Посещений:
РЕЦЕПТОРЫ РЕТИНОЕВОЙ КИСЛОТЫ

Функция

Function of retinoic acid receptors during embryonic development
Manuel Mark, Norbert B. Ghyselinck, and Pierre Chambon
Nucl Recept Signal. 2009; 7: e002. | doi: 10.1621/nrs.07002. PMCID: PMC2670431

Retinoids, the active metabolites of vitamin A, regulate complex gene networks involved in vertebrate morphogenesis, growth, cellular differentiation and homeostasis. Studies performed in vitro, using either acellular systems or transfected cells, have shown that retinoid actions are mediated through heterodimers between the RAR and RXR nuclear receptors. However, in vitro studies indicate what is possible, but not necessarily what is actually occurring in vivo, because they are performed under non-physiological conditions. Therefore, genetic approaches in the animal have been be used to determine the physiological functions of retinoid receptors. Homologous recombination in embryonic stem cells has been used to generate germline null mutations of the RAR- and RXR-coding genes in the mouse. As reviewed here, the generation of such germline mutations, combined with pharmacological approaches to block the RA signalling pathway, has provided genetic evidence that RAR/RXR heterodimers are indeed the functional units transducing the RA signal during prenatal development. However, due to (i) the complexity in “hormonal” signalling through transduction by the multiple RARs and RXRs, (ii) the functional redundancies (possibly artefactually generated by the mutations) within receptor isotypes belonging to a given family, and (iii) in utero or early postnatal lethality of certain germline null mutations, these genetic studies have failed to reveal all the physiological functions of RARs and RXRs, notably in adults. Spatio-temporally-controlled somatic mutations generated in given cell types/tissues and at chosen times during postnatal life, will be required to reveal all the functions of RAR and RXR throughout the lifetime of the mouse.

Табл.1 Postnatal manifestations of germline ablation of Rar and Rxr genes.

Табл.2 Abnormalities of the fetal vitamin A deficiency (VAD) syndrome (Wilson et al., 1953) present in Rarb-null mutants (A?), Rxra-null mutants and in compound Rarα/β-, Rarα/γ- and Rarβ/γ-null mutants

Табл.3 Abnormalities absent from the fetal vitamin A deficiency (VAD) syndrome are found in Rara-, Rarb- and Rarg-null mutants (Aα, Aβ, Aγ), and in compound Rarα/β-, Rarα/γ- and Rarβ/γ-null mutants (

Табл.4 Evidence that RXRα and RAR act synergistically in embryonic development.

Клинические находки и экспериментальные подходы выявили, что витамин A (retinol) и его активные производные (т.e., retinoids) вызывают широкий круг эффектов на формообразование тела эмбриона позвоночных и органогенез, тканевой гомеостаз, клеточную пролиферацию, дифференцировку и апоптоз (rev. [Blomhoff, 1994; Kastner et al., 1995; Mark et al., 2006; Morriss-Kay and Ward, 1999; Sporn et al., 1994]). После первой демонстрации Hale's, что vitamin A-deficiency (VAD) вызывает врожденные уродства глаз [Hale, 1933], Warkany с сотр. показали, что огромный массив врожденных уродств касается глаз, сердца, дыхательной и мочеполовой системы (обозначаемых суммарно как VAD синдром) возникает у плодов у vitamin A-deficient (VAD) крыс (rev. [Wilson et al., 1953]). Позднее было показано, что retinoic acid (RA) д. заместить vitamin A во время эмбриогенеза, по крайней мере на определенных стадия и в определенных органах [Dickman et al., 1997; White et al., 1998].
Как RA может осуществлять такие плейотропные эффекты. Ответ был получен с открытием двух классов RA-связывающих транскрипционных регуляторов, retinoic acid receptors (множественных изоформ из RARα, β иγ изотипов), и retinoid X receptors (множественных изоформа из RXRα, β и γ изотипов) (rev. [Chambon, 1996; Leid et al., 1992].

RARs and RXRs are instrumental to retinoic acid signalling during embryonic development


