PRC2 содержит 4 стержневые субъединицы (Fig. 2; Table 1), а сигнатурой его активности является метилирование H3K27 (Refs 68-71), добавление трех метильных групп к этой мишени остатку Lys. Триметилирование H3K27 (H3K27me3) , как полагают, является основной формой H3K27 которая участвует в PcG молчании, поскольку его распределение по геному следует за PcG комплексами^{11, 16, 19-21}, тогда как H3K27me и H3K27me2, по-видимому, более многочисленно и широко распространено^{72, 73}. Хотя триметилирование H3K27, как полагают является критическим, недавние исследования выявили функции PRC2 помимо ферментативной активности.

Core PRC2 subunits and methyltransferase activity. Функции субъединиц PRC2 сходны у мух и у людей. В его сердцевине SET domain каталитической субъединицы, Enhancer of Zeste (E(Z)) у мух или EZH2 у человека, представляет собой активный сайт, E(Z) и ZH2 являются неактивными сами по себе и собираются в ансамбль с, по крайней мере, Suppressor of Zeste 12 (SUZ12) и Extra Sex combs (ESC) или embryonic ectoderm development (EED) у мух и человека, соотв.^74-77. Нет доказательств, что некаталитические PRC2 субъединицы взаимодействуют с нуклеосомами^{75, 78, 79}, но механистические основы их более чем в 1000 раз усиления энзимов, неизвестны. Трехмерная структура PRC2 активного сайта была бы существенной подмогой для решения этого вопроса. Хотя карманы, связывающие субстрат и кофакторы, могут быть предсказаны, исходя из др. известных структур SET доменов⁸⁰, и известны индивидуальные структуры для EED nucleosome remodelling factor 55 (NURF55; также известных как p55 и CAF1) (Refs 79,81), всё же мы лишены исчерпывающей картины функциональных сайтов и составляющих субъединиц, которые делают работу PRC2.

PRC2 variants. У млекопитающих два родственных гена кодируют EZH1 и EZH2. Более того, альтернативные сайты страта трансляции могут давать 4 разные формы EED⁸². Это ведет к существованию семейства родственных PRC2 комплексов у млекопитающих (Fig. 2b). Интересно, что PRC2, содержащие определенные изоформы EED могут метилировать линкерный гистон H1 в дополнение к H3K27 in vitro^{82, 83}. Метилирование H1 происходит in vivo⁸⁴, но его потенциальная роль в PcG молчании еще не изучена.

Недавние исследования выявили основные различия между PRC2 вариантами. содержащими EZH2 и содержащими EZH1.В то время как EZH2 экспрессируется на высоком уровне во время эмбриогенеза и в пролиферирующих клетках, EZH1 преобладает во взрослых тканях и в неделящихся клетках^85-87. Существуют четкие биохимические различия: PRC2-EZH1 обладает значительно меньшей methyltransferase активностью, чем PRC2-EZH2, но он может компактизировать полинуклеосомы, тогда как PRC2-EZH2 нет⁸⁶. Соотв., PRC2-EZH1 может репрессировать транскрипцию с хроматинизированных матриц in vitro, тогда как PRC2-EZH2 нет. Т.о., PRC2, по-видимому, сдвигается с каталитического в направлении не-каталитического механизма, когда EZH1 замещает EZH2. Удивительно. что этот сдвиг происходит несмотря на то, что EZH1 и EZH2 на 65% идентичны и являются партнерами тех же самых стержневых субъединиц. Эти находки также ставят вопрос о in vivo функциях PRC2, поскольку у D. melanogaster содержится только один E(z) ген. Может ли одна версия каталитической субъединицы PRC2 обеспечивать ферментативную и не-каталитическую функции в хроматине? PRC2 варианты существуют у D. melanogaster, благодаря альтернативным ESC субъединицам (Fig. 2a), но основные функциональные различия не были обнаружены^88-90.

