клетках млекопитающих выявили участие class II PI3Ks в биологических процессах, таких как миграция клеток, метаболизм глюкозы, экзоцитоз, контракции гладкомышечных клеток и апоптоз97, хотя остается неясным, какие PtdIns3P эффекторы обеспечивают эти биологические эффекты.
Роль class II PI3Ks у млекопитающих неизвестна (see Supplementary information S1 (table)). Описаны только нулевые мыши для изоформы class II PI3K PI3K-C2β, и они оказались жизнеспособны и плодовиты без альтераций эпидермальной дифференцировки — единственный фенотип, исследованный у таких мышей столь подробно120.
Генетические исследования у мух и червей подтвердили возможную связь class II PI3Ks с сигнальными путями Tyr kinase, но природа этого взаимодействия неясна. RNAi-обусловленная инактивация
F39B1.1, единственного гена class II PI3K у
C. elegans, приводила к повышенному накоплению жира, воспроизводя фенотип инактивации DAF-2,insulin-подобного рецептора у червей
121.
Мухи с инактивацией
PI3K68D, единственного гена class II PI3K у этого организма не присутствуют в существующих хранилищах мутантных линий мух. Исследования по эктопической экспрессии дикого типа и kinase-dead
PI3K68D в эпителиальных тканях мух подтвердили роль PI3K в сигнальных путях, которые затрагивают формирование паттерна в тканях
122. Это контрастирует с
D. melanogaster class I PI3K, который затрагивает клеточный рост, но не формирование паттерна
123, указывая тем самым, что class I и II PI3Ks регулируют разные биологические пути
in vivo. Эти исследования открыли также возможность генетических взаимодействий
D. melanogaster class II PI3K
с EGF рецептором и Notch путями
122.
VPS34: the sole class III PI3K
Vps34 был первоначально идентифицирован у Saccharomyces cerevisiae при скрининге генов, участвующих в эндосомной сортировке белков в направлении вакуолей, дрожжевого компонента лизосом млекопитающих124. Vps34 законсервирован от низших эукариот до растений и млекопитающих (у которых он известен как PIK3C3) и является эндосомной киназой, которая может обладать множественными функциями благодаря ассоциации с разными мультипротеиновыми комплексами.
Inputs into Vps34 through distinct protein complexes. Vps34 формирует конституитивный гетеродимер с Vps15, который является
myristoylated комплексом Vps15–Vps34 , закрепленным на внутриклеточных мембранах.
Vps34 обнаруживается в многочисленных мультипротеиновых комплексах, это предопределяет его биологические роли. У дрожжей описаны три комплекса (Fig. 4a). У млекопитающих комплексы VPS34 более сложные и недостаточно описаны, идет идентификация новых компонентов (Fig. 4b). В отличие от дрожжей некоторые партнеры VPS34 у млекопитающих не обязательно ограничены исключительно одной специфической функцией. Некоторые белки в Vps34 комплексах законсервированы эволюционно, а базовая конфигурация основывается на той, что известна у дрожжей и может быть идентифицирована у млекопитающих. Эти комплексы содержат beclin 1, ATG14L (также известный как barkor) и ultraviolet radiation resistance-associated gene protein
(UVRAG), гомологи у млекопитающих дрожжевых Vps30, Atg14 и Vps38, соотв.
125.
Vps34-ассоциированные белки также регулируют прямо или косвенно каталитическую активность Vps34. Напр., было показано, что Bax-interacting factor 1 (BIF1) стимулирует активность VPS34 киназы в UVRAG–beclin 1 комплексе млекопитающих126,127.
Vps34 lipid kinase activity. Vps34 обладает специфичностью к липидному субстрату, ограниченному PtdIns, генерируя PtdIns3P128,129 (Fig. 1).
Vps34 может, следовательно, в принципе обладать общими белковыми эффекторами c principle, share protein effectors with the
class II PI3Ks, но неясно происходит ли и до какой степени перекрывание функций class
II и class III PI3Ks. Исследования C. elegans, в которых фенотипы VPS-34-нулевых мутантов могут быть устранены за счет снижения активности PtdIns3P липид фосфатазы путем инактивации PtdIns 3-phosphatase myotubularin 6 (MTM-6) (Ref. 130), подтверждают, что могут существовать VPS-34-независимые источники PtdIns3P. Kinase-dead Vps34 не может устранять фенотип делеции Vps34 у дрожжей128 или C.
elegans131, указывая тем самым, что активность липид киназы Vps34 is важна для её биологической функции.