Передача сигналов посредством RARs необходима для формирования эмбрионального паттерна и органогенеза. Rarα, Rarβ, and Rarγ нулевые мутантные мыши жизнеспособны. Они обнаруживают некоторые аспекты фетального (и постнатального) VAD синдромов, а также немногие дополнительные врожденные уродства (Table 1). Однако их аномалии ограничены субнабором тканей, обычно экспрессирующих эти рецепторы, это возможно отражает существование функционального перекрывания между RARs (discussed in [Kastner et al., 1995; Kastner et al., 1997a; Mark and Chambon, 2003; Mark et al., 1995; Mascrez et al., 1998]). Чтобы проверить эту гипотезу получены мутанты, лишенные двух RAR изотипов (Rarα/β-, Rarα/γ- и Rarβ/γ-нулевые мутанты), или некоторых изоформ, принадлежащих к разным изотипам. Ради ясности, только аномалии, выявляемые у двойных нулевых мутантов, лишенных нескольких RAR изотипов (все изоформы делетированы) представлены в Table 2 и Table 3. Сходные аномалии, хотя часто и менее выраженные у "isoform-specific" двойных нулевых мутантов представлены у [Kastner et al., 1995] (мутанты, лишенные RARα1/RARβ2/4, RARα1/RARγ, RARα1α2+/-/RARγ and RARβ2/4/RARγ), у [Subbarayan et al., 1997] (мутанты, лишенные RARα/RARγ1 and RARβ/RARγ2), у [Luo et al., 1996] (мутанты, лишенные RARα1/RARβ), у [Ghyselinck et al., 1998] (мутанты, лишенные RARα/RARβ1/3 и RARβ1/3/RARγ) и у [Grondona et al., 1996] (мутанты, лишенные RARβ2/RARγ2).
Rarα/β-, Rarα/γ- и Rarβ/γ-нулевые мутанты погибали in utero или при рождении из-за тяжелых дефектов развития, которые в целом включали полный набор уродств, относящихся к плодному VAD-индуцированному синдрому, описанному Warkany's группой 55 лет тому назад [Wilson et al., 1953] (Table 2). Как и Rar-одиночные нулевые мутанты (see Table 1), Rar-двойные нулевые мутанты (Table 3) также обнаруживали врожденные аномалии, которые не были описаны в пионерских исследованиях Hale's и Warkany's плодных VAD [Hale, 1933; Wilson et al., 1953], касающиеся агенеза гардеровых желез, дефектов скелета черепа, лица, позвонков, конечностей и переднего мозга [Ghyselinck et al., 1997; Lohnes et al., 1993; Lohnes et al., 1994; Luo et al., 1996; Mendelsohn et al., 1994; Subbarayan et al., 1997]. Появление этих "non-VAD" дефектов у Rar-одиночных и двойных нулевых мутантных мышей в основном возможно объясняется трудностями достижения с помощью пищевой депривации состояния выраженного VAD, сравнимого с беременностью. Фактически почти все эти "non-VAD" дефекты были впоследствии вызваны у эмбрионов грызунов (i) дефицитом vitamin A, но с добавлением RA [Dickman et al., 1997; White et al., 2000; White et al., 1998]; (ii) дефицитом как RBP (retinol-binding protein) , так и vitamin A [Quadro et al., 2005]; (iii) отсутствием retinaldehyde синтезирующего энзима RDH10 (retinol dehydrogenase 10) [Sandell et al., 2007]; (iv) отсутствием RA синтезирующего энзима RALDH2 (retinaldehyde dehydrogenase 2) [Halilagic et al., 2007; Molotkova et al., 2007; Niederreither et al., 2002a; Niederreither et al., 1999; Niederreither et al., 2001; Niederreither et al., 2000; Niederreither et al., 2002b; Ribes et al., 2006] или RALDH3 [Dupe et al., 2003; Halilagic et al., 2007] или (v) обработкой синтетическими retinoids, обладающими panRAR антагонистической активностью [Kochhar et al., 1998; Wendling et al., 2000; Wendling et al., 2001]. Кроме того, недавно было установлено, что Matthew-Wood синдром, который согласуется со спектром врожденных аномалий, также наблюдаемым у Rarα/β, Rarα/γ and Rarβ/γ-нулевых мутантов, вызывается мутациями в RBP рецепторном гене, STRA6 [Golzio et al., 2007; Pasutto et al., 2007]. Т.к. мутации потери функции STRA6 скорее всего вызывают состояние RA недостаточности в эмбриональных тканях [Kawaguchi et al., 2007], то это открытие предоставляет доказательства того, что передача сигналов RAR осуществляет сходные функции во время эмбрионального развития у мышей и людей.
Сравнение фенотипов Rar-нулевых мутантов с таковыми у грызунов и людей, несущих упомянутый выше блок сигнальной трансдукции RA, демонстрирует, что связанные с лигандом RARs играют критическую роль на многих разных стадиях развития многочисленных органов ([Kastner et al., 1995] and references therein). Напр., тяжелые уродства, обнаруживаемые у Rarα/γ-нулевых эмбрионов [Wendling et al., 2001], сходны с теми, что у Aldh1a2 (первоначально Raldh2)-нулевых эмбрионов [Niederreither et al., 1999], и отражают ранние роли передачи сигналов RAR в аксиальной ротации, сегментации и закрытии заднего мозга, формировании отоцистов, фарингеальных дуг и зачатков передних конечностей, а также в закрытии примитивной кишки. RARs таже необходимы для онтогенеза (почти) всех анатомических структур, которые происходят из мезодермальных клеток, т.е. краниальной части neural crest cells (NCC), которые дают мезенхимные производные (rev. [Kastner et al., 1995; Mark et al., 1998; Mark et al., 1995]). RARs участвуют в формировании передне-заднего паттерна сомитной мезодермы и нейроэктодермы заднего мозга [Dupe et al., 1999b; Ghyselinck et al., 1997; Lohnes et al., 1993; Lohnes et al., 1994; Wendling et al., 2001], скорее всего посредством контроля экспрессии гомеобоксных генов [Allan et al., 2001; Dupe et al., 1997; Dupe et al., 1999b; Houle et al., 2000; Oosterveen et al., 2003; Serpente et al., 2005]. RARs также участвуют в установлении передне-задней оси конечностей [Dupe et al., 1999a; Lohnes et al., 1994; Mascrez et al., 1998]. RARs необходимы для развития большого количества глазных структур (Table 2 and Table 3) и для гистогенеза сетчатки [Ghyselinck et al., 1997; Grondona et al., 1996; Lohnes et al., 1994], дифференцировки кардиомиоцитов [Kastner et al., 1994; Kastner et al., 1997b], а также для контроля физиологического апоптоза в сетчатке [Grondona et al., 1996], в фронтоназальной и межпальцевой мезенхиме [Crocoll et al., 2002; Dupe et al., 1999a; Ghyselinck et al., 1997; Lohnes et al., 1994], conotruncal сегменте эмбрионального сердца [Ghyselinck et al., 1998] и эмбриональных нефрических протоков [Batourina et al., 2005]. В эмбриональном мочеполовом тракте, RARs контролируют эпителиально-мезенхимные взаимодействия в почках посредством экспрессии рецепторной тирозин киназы Ret [Batourina et al., 2002; Batourina et al., 2001; Mendelsohn et al., 1999], а также образование генитальных протоков и мочеточников [Batourina et al., 2001; Batourina et al., 2005; Ghyselinck et al., 1997; Mendelsohn et al., 1994]. В развивающемся респираторном тракте, связанные с RA лигандом RARs необходимы для морфогенеза носовых полостей и для их коммуникаций с более каудальными частями воздушных путей [Dupe et al., 2003; Ghyselinck et al., 1997] (Table 2 and Table 3). RA-liganded RARs также необходимы для расщепления примитивной передней кишки на пишевод и трахею и регулируют морфогенез ветвления в легких [Chen et al., 2007; Desai et al., 2006; Malpel et al., 2000; Mollard et al., 2000; Wang et al., 2006], а также разделение на камеры легочных альвеол [Massaro and Massaro, 2003; Massaro et al., 2003; Massaro et al., 2000; McGowan et al., 2000] (Table 1, Table 2, and Table 3).
Хотя аномалии развития у Rar-нулевых мутантных мышей в точности воспроизводят таковые у грызунов, лишенных RAR лиганда или из-за пищевой депривации витамина А или генетически нарушенного синтеза RA. Существуют, однако, два примечательных исключения из этого правила, которые связаны с контролем посредством передачи сигналов RA, (i) симметрия формирования паттерна сомитов и (ii) дифференцировка зародышевых клеток в овариях эмбрионов. Относительно сомитогенеза, первоначально было установлено у нескольких видов позвоночных, что RA служит средством для генерации билатерально симметричных пар сомитов [Echeverri and Oates, 2007; Kawakami et al., 2005; Sirbu and Duester, 2006; Vermot and Pourquie, 2005]. Недавно было также продемонстрировано, что передача сигналов с помощью RA необходима для экспрессии Stra8 (stimulated by retinoic acid 8), который, в свою очередь, запускает мейоз в эмбриональных овариях [Baltus et al., 2006; Bowles et al., 2006; Koubova et al., 2006]. Однако дефекты в симметрии производных сомитов, таких как позвонки и мышцы или в гистологии яичников никогда не наблюдались у Rarα/β-, Rarα/γ- и Rarβ/γ-нулевых мутантных мышей. Как упоминалось выше, кажущееся отсутствие фенотипической конвергенции между животными моделями, лишенными RA и теми, что лишены RARs, является возможно следствием искусственной компенсации функций RARs, которые отсутствуют у нокаутных мышей, за счет оставшихся.