Дополнительная изменчивость вызывается др. PcG белком, Polycomb-like белком (PCL у мух и PHF1 у млекопитающих), который может соединяться и изменять свойства PRC2 (Fig. 2). Хотя не стержневая субъединица, PCL (или PHF1) модулирует PRC2 существенным образом^91-94. Два исследования показали, что PCL (или PHF1) стимулирует PRC2-обеспечиваемую конверсию H3K27me2 в H3K27me3 (Refs 91,93). Эта финальная ступень метилирования является ключевой: H3K27me2 широко распространено, занимает приблизительно 50% от всех нуклеосом^{72, 73}, тогда как эффективная продукция H3K27me3 каким-то образом ограничена и коррелирует строго с PcG молчанием. Др. исследование сообщило о PHF1 стимуляции метилтрансферазной активности PRC2, но без специфической поддержки превращения H3K27me2 в H3K27me3 (Ref. 94). Наконец, доказательства от D. melanogaster подтверждают PCL функции в рекрутировании PRC2 (Ref. 92). Дальнейшие исследования смогут объяснить глобальные роли PCL и PHF1 in vivo и определить, как эти функции могут быть интегрированы. Потеря PCL ведет к менее тяжелым дефектам Hox, чем потеря PRC2 (Ref. 95), а нокдаун PHF1 снимает молчание с некоторых, но не всех протестированных PcG мишеней^{91, 94}. Т.о., сравнение геномного распределения PRC2, H3K27me2 и H3K27me3 и трех гомологов млекопитающих PHF1, д. предоставить более исчерпывающую картину.

Consequences and functions of H3K27 methylation. Несмотря на широко распространенное согласие, что метилирование H3K27 является критическим для PcG молчания, его механистический вклад всё ещё спорен. Любая ковалентная гистоновая модификация может функционировать как сайт присоединения для регуляторного комплекса, рекрутируя тем самым и/или облегчая активность этого комплекса или может непосредственно изменять контакты между нуклеосомами, изменяя базирующиеся на зарядах взаимодействия. Хотя это возможно, но нет доказательств, что метилирование H3K27 вносит вклад в молчание путем изменения взаимодействий нуклеосом. Вместо этого, внимание было сфокусировано на взаимодействиях метки с регуляторными комплексами. Сродство chromodomain из Polycomb, составляющего PRC1, к H3K27me3 (Refs 96,97) указывает на то. что эта модификация предоставляет сайт присоединения для PRC1. Как же это место присоединения используется in vivo? Одна модель представляет, что метилирование H3K27 имеет целью инициальное рекрутирование PRC1 на гены мишени (Fig. 3a). подтверждает это мнение то, что разрушение PRC2 ведет к потере PRC1 с хроматиновых мишеней у D. melanogaster^{49, 68} и в клетках млекопитающих^{19, 98}. Однако поскольку эти тесты одновременно устраняют и PRC2 и метилированные H3K27, то они не могут определить точный вклад метилирования H3K27. Напротив, цитируются доказательства, подтверждающие, что рекрутирование PRC1 не зависит от метилирования H3K27, включая: несовпадение PRC1 и метилированных H3K27 у D. melanogaster, при этом специфический пик PRC1 наблюдается в PRE регионах, а метилированные H3K27 оказываются локализованными в более широк распространенных мишенях локусах¹¹; сродство Polycomb к H3K27me3 оказалось значительно меньшим, чем для типичного регуляторного взаимодействия белок-ДНК³¹; физические взаимодействия PHO-PRC1⁹⁹; удержание хроматином PRC1 даже после сниженияH3K27me3 у PCL мутантных мух⁹³; рекрутирование PRC1 мышей на определенные мишени без PRC2 или метилирования H3K27^100-103. В качестве альтернативы доставки PRC1 на локус мишень предполагается, что взаимодействие между PRC1 и метилированным H3K27 облегчает внутрилокусное петлеобразование, приводящее в контакт PRE-связанные комплексы с телами замалчиваемых генов^{31, 42} (Fig. 3b). Такое петлеобразование д. способствовать дальнейшей потере метилированных H3K27 по всему локусу и/или приведению PcG комплексов в близкое соседство с затрудняющими RNA polymerase.