Activation of Vps34 by extracellular stimuli. Неясно. регулируется ли Vps34 внеклеточными стимулами (Fig. 1), хотя имеются доказательства, что активность Vps34 может регулироваться питательными веществами, такими как аминокислоты и глюкоза
132-134. Выявлена GPCR регуляция спаривания дрожжей, индуцированного феромонами, которые действуют как агонисты GPCR, которые активируют mitogen-activated protein kinases посредством Gβγ
134. Было предположено, что феромоны ведут к активации и диссоциации guanine nucleotide-binding protein α1 subunit (
Gpa1;
гомолога Gα млекопитающих) jn Gβγ на плазматической мембране. Gpa1–GTP затем перемещается на мембраны эндосом, где она соединяется и активирует Vps34–Vps15 (Fig.4), стимулируя образование PtdIns3P и рекрутирование PtdIns3P-связывающих белков, которые могут ассистировать реакции на феромоны. Известно отметить, что активация дрожжевой Vps34 осуществляется посредством Gα, скорее, чем Gβγ, это происходит и в случае class I PI3Ks.
У млекопитающих описана роль VPS34 в передаче сигналов Gαq-coupled receptor ниже M1 muscarinic рецепторов135.
Вовлечение Vps34 в передачу сигналов с помощью др. GPCRs еще предстоит исследовать.
Vps34: effectors and biological outputs. Многие Vps34 эффекторы, но не все, взаимодействуют с PtdIns3P (Fig. 4), указывая тем самым, что Vps34 также действует как каркасный белок. Дрожжи с гомозиготной делецией Vps34 жизнеспособны, но обнаруживают дефекты роста в отсутствие стрессов и при стрессовых условиях и дефекты в сортировке вакуолярных белков136. Глобальная делеция Vps34 у дрожжей и мух летальна (see Supplementary information S1 (table)). VPS34-нулевые мыши не описаны.
Все известные биологические функции VPS34 у млекопитающих связаны с регуляцией везикулярного трафика, включая
autophagy, эндоцитоз и
phagocytosis (Fig. 5). Кроме того, некоторые исследования показали, что VPS34 может контролировать зависимую от аминокислот активацию S6 kinase 1 (Refs 132,133), указывая на возможную связь между VPS34 и target of rapamycin complex 1 (mTORC1) Ser/Thr kinase млекопитающих, ключевого интегратора вышестоящих метаболических сигналов. Однако эта связь на сегодня спорна (see
Supplementary
information S4 (box)).
Vps34 and autophagy. Vps34 ? как было установлено, необходим для аутофагии у дрожжей137. У D. melanogaster роль VPS34 в аутофагии в основном ограничена ранними ступенями образования autophagosome138
а киназа-дефектные VPS34 мутантны фенокопируют эффект делеции VPS34, это подчеркивает роль активности VPS34киназы и тем самым генерации PtdIns3P в аутофагии. Роль VPS34 в аутофагии у млекопитающих не установлена. Источник autophagosome всё ещё спорный и как полагают сцеплен с Гольджи, плазматической мембраной и endoplasmic reticulum (ER). Последние данные показали, что PtdIns3P-обогащенные структуры (наз. omegasomes , исходя из их бокаловидной формы (Fig. 5a)), по-видимому, формируются из ER мембран голодающих по аминокислотам клеток млекопитающих139,
указывая тем самым, что VPS34 может рекрутироваться на ER, чтобы сформировать autophagosome в ответ на голодание.
Vps34 and endocytic pathways. Оригинальный фенотип
Vps34-нулевых дрожжей, связанный с эндосомной сортировкой, привел к исследованию роли гомологов Vps34 в
endosomal
traffickingу др. организмов. У
D.melanogaster делеция или экспрессия дефектных по киназе VPS34 мутантов ведет к тяжелым дефектами пиноцитоза, формы эндоцитоза
138 (see Supplementary information S1 (table)). У млекопитающих точная роль VPS34 в эндоцитозе трудно обнаружима из-за сложности эндосомной системы млекопитающих. Эндоцитоз осуществляется с помощью различных механизмов и может приводить к рециклингу или деградации груза с помощью лизосом. Путь рециклинга включает ранние эндосомы и
late
endosomes, тогда как путь деградации добавляет промежуточный компартмент, известный как
multivesicular
bodies140 (Fig. 5b).
VPS34 комплексы направляются в ранние или поздние эндосомы посредством, соотв.,
RAB5 и RAB7 и последующую цепь событий (Fig. 5b). RAB5–GTP сначала взаимодействует с C-терминальными
WD
repeats в VPS15 (также известным у млекопитающих как PIK3R4) (Ref. 141),
приводя к усилению продукции PtdIns3P в ранних эндосомах. RAB5 и PtdIns3P затем соединяются и собирают эффекторные молекулы, такие как EEA1, HRS и ESCRT белки,
приводя к слиянию пузырьков с др. RAB5-позитивными пузырьками. Прогресс от ранних к поздним эндосомам маркируется замещением RAB5 на RAB7 (Fig. 5b), который рекрутирует свой эффекторный RAB7-interacting lysosomal protein (RILP), приводя к слиянию с кислыми лизосомами и приобретению лизосомного маркера lysosome-associated membrane protein 1 (LAMP1). Подобный эндосомный трафик используется также для эндосомной сортировки связанных с мембранами рецепторов. таких как рецепторные Tyr киназы или transferrin рецепторы. В соответствии с ролью VPS34 в этом процессе, ингибирование VPS34 задерживает рециклинг transferrin рецепторов и интернализацию platelet-derived growth factor (PDGF) и EGF рецепторов
142-145.
Кроме того, VPS34 играет роль в фагоцитозе (Fig. 5c), специализированной форме эндоцитоза. PtdIns3P является универсально генерируемым на фагосомных мембранах146-148). Несколько волн накопления PtdIns3P происходит во время процесса фагоцитоза: ранний преходящий пик наблюдается непосредственно после интернализации частиц и вторая волна появляется на более поздних стадиях во время созревания фагосом149. VPS34 активность и PtdIns3P продукция не обязательны для инициации образования фагосом (это зависит от класса class IA PI3Ks вместо них), но они критические для созревания фагосом146,150.
В отличие от эндоцитотического пути, при котором VPS34 функционирует ниже RAB5–GTP–VPS15, фагоцитоз, по-видимому, использует др. путь, в котором VPS34 действует выше RAB5. Это было открыто с помощью генетического скрининга в клетках C.elegans и млекопитающих151 (Fig. 5c). На зарождающихся фагосомах,
VPS34 взаимодействует с dynamin, GTPase, которая также контролирует clathrin-обеспечиваемый эндоцитоз. Во время созревания фагосом dynamin рекрутирует RAB5–GDP посредством VPS34, который действует в качестве мостика между dynamin
и RAB5–GDP. Неидентифицированные GEFs последовательно превращают RAB5–GDP в RAB5–GTP, приводя к продукции PtdIns3P и рекрутированию PtdIns3P-связывающих белков.
PtdIns3P также является критическим для активации NADPH oxidase, собираемой
на фагосомах
152. Недавнее исследование показало, что VPS34 (а не PI3K-C2β) является критическим для продукции PtdIns3P и активации оксидазы в ответ на фагоцитоз
Escherichia coli с помощью нейторофилов, частично посредством рекрутирования PX
domain-содержащего белка p40phox
148. Этого типа биологическая функция Vps34 д. помочь объяснить, почему мухи, дефектные по IRD1 (
D. melanogaster гомолог Vps15) более чувствительны к бактериальной инфекции
153.
Concluding remarks
Much progress has been made in understanding the signalling roles of the PI3K isoforms, but many questions on their physiological and pathological roles remain, especially for class II and class III PI3Ks (
Box
1). Current evidence suggests that the roles and pathways of PI3K isoforms
documented in untransformed cells may not be retained in cancer cells.
At the cellular level, it will be important to develop approaches to quantitate and localize the 3-phosphoinositides, which is technically challenging154,155, and to determine the contribution of PI3K isoforms using genetic and pharmacological tools. Indeed, it is currently not possible to monitor the activity of PI3Ks in cells in situ, with immunoprecipition and in
vitro kinase assays not adequately reflecting their in vivo activity156.
Remaining questions include whether PtdIns(3,4,5)P3 is found in locations other than the plasma membrane, for example in endosomes48-50, and whether different pools of PtdIns3P exist and are produced by different PI3K isoforms. Also, the roles of many of the different PtdIns phosphatases, which could further diversify PI3K signalling, remain to be determined.
Much of the work in the PI3K arena is currently centred on clinical development. It will be important to maintain the efforts to understand the basic mechanisms of PI3K signalling as such knowledge might allow us to better harness the intervention of PI3K signalling for human
benefit.
Сайт создан в системе
uCoz 