RARs have been instrumental to the phylogenesis of mesectodermal derivatives


В дополнение к драматическим черепно-лицевым скелетным нехваткам, возникающим у Rarα/γ-нулевых мутантов [Lohnes et al., 1994], наблюдаются незначительные дефекты, которые часто изменяют форму одиночных кусочков скелета у некоторых Rar-нулевых мышей, включая: хрящевые или костные соединения между наковальней костей среднего уха и alisphenoid косточкой (элементом pterygoquadrate), хрящевое отделение тройничного ганглия от головного мозга (pila antotica) и агенез рострального ethmoturbinate и maxillary синуса (Table 3) [Ghyselinck et al., 1997; Lohnes et al., 1994; Mark et al., 1998]. Элемент pterygoquadrate и pila antotica, которые были потеряны в ходе эволюции от рептилий к млекопитающим, представляют собой атавистические признаки (discussed in [Mark et al., 1998; Mark et al., 1995]). Точно также ethmoturbinate косточки и paranasal синусы (такие как maxillary синус) являются типичными признаками млекопитающих, которые отсутствуют у рептилий [Novacek, 1993]. Поэтому вполне возможно, что агенез носовых структур у Rar-нулевых мутантов также воспроизводит атавистические признаки. Присутствие атавистических характеристик у Rar-нулевых мутантов подтверждает возможность того, что изменения во временном и пространственном паттернах экспрессии Rar генов представляют собой генеральный механизм модификации количества и формы индивидуальных краниальных скелетных элементов во время эволюции позвоночных. Интересно, что недавние тератогенные эксперименты с использованием RA в избытке привели к сходным выводам [Vieux-Rochas et al., 2007].
Персистирующие и гиперпластичные vitreous body (PHPV), обнаруживаемые у Rarβ-нулевых мутантов сравнимы с pecten oculi, обычными сосудистыми и пигментными проекциями из оптического диска, обнаруживаемыми у некоторых рептилий, некоторые, как полагают, участвуют в питании сетчатки [Mann, 1937]. Укорочение вентральной части сетчатки, наблюдаемое у Rarβ/γ-нулевых мутантов также можно интерпретировать как модификацию в направлении родоначального состояния, т.к. сравнительная эмбриология сетчатки показывает, что вентральная часть поля сетчатки увеличивается в размерах при переходе от рыб к амфибиям, рептилиям и млекопитающим [Mann, 1937]. Т.о., RARβ и RARγ могут служить средством в экспансии вентрального поля сетчатки во время эволюции позвоночных.

RXRα is the main RXR isotype involved in embryogenesis


Rxrα-нулевые мутанты все обнаруживают гипоплазию компактного слоя миокарда желудочков (Table 2), которая является основной причиной гибели мутантов из-за сердечной недостаточности примерно на ст. E14.5 [Kastner et al., 1994; Kastner et al., 1997b; Ruiz-Lozano et al., 1998; Sucov et al., 1994]. Сходный дефект миокарда обнаруживается при VAD и у Rar-нулевых плодов [Mendelsohn et al., 1994; Wilson et al., 1953], указывает на то, что RXRα участвует в трансдукции RA сигнала, необходимого для роста миокарда. Эта потребность вряд ли является клеточно автономной, т.к. избыточная экспрессия RXRα в кардиомиоцитах посредством трансгенеза, не предупреждает Rxrα-нулевой мутацией индуцированную гипоплазию вентрикулярного миокарда [Subbarayan et al., 2000]. Др. данные также указывают на то, что экспрессия Rxrα в эпикарде необходима для запуска паракринных сигналов, необходимых для роста миокарда [Chen et al., 2002; Kang and Sucov, 2005; Merki et al., 2005].
Примерно треть Rxrα-нулевых мутантов лишены conotruncal перегородки, которая обычно подразделяет тракт оттока эмбрионального сердца (или conotruncus) на внутрикардиальную часть аорты и пульмональный ствол [Kastner et al., 1994]. Интересно, что дефицит этой перегородки присутствует как в классических VAD дефектах у грызунов, так и является ведущей причиной врожденных дефектов сердца у людей, варьируя от значительных внутривентрикулярных дефектов перегородки до двойного выхода в правый желудочек (double outlet right ventricle (DORV)). У Rxrα-нулевых мутантов агенез конотрункальной перегородки появляется вторично по отношению к усилению скорости клеточной гибели как мезенхимных клеток конотрункального грабня, так и parietal конотрункальных кардиомиоцитов, указывая тем самым, что RXRα необходим для трансдукции RA сигнала, который контролирует апоптоз в конотрункальном сегменте эмбрионального сердца [Ghyselinck et al., 1998].
Помимо дефектов сердца все Rxrα-нулевые плоды обнаруживают характерный окулярный синдром с PHPV, закрытием складок век, утолщением вентральной части стромы роговицы, вентральной ротацией хрусталика и агенезом склер и укорочением вентральной части сетчатки (Table 2) [Kastner et al., 1994]. Т.к. сходные дефекты присутствуют у VAD плодов и у Rarβ/γ-нулевых мутантов (Table 2) [Ghyselinck et al., 1997; Wilson et al., 1953], то RXRα, по-видимому, играет существенную роль в трансдукции RA сигналов, необходимых для некоторых глазных морфогенетических процессов, особенно формирования вентральной части поля сетчатки.
Важен тот факт, что мыши, лишенные RXRβ and RXRγ (Rxrβ/γ-нулевые мутанты) не обнаруживают каких-либо очевидных морфогенетических дефектов, даже когда дополнительно отсутствует один аллель Rxrα, это четко указывает на то, что RXRα функционально наиболее важный RXR во время морфогенеза собственно эмбриона [Krezel et al., 1996].

The AF-1-containing A/B domain and the ligand-dependent AF-2 of RXRα are differentially involved in development


Роль, выполняемая RXRs в качестве или "active" или "silent" партнеров гетеродимеризации, в транскрипции генов мишеней, став ясной в in vitro исследованиях, оказалась дискуссионной. Чтобы установить роль в транскрипции RXRα in vivo, мутантные мыши были преобразованы, так что экспрессировали укороченные RXRα белки, лишенные (i) N-терминальной активационной функции (AF)-1-containing α/β региона (Rxrαaf1o мутанты) [Mascrez et al., 2001], (ii) AF-2 activating domain (AD) core-containing helix 12, локализованного на С-конце E региона (Rxrαaf2o мутанты) [Mascrez et al., 1998] и (iii) обоих AF-1 и AF-2 (Rxrαafo мутанты) [Mascrez et al., 2009].
The Rxrαaf2o мутанты обнаруживают гипоплазию миокарда и окулярный синдром, которые являются характерными признаками Rxrα-нулевого фенотипа [Kastner et al., 1994], но с низкой частотой [Mascrez et al., 1998]. Это может отражать функциональную компенсацию с помощью RXRβ, т.к. (i) частота гипоплазии миокарда увеличивается с 5% у Rxrαaf2o мутантов до 50% после дополнительной инактивации Rxrβ (который сам по себе не оказывает эффекта) [Kastner et al., 1996], и (ii) частота окулярного синдрома увеличивается с ~ 15% e Rxrαaf2o мутантов до 100% после дополнительной инактивации Rxrβ [Mascrez et al., 1998]. Полная пенетрантность Rxrα-нулевого окулярного синдрома, наблюдаемая у Rxrαaf2o/Rxrβ-нулевых мутантов [Mascrez et al., 1998], также как и у Rxrαafo мутантов [Mascrez et al., 2009], подтверждает мнение, что AF-2 из RXRα (и возможно RXR лиганд агонист) обязателен для окулярного морфогенеза. С др. стороны, редкая или скромная пенетрантность гипоплазии миокарда у Rxrαaf2o (5%), а у Rxrαaf2o/Rxrβ-нулевых (50%) и Rxrαaf2o/Rxrβ/γ-нулевых мутантов (50%) указывает на то. что транскрипционная активность RXRα становится необходимой для роста миокарда только на "неблагоприятном" генетическом фоне. Было установлено, что гистология сердца нормальна у 80% Rxrαafo плодов [Mascrez et al., 2009], указывая тем самым, что транскрипционно "молчащий" RXRα может способствовать миокардиальному росту.
Инволюция первичного стекловидного тела представляет процесс развития, который скорее всего нуждается в наивысших концентрациях RA-liganded ретиноидных рецепторов, т.к. VAD [Wilson et al., 1953], устранение Rarβ [Ghyselinck et al., 1997], устранение Rxrα [Kastner et al., 1994], делеция RXRα AF-2 [Mascrez et al., 1998] и делеция RXRα AF-1 и AF-2 [Mascrez et al., 2009] часто дают PHPV. Не говоря о случайных PHPV, мутанты Rxrαaf1o никогда не обладают какими-либо Rxrα-нулевыми дефектами развития [Mascrez et al., 2001]. Такое почти отсутствие дефектов не отражает компенсацию за счет RXRβ или RXRγ, т.к. Rxrαaf1o/Rxrβ-нулевые и Rxrαaf1o/Rxrβ/γ-нулевые мутанты не обладают онтогенетическими дефектами, иными чем PHPV. Однако частота таких PHPV увеличивается с 10% у Rxrαaf1o мутантов до 100% у Rxrαaf1o/Rxrβ/γ-нулевых мутантов [Mascrez et al., 2001]. Хотя эти наблюдения указывают на то, что инволюция первичного стекловидного тела нуждается как в RXRα AF-1, так и в AF-2, тогда как др. RA-зависимые морфогенетические события нуждаются только в RXRα AF-2, т.к. они обычно возникают в отсутствии RXRα AF-1-содержащего A/B домена.
Т.о., эти данные подтверждают мнение, что активация функций RXRα дифференциально необходима для морфогенеза глаз и что они могут быть необязательны для развития сердца. Они также указывают на то, что обусловленная функциональным перекрыванием выполняемая роль каждой функции активации может быть выявлена только не генетических фонах мало пригодных для передачи сигналов RA (или в условиях RA-недостаточности). Если предположить, что часто потребность в RXRα AF-2 для онтогенетических событий отражает связывание лиганда агониста, то возникает вопрос о возможности существования и природе физиологических RXR лиганда(ов) in vivo. Тот факт, что 9-cis RA необнаружима у эмбрионов грызунов [Horton and Maden, 1995; Matt et al., 2005b], ставит под сомнение, что этот RXR физиологический лиганд может быть 9-cis RA (rev. [Wolf, 2006]; see also [Calleja et al., 2006]).

The RXRα AF-1-containing A/B domain has a specific function in the involution of the interdigital mesenchyme


AF-2 из RXRα , по-видимому, функционально более важен во время развития, чем его AF-1, т.к. (i) Rxrαaf2o/Rxrβ/γ-нулевые плоды все обнаруживают большой набор врожденных дефектов и погибают in utero, тогда как Rxrαaf1o/Rxrβ/γ-нулевые плоды обнаруживают лишь немногие врожденные дефекты и часто жизнеспособны; и (ii) транскрипция RA-чувствительного lacZ репортерного трансгена у мышей нуждается в RXRα AF-2, но не в AF-1 [Mascrez et al., 1998; Mascrez et al., 2001]. Однако RXRα AF-1-содержащий A/B регион обладает уникальной ролью в RA-зависимом исчезновении межпальцевой мезенхимы.
Первые доказательства участия RA в инволюции межпальцевой мезенхимы были предоставлены путем экспериментов с органной культурой с использованием целых конечностей в RA-лишенной среде [Lussier et al., 1993]. Далее было показано, что мыши, лишенные обоих аллелей, или Rarα или Rarγ, также как и мыши, гетерозиготные по Rxrα-нулевой мутации, изредка обнаруживают слабые формы межпальцевых складок (webbing) (т.e., синдактилия мягких тканей) (Table 1) [Ghyselinck et al., 1997; Kastner et al., 1994; Lohnes et al., 1993; Lufkin et al., 1993]. Неожиданно этот дефект отсутствовал у Rarβ-нулевых мутантов, несмотря на то, что Rarβ строго и специфически экспрессируется interdigital necrotic zones (INZs) [Ghyselinck et al., 1997]. Однако разрушение одного(или обоих) аллелей Rarβ на Rarγ-нулевом генетическом фоне существенно увеличивает образование межпальцевых складок [Ghyselinck et al., 1997]. Персистенция плодной межпальцевой мезенхимы, отвечающая за образование межпальцевых складок, вызывается заметным снижением запрограммированной клеточной гибели, также как и увеличением пролиферации клеток в мутантных INZs [Dupe et al., 1999a]. Т.к. Rarβ и Rarγ не ко-экспрессируются в INZs, то инволюция межпальцевой мезенхимы д. использовать паракринные взаимодействия между этой мезенхимой, которая экспрессирует Rarβ, и любой хрящевой бластемой пальцев или поверхностным эпидермисом, которые экспрессируют Rarγ (discussed in [Dupe et al., 1999a]).
RXRα AF-1-содержащий A/B регион обязателен для функционирования RXRα/RARβ и/или RXRα/RARγ гетеродимеров, используемых для инволюции межпальцевой мезенхимы, т.к. большинство Rxrαaf1o мутантов и все Rxrαaf1o/Rxrβ/γ-нулевые мутанты обнаруживают синдактилию мягких тканей [Mascrez et al., 2001]. Напротив, Rxrαaf2o и Rxrαaf2o/Rxrβ/γ-нулевые мутанты никогда не обнаруживают подобного дефекта [Mascrez et al., 1998], указывая тем самым на специфическую потребность в RXRα AF-1-containing A/B; регионе для инволюции межпальцевой мезенхимы. Интересно, что фосфорилирование RXR? по специфическому serine остатку, расположенному в A домене, необходимо для анти-пролиферативной реакции клеток F9 teratocarcinoma на RA [Bastien et al., 2002; Rochette-Egly and Chambon, 2001]. Фосфорилирование RXRα A домена может, следовательно, выполнять важную функцию в каскаде молекулярных событий, которые in vivo ведут к обычному исчезновению межпальцевой мезенхимы.

Retinoic acid signals are transduced by specific RXRα/RAR heterodimers during development


Компаундные мутанты, у которых нулевая мутация данного RAR изотипа ассоциирует или с Rxrα-null, Rxrαaf1o или Rxrαaf2o мутацией в целом воспроизводят аномалии, обнаруживаемые у Rar-нулевых мутантов (Table 4) [Kastner et al., 1994; Kastner et al., 1997a; Mascrez et al., 1998; Mascrez et al., 2001]. Такой синергизм между мутациями потери функции Rar и Rxrα подтверждает заключение, что RXRα/RARα, RXRα/RARβ и RXRα/RARγ гетеродимеры являются функциональными единицами, передающими RA сигналы во время эмбриогенеза. Более того, Rxrβ/γ-нулевые мутанты развиваются нормально, указывая тем самым, что RXRα функционально наиболее важный RXR изотип во время развития [Krezel et al., 1996]. Это подтверждается отсутствием синергизма во время эмбриогенеза между Rarα-, Rarβ- или Rarγ-нулевыми мутациями и Rxrβ- или Rxrγ-нулевыми мутациями [Kastner et al., 1997a].
Сравнение тяжести и пенетрантности данной аномалии между разными мутантами привело к идентификации гетеродимеров, преимущественно участвующих в трансдукции сигналов RA в данном процессе развития. Напр., гипоплазия миокарда не обнаружена ни у одного Rxrαaf1o мутантов и только в 5% у Rxrαaf2o мутантов. Она наблюдается в 45% у Rxrαaf1o/Rarα-нулевых и в 80% у Rxrαaf2o/Rarα-нулевых мутантов, но ни у одного Rxrαaf1o/Rarβ-null или Rxrαaf1o/Rarγ-нулевых мутантов и только в 20% у Rxrαaf2o/Rarβ- нулевых или Rxrαaf2o/Rarγ-нулевых мутантов [Mascrez et al., 1998; Mascrez et al., 2001]. Итак, эти данные указывают на то, что RXRα/RARα гетеродимеры преимущественно передают RA сигнал, влияя на рост миокарда.
Сходным образом, хотя все три RARs экспрессируются в развивающихся глазных структурах [Mori et al., 2001], несколько линий доказательств указывают на вовлечение RXRα/RARβ и RXRα/RARγ но не RXRα/RARα гетеродимеров во время морфогенеза глаз. Во-первых, имеется строгий синергизм между Rxrα- и Rarβ- или Rarγ-нулевыми мутациями, который проявляется в заметном увеличении тяжести Rxrα-нулевых глазных дефектов, тогда как не обнаруживается синергизма с Rarα-нулевыми мутациями (Table 4) [Kastner et al., 1997a]. Во-вторых, имеется также строгий синергизм между Rarβ- или Rarγ-нулевыми мутациями и устранением или AF-1-содержащего A/B домена или AF-2 из RXRα в отношении генерации глазных дефектов (Table 4) [Mascrez et al., 1998; Mascrez et al., 2001]. Фактически, не говоря уже о PHPV рассмотренного выше, характерный Rxrα-нулевой окулярный синдром никогда не наблюдается у Rxrαaf1o мутантов и обнаруживается менее чем в 15% у Rxrαaf2o мутантов. C др. стороны, окулярный синдром обнаруживается в 100% у Rxrαaf1o/Rarβ-null, Rxrαaf1o/Rarγ-null, Rxrαaf2o/Rarβ-null и Rxrαaf2o/Rarγ-нулевых мутантов, тогда как он отсутствует у всех Rxrαaf1o/Rarα-null и Rxrαaf2o/Rarα-нулевых мутантов [Mascrez et al., 1998; Mascrez et al., 2001]. Следовательно, эти генетические данные указывают на то, что RXRα/RARβ и RXRα/RARγ являются гетеродимерами, которые служат средством морфогенеза глаз.

Pharmacological and somatic mutagenesis approaches provide clues on RAR-controlled mechanisms operating in the head region during development


Энтодерма бранхиальных дуг является мишенью для действия RA, опосредованного с помощью RARα и/или RARβ
Rarα/β-нулевые мутанты, проанализированные на плодной стадии, обнаруживают полный набор дефектов, которые могут быть генерированы у кур хирургическим удалением post-otic NCC, а именно агенез или эктопии тимуса и паратироидных желез, абберрантное образование паттерна цефалических артерий, отсутствие легочных артерий и aorticopulmonary перегородки ([Ghyselinck et al., 1997; Mark et al., 1998; Mendelsohn et al., 1994]and references therein). Эти дефекты присутствуют также при CATCH22 синдроме, который является archetype neurocristopathy у человека (т.e., врожденных уродств структур, производных NCC). Эти и др. наблюдения ведут к предположению, что краниальные NCC , дающие мезенхимные производные (т.e., мезэктодермальные клетки) Являются главными мишенями действия RA (rev. [Mark et al., 2004]).
Неожиданно Rarα/β-нулевые мутанты, проанализированные на эмбриональных стадиях беременности, обнаруживали очень небольшие каудальные бранхиальные дуги (branchial arches (BA)), но не обнаруживали изменений в NCC [Dupe et al., 1999b]. BA являются временными выпячиваниями на эмбриональной голове и шее, частично заполненные NCC и отделенные одно от др. эвагинациями энтодермы, глоточными карманами. Каудальные BA и карманы дают взрослые органы, затрагиваемые в экспериментах по удалению NCC. Т.к. дефекты BA, наблюдаемые у Rarα/β-нулевых эмбрионов менее тяжелы, чем те, что у эмбрионов, лишенных RALDH2 (т.e., эмбрионов, лишенных RA) [Niederreither et al., 1999], они не отражают полного блокирования сигнальной трансдукции RA. Чтобы проанализировать миграцию NCC, а также образование BA и глоточных карманов в ситуации, когда степень блокирования передачи сигналов RA может быть точно контролируема, была разработана культуральная система, при которой эмбрионы дикого типа подвергали воздействию в избранные промежутки времени panRAR антагониста BMS493 [Wendling et al., 2000].
Воздействие BMS493 вызывает отсутствие каудальных BA и глоточных карманов и слегка нарушает пути post-otic миграции NCC, не влияя на количества NCC. Более того, что особенно интересно, воздействие ингибирует развитие каудальных BA только во время узкого временного промежутка, который не соответствует периоду post-otic миграции NCC. Т.о.. в противоположность тому, что ожидалось исходя из набора аномалий у Rarα/β-нулевых плодов [Dupe et al., 1999b], мигрирующие NCC, предназначенные для каудальных BA не представляют собой исключительные первичные мишени для действия RA. С др. стороны, BMS493-индуцированные отклонения в энтодермальной экспрессии "patterning" генов и генов, кодирующих пептиды, участвующие в путях паракринной передачи сигналов, указывают на то, что передача сигналов RA (i) необходима, чтобы специфицировать фарингеальную энтодерму, и (ii) и может создавать пермиссивные условия для миграции NCC посредством секреции специфических паракринных факторов фарингеальной энтодермой [Mark et al., 2004; Wendling et al., 2001]. Эти данные открывают также возможность, что гены, ответственные за синдром CATCH22 у человека, действительно экспрессируются в энтодерме под контролем RA во время четвертой и пятой недель беременности.

RARs act on top of a genetic cascade controlling hindbrain segmentation


Эмбриональный задний мозг временно подразделяется на сегменты (ромбомеры), из которых 7 (R1 to R7) видны у млекопитающих. Т.о., ранняя и временная сегментация заднего мозга является средством для организации взрослых структур, таких как краниальные нервы. Задний мозг Rarα/γ-нулевых эмбрионов обнаруживает заднюю экспансию маркеров R3 и R4, но неспособен экспрессировать kreisler, специфический маркер R5 и R6 [Wendling et al., 2001]. Напротив, нейроэктодермальные территории, соответствующие R5 и R6 заметно увеличены у Rarα/β-нулевых эмбрионов [Dupe et al., 1999b]. Обработка на эмбриональный день (E)7.0 эмбрионов дикого типа panRAR антагонистом BMS493 воспроизводит аномальный фенотип заднего мозга Rarα/γ-нулевых эмбрионов, тогда как применение BMS493, начиная с E8.0 дает Rarα/β-null-подобный фенотип [Wendling et al., 2000]. Следовательно, разные фенотипы у Rarα/β- и Rarα/γ-нулевых эмбрионов связаны с действием RA во время разных промежутков времени. На ст. E7.5 (когда начинается синтез RA у эмбрионов) [Niederreither et al., 1999], RARγ и RARα передают сигнал. необходимый для спецификации R5/R6 территории. На E8.0, RARβ и RARα обеспечивают локальное увеличение передачи сигналов RA в задней части заднего мозга, чтобы контролировать положение каудальной границы R6, тем самым делая возможным спецификацию следующего каудального ромбомера, R7 [Mark et al., 2004; Serpente et al., 2005; Wendling et al., 2000].
То, что домены экспрессии нескольких важных паттерн-формирующих генов заднего мозга изменяются у Rarα/β- и Rarα/γ-нулевых эмбрионов доказывает, что RA действует на вершине генетической иерархии, контролирующей формирование паттерна заднего мозга [Wendling et al., 2001]. Более того, генерация градированного блокирования передачи сигналов у эмбрионов RA посредством варьирующих концентраций panRAR антагониста в культурах, демонстрирует, что индивидуальные ромбомеры специфицируются при разных порогах передачи сигналов RA и подтверждает мнение, что RA действует как posteriorizing сигнал при формировании паттерна эмбрионального заднего мозга ([Dupe and Lumsden, 2001; Serpente et al., 2005; Wendling et al., 2001]and references therein). Пороговые уровни передачи сигналов RA могут быть созданы за счет модуляций уровней экспрессии RAR или RA-синтезирующих и катаболизирующих энзимов (RALDHs и CYP26s, соотв.) [Abu-Abed et al., 2001; MacLean et al., 2001; Niederreither et al., 2000; Tahayato et al., 2003; Uehara et al., 2007].

Retinoic acid-dependent eye morphogenesis is orchestrated by the neural crest


Как упоминалось выше, Rarβ/γ-, Rxrα/Rarβ- and Rxrα/Rarγ-нулевые мутанты, но не Rxrα/Rarα-нулевые мутанты, обнаруживают сходные, хотя и более тяжелые глазные дефекты, чем Rxrα-нулевые мутанты, указывая тем самым. что RXRα/RARβ и RXRα/RARγ гетеродимеры служат орудием морфогенеза глазных структур, включая вентральную часть сетчатки (Table 2, Table 3, and Table 4). Как Rarβ так и Rarγ экспрессируются в периокулярной мезенхиме (POM), но не в сетчатке [Ghyselinck et al., 1997; Mori et al., 2001]. Следовательно, передача сигналов RA в POM (ткани, производной NCC) может обеспечивать морфогенез сетчатки (в ткани, производной нейроэктодермы). Используя соматический мутагенез (reviewed in [Metzger and Chambon, 2001]), мы продемонстрировали, что избирательная эксцизия как Rarβ так и Rarγ генов в клетках предшественниках POM (Rarβ/γ NCCα/α мутанты) воспроизводит глазные дефекты, вызываемые устранением в зародышевой линии тех же самых рецепторных генов. В клетках POM , RXRα/RARβ и RXRα/RARγ гетеродимеры, по-видимому, контролируют степень клеточной гибели, участвующей в ремоделировании POM и экспрессии Foxc1 и Pitx2 генов [Matt et al., 2005a], которые играют критическую роль в развитии переднего глазного сегмента у мышей и людей [Cvekl and Tamm, 2004]. Интересно, что POM не экспрессирует каких-либо RA-синтезирующих энзимов (RALDHs), и , следовательно, неспособна синтезировать RA. Вместо этого нейральная сетчатка, пигментный эпителий сетчатки и эктодерма роговицы экспрессируют и RALDH1 и RALDH3 ([Matt et al., 2005a] and references therein). Тот факт, что у мутантов, лишенных и RALDH1 и RALDH3 (i) активность RA-чувствительных репортерных трансгенов исчезает из POM и (ii) и глазные дефекты, которые генерируются, воспроизводят дефекты, наблюдаемые у Rarβ/γ-нулевых мутантов, это указывает на то, что два RA-синтезирующих энзима предоставляют RA, необходимую, чтобы активировать RXRα/RARβ и RXRα/RARγ гетеродимеры в POM. Следовательно, в развивающемся глазу, RA действует как паракринный сигнал: она синтезируется эпителиальными компартментами (т.e., сетчаткой, пигментным эпителием сетчатки и эктодермой роговицы), но осуществляет свой эффект в мезенхимном компартменте (т.e., POM). Напротив, мезенхимный компартмент, по-видимому, отвечает на RA сигнал синтезом ещё неизвестного паракринного фактора, необходимого для роста вентральной части сетчатки Клинические находки и экспериментальные подходы выявили, что витамин A (retinol) и его активные производные (т.e., retinoids) вызывают широкий круг эффектов на фомообразование тела эмбриона позвоночных и органогенез, тканевой гомеостаз, клеточную пролиферацию, дифференцировку и апоптоз (rev. [Blomhoff, 1994; Kastner et al., 1995; Mark et al., 2006; Morriss-Kay and Ward, 1999; Sporn et al., 1994]). После первой демонстрации Hale's, что vitamin A-deficiency (VAD) вызывает врожденные уродства глаз [Hale, 1933], Warkany с сотр. показали, что огромный массив врожденных уродств касается глаз, сердца, дыхательной и мочеполовой системы (обозначаемых суммарно как VAD синдром) возникает у плодов у vitamin A-deficient (VAD) крыс (rev. [Wilson et al., 1953]). Позднее было показано, что retinoic acid (RA) д. заместить vitamin A во время эмбриогенеза, по крайней мере, на определенных стадия и в определенных органах [Dickman et al., 1997; White et al., 1998].
Как RA может осуществлять такие плейотропные эффекты. Ответ был получен с открытием двух классов RA-связывающих транскрипционных регуляторов, retinoic acid receptors (множественных изоформ из RARα, β иγ изотипов), и retinoid X receptors (множественных изоформа из RXRα, β и γ изотипов) (rev. [Chambon, 1996; Leid et al., 1992].

RARs and RXRs are instrumental to retinoic acid signalling during embryonic development


Передача сигналов посредством RARs необходима для формирования эмбрионального паттерна и органогенеза. Rarα, Rarβ, and Rarγ нулевые мутантные мыши жизнеспособны. Они обнаруживают некоторые аспекты фетального (и постнатального) VAD синдромов, а также немногие дополнительные врожденные уродства (Table 1). Однако их аномалии ограничены субнабором тканей, обычно экспрессирующих эти рецепторы, это возможно отражает существование функционального перекрывания между RARs (discussed in [Kastner et al., 1995; Kastner et al., 1997a; Mark and Chambon, 2003; Mark et al., 1995; Mascrez et al., 1998]). Чтобы проверить эту гипотезу получены мутанты, лишенные двух RAR изотипов (Rarα/β-, Rarα/γ- и Rarβ/γ-нулевые мутанты), или некоторых изоформ, принадлежащих к разным изотипам. Ради ясности, только аномалии, выявляемые у двойных нулевых мутантов, лишенных нескольких RAR изотипов (все изоформы делетированы) представлены в Table 2 и Table 3. Сходные аномалии, хотя часто и менее выраженные у "isoform-specific" двойных нулевых мутантов представлены у [Kastner et al., 1995] (мутанты, лишенные RARα1/RARβ2/4, RARα1/RARγ, RARα1α2+/-/RARγ and RARβ2/4/RARγ), у [Subbarayan et al., 1997] (мутанты, лишенные RARα/RARγ1 and RARβ/RARγ2), у [Luo et al., 1996] (мутанты, лишенные RARα1/RARβ), у [Ghyselinck et al., 1998] (мутанты, лишенные RARα/RARβ1/3 и RARβ1/3/RARγ) и у [Grondona et al., 1996] (мутанты, лишенные RARβ2/RARγ2).
Rarα/β-, Rarα/γ- и Rarβ/γ-нулевые мутанты погибали in utero или при рождении из-за тяжелых дефектов развития, которые в целом включали полный набор уродств, относящихся к плодному VAD-индуцированному синдрому, описанному Warkany's группой 55 лет тому назад [Wilson et al., 1953] (Table 2). Как и Rar-одиночные нулевые мутанты (see Table 1), Rar-двойные нулевые мутанты (Table 3) также обнаруживали врожденные аномалии, которые не были описаны в пионерских исследованиях Hale's и Warkany's плодных VAD [Hale, 1933; Wilson et al., 1953], касающиеся агенеза гардеровых желез, дефектов скелета черепа, лица, позвонков, конечностей и переднего мозга [Ghyselinck et al., 1997; Lohnes et al., 1993; Lohnes et al., 1994; Luo et al., 1996; Mendelsohn et al., 1994; Subbarayan et al., 1997]. Появление этих "non-VAD" дефектов у Rar-одиночных и двойных нулевых мутантных мышей в основном возможно объясняется трудностями достижения с помощью пищевой депривации состояния выраженного VAD, сравнимого с беременностью. Фактически почти все эти "non-VAD" дефекты были впоследствии вызваны у эмбрионов грызунов (i) дефицитом vitamin A, но с добавлением RA [Dickman et al., 1997; White et al., 2000; White et al., 1998]; (ii) дефицитом как RBP (retinol-binding protein) , так и vitamin A [Quadro et al., 2005]; (iii) отсутствием retinaldehyde синтезирующего энзима RDH10 (retinol dehydrogenase 10) [Sandell et al., 2007]; (iv) отсутствием RA синтезирующего энзима RALDH2 (retinaldehyde dehydrogenase 2) [Halilagic et al., 2007; Molotkova et al., 2007; Niederreither et al., 2002a; Niederreither et al., 1999; Niederreither et al., 2001; Niederreither et al., 2000; Niederreither et al., 2002b; Ribes et al., 2006] или RALDH3 [Dupe et al., 2003; Halilagic et al., 2007] или (v) обработкой синтетическими retinoids, обладающими panRAR антагонистической активностью [Kochhar et al., 1998; Wendling et al., 2000; Wendling et al., 2001]. Кроме того, недавно было установлено, что Matthew-Wood синдром, который согласуется со спектром врожденных аномалий, также наблюдаемым у Rarα/β, Rarα/γ and Rarβ/γ-нулевых мутантов, вызывается мутациями в RBP рецепторном гене, STRA6 [Golzio et al., 2007; Pasutto et al., 2007]. Т.к. мутации потери функции STRA6 скорее всего вызывают состояние RA недостаточности в эмбриональных тканях [Kawaguchi et al., 2007], то это открытие предоставляет доказательства того, что передача сигналов RAR осуществляет сходные функции во время эмбрионального развития у мышей и людей.
Сравнение фенотипов Rar-нулевых мутантов с таковыми у грызунов и людей, несущих упомянутый выше блок сигнальной трансдукции RA, демонстрирует, что связанные с лигандом RARs играют критическую роль на многих разных стадиях развития многочисленных органов ([Kastner et al., 1995] and references therein). Напр., тяжелые уродства, обнаруживаемые у Rarα/γ-нулевых эмбрионов [Wendling et al., 2001], сходны с теми, что у Aldh1a2 (первоначально Raldh2)-нулевых эмбрионов [Niederreither et al., 1999], и отражают ранние роли передачи сигналов RAR в аксиальной ротации, сегментации и закрытии заднего мозга, формировании отоцистов, фарингеальных дуг и зачатков передних конечностей, а также в закрытии примитивной кишки. RARs также необходимы для онтогенеза (почти) всех анатомических структур, которые происходят из мезодермальных клеток, т.е. краниальной части neural crest cells (NCC), которые дают мезенхимные производные (rev. [Kastner et al., 1995; Mark et al., 1998; Mark et al., 1995]). RARs участвуют в формировании передне-заднего паттерна сомитной мезодермы и нейроэктодермы заднего мозга [Dupe et al., 1999b; Ghyselinck et al., 1997; Lohnes et al., 1993; Lohnes et al., 1994; Wendling et al., 2001], скорее всего посредством контроля экспрессии гомеобоксных генов [Allan et al., 2001; Dupe et al., 1997; Dupe et al., 1999b; Houle et al., 2000; Oosterveen et al., 2003; Serpente et al., 2005]. RARs также участвуют в установлении передне-задней оси конечностей [Dupe et al., 1999a; Lohnes et al., 1994; Mascrez et al., 1998]. RARs необходимы для развития большого количества глазных структур (Table 2 and Table 3) и для гистогенеза сетчатки [Ghyselinck et al., 1997; Grondona et al., 1996; Lohnes et al., 1994], дифференцировки кардиомиоцитов [Kastner et al., 1994; Kastner et al., 1997b], а также для контроля физиологического апоптоза в сетчатке [Grondona et al., 1996], в фронтоназальной и межпальцевой мезенхиме [Crocoll et al., 2002; Dupe et al., 1999a; Ghyselinck et al., 1997; Lohnes et al., 1994], conotruncal сегменте эмбрионального сердца [Ghyselinck et al., 1998] и эмбриональных нефрических протоков [Batourina et al., 2005]. В эмбриональном мочеполовом тракте, RARs контролируют эпителиально-мезенхимные взаимодействия в почках посредством экспрессии рецепторной тирозин киназы Ret [Batourina et al., 2002; Batourina et al., 2001; Mendelsohn et al., 1999], а также образование генитальных протоков и мочеточников [Batourina et al., 2001; Batourina et al., 2005; Ghyselinck et al., 1997; Mendelsohn et al., 1994]. В развивающемся респираторном тракте, связанные с RA лигандом RARs необходимы для морфогенеза носовых полостей и для их коммуникаций с более каудальными частями воздушных путей [Dupe et al., 2003; Ghyselinck et al., 1997] (Table 2 and Table 3). RA-liganded RARs также необходимы для расшепления примитивной передней кишки на пишевод и трахею и регулируют морфогенез ветвления в легких [Chen et al., 2007; Desai et al., 2006; Malpel et al., 2000; Mollard et al., 2000; Wang et al., 2006], а также разделение на камеры легочных альвеол [Massaro and Massaro, 2003; Massaro et al., 2003; Massaro et al., 2000; McGowan et al., 2000] (Table 1, Table 2, and Table 3).
Хотя аномалии развития у Rar-нулевых мутантных мышей в точности воспроизводят таковые у грызунов, лишенных RAR лиганда или из-за пищевой депривации витамина А или генетически нарушенного синтеза RA. Существуют однако два примечательных исключения из этого правила, которые связаны с контролем посредством передачи сигналов RA, (i) симметрия формирования паттерна сомитов и (ii) дифференцировка зародышевых клеток в овариях эмбрионов. Относительно сомитогенеза, первоначально было установлено у нескольких видов позвоночных, что RA служит средством для генерации билатерально симметричных пар сомитов [Echeverri and Oates, 2007; Kawakami et al., 2005; Sirbu and Duester, 2006; Vermot and Pourquie, 2005]. Недавно было также продемонстрировано, что передача сигналов с помощью RA необходима для экспрессии Stra8 (stimulated by retinoic acid 8), который, в свою очередь, запускает мейоз в эмбриональных овариях [Baltus et al., 2006; Bowles et al., 2006; Koubova et al., 2006]. Однако дефекты в симметрии производных сомитов, таких как позвонки и мышцы или в гистологии яичников никогда не наблюдались у Rarα/β-, Rarα/γ- и Rarβ/γ-нулевых мутантных мышей. Как упоминалось выше, кажущееся отсутствие фенотипической конвергенции между животными моделями, лишенными RA и теми, что лишены RARs, является возможно следствием искусственной компенсации функций RARs, которые отсуствуют у нокаутных мышей, за счет оставшихся.

RARs have been instrumental to the phylogenesis of mesectodermal derivatives


В дополнение к драматическим черепно-лицевым скелетным нехваткам, возникающим у Rarα/γ-нулевых мутантов [Lohnes et al., 1994], наблюдаются незначительные дефекты, которые часто изменяют форму одиночных кусочков скелета у некоторых Rar-нулевых мышей, включая: хрящевые или костные соединения между наковальней костей среднего уха и alisphenoid косточкой (элементом pterygoquadrate), хрящевое отделение тройничного ганглия от головного мозга (pila antotica) и агенез рострального ethmoturbinate и maxillary синуса (Table 3) [Ghyselinck et al., 1997; Lohnes et al., 1994; Mark et al., 1998]. Элемент pterygoquadrate и pila antotica, которые были потеряны в ходе эволюции от рептилий к млекопитающим, представлют собой атавистические признаки (discussed in [Mark et al., 1998; Mark et al., 1995]). Точно также ethmoturbinate косточки и paranasal синусы (такие как maxillary синус) являются типичными признаками млекопитающих, которые отсутствуют у рептилий [Novacek, 1993]. Поэтому вполне возможно, что агенез носовых структур у Rar-нулевых мутантов также воспроизводит атавистические признаки. Присутствие атавистических характеристик у Rar-нулевых мутантов подтверждает возможность того, что изменения во временном и пространственном паттернах экспрессии Rar генов представляют собой генеральный механизм модификации количества и формы индивидуальных краниальных скелетных элементов во время эволюции позвоночных. Интересно, что недавние тератогенные эксперименты с использованием RA в избыте привели к сходным выводам [Vieux-Rochas et al., 2007].
Персистирующие и гиперпластичные vitreous body (PHPV), обнаруживаемые у Rarβ-нулевых мутантов сравнимы с pecten oculi, обычными сосудистыми и пигментными проекциями из оптического диска, обнаруживаемыми у некоторых рептилий, екоторые, как полагают, участвуют в питании сетчатки [Mann, 1937]. Укорочение вентральной части сетчатки, наблюдаемое у Rarβ/γ-нулевых мутантов также можно интерпретировать как модификацию в направлении родоначального состояния, т.к. сравнительная эмбриология сетчатки показывает, что вентральная часть поля сетчатки увеличивается в размерах при переходе от рыб к амфибиям, рептилиям и млекопитающим [Mann, 1937]. Т.о., RARβ и RARγ могут служить средством в экспансии вентрального поля сетчатки во время эволюции позвоночных.

RXRα is the main RXR isotype involved in embryogenesis


Rxrα-нулевые мутанты все обнаруживают гипоплазию компактного слоя миокарда желудочков (Table 2), которая является основной причиной гибели мутантов из-за сердечной недостаточности примерно на ст. E14.5 [Kastner et al., 1994; Kastner et al., 1997b; Ruiz-Lozano et al., 1998; Sucov et al., 1994]. Сходный дефект миокарда обнаруживается при VAD и у Rar-нулевых плодов [Mendelsohn et al., 1994; Wilson et al., 1953], указывает на то, что RXRα участвует в трансдукции RA сигнала, необходимого для роста миокарда. Эта потребность вряд ли является клеточно автономной, т.к. избыточная экспрессия RXRα в кардиомиоцитах посредством трансгенеза, не предупреэждает Rxrα-нулевой мутацией индуцированную гипоплазию вентрикулярного миокарда [Subbarayan et al., 2000]. Др. данные также указывают на то, что экспрессия Rxrα в эпикарде необходима для запуска паракринных синалов, необходимых для роста миокарда [Chen et al., 2002; Kang and Sucov, 2005; Merki et al., 2005].
Примерно треть Rxrα-нулевых мутантов лишены conotruncal перегородки, которая обычно подразделяет тракт оттока эмбрионального сердца (или conotruncus) на внутрикардиальную часть аорты и пульмональный ствол [Kastner et al., 1994]. Интересно, что дефицит этой перегородки присутствует как в классических VAD дефектах у грызунов, так и является ведущей причиной врожденных дефектов сердца у людей, варьируя от значительных внутривентрикулярных дефектов перегородки до двойного выхода в правый желудочек (double outlet right ventricle (DORV)). У Rxrα-нулевых