Недавно роль метилированных H3K27 в рекрутировании PRC1 была исследована^{103, 104}. Важно, что эти исследования манипулировали с уровнями метилированных H3K27 без непосредственного нарушения PRC2. В одном исследовании использовали нокдаун H3K27 demethylase UTX (также известной как Lys-specific demethylase 6A) в клетках человека¹⁰³. Возникающее в результате увеличение уровней H3K27me2 и H3K27me3 в Hox промоторах сопровождалось усилением рекрутирования PRC1. Во втором исследовании использовали гетерологичную вирусную methyltransferase, v-SET, чтобы высвобождать метилированные H3K27 в месте PRC2 (Ref. 104). В этом случае v-SET-катализированное метилирование H3K27 могло восстанавливать доставку PRC1 на Hox промотор человека. Т.о., оба исследования указывают на то, что PRC1 следует за метилированием H3K27 in vivo.

Сумма доказательств указывает на то, что H3K27me3 служит в качестве одного из детерминантов связывания PRC1 с хроматином. Т.к. экспериментально сложно отличить инициальное прибытие PRC1 от последующей стабилизации в локусе, то кинетические и механистические вопросы остаются нерешенными до следующих исследований. Учитывая, что существует множество геномных сайтов, которые накапливают PRC2, но не PRC1 (Ref. 55) и поэтому мало примеров накопления PRC1 без PRC2 (Refs 100,101), то наипростейшим мнением может быть, что метилированные H3K27 часто вносят вклад, но недостаточный, чтобы доставлять PRC1. Вряд ли существует универсальный механизм рекрутирования PRC1 для всего генома, этот механизм д. варьировать на разных мишенях. Более того использование метилирования H3K27в рекрутировании PRC1 и в формировании внутрилокусной петли (Fig. 3a,b) не являются взаимоисключающими. Т.о., метилированные H3K27 д. помогать привлекать PRC1 , а также переконфигурировать локальный хроматин.

PRC2 functions beyond H3K27 methylation. исследования с EZH1, как показано выше, показали, что PRC2 функционируют и помимо энзиматической активности. В самом деле, PRC2-EZH1-обуслолвенная репрессия транскрипции in vitro происходит даже с мутационо испорченными SET доменами⁸⁶.

Недавно идентифицирована функция PRC2 по рекрутированию H3K4 demethylase на гены мишени¹⁰⁵. Баланс между активирующим метилированием H3K4 и репрессивным метилированием H3K27 может рассматриваться как реостат, который настраивает экспрессию генов мишеней¹⁰⁶. Т.о., надежное молчание обеспечивается использованием триметилирования H3K27 одновременно с деметилированием H3K4me3. PRC2 доставка на retinol-binding protein 2 (RBP2) H3K4 demethylase¹⁰⁵ доказывается следующим: совпадение распределений PRC2 и RBP2 в совместно оккупированных промоторах, потеря RBP2 с мишеней после нокдауна PRC2 и отслеживание RBP2 с эктопически расположенным PRC2. Хотя они функционально связаны, но взаимодействия PRC2-RBP2 могут быть временными, т.к. RBP2 биохимически не ведет себя как стержневая PRC2 субъединица и и ранее не определялся в очищенных PRC2 мух и человека. Эти находки подчеркивают, что PRC2 является мультифункциональным координатором изменений хроматина. При существовании столь многих подвижных частей в ландшафте хроматина открытие ещё большего вклада PRC2 не д. быть сюрпризом.

Многофункциональные PRC2 могут также влиять на то, как некоторые организмы, такие как растения и черви, могут достигать молчания с помощью PRC2 несмотря на очевидное отсутствие PRC1 (Ref. 32). Если единственная версия PRC2 может метилировать H3K27 (Ref. 70), координировать деметилирование H3K4¹⁰⁵ и компактизировать хроматин⁸⁶, тогда он один может осуществлять молчание в некоторых контекстах. Альтернативно, имеется множество дивергентных факторов у этих организмов, которые обладают PRC1-подобными функциями¹⁰⁷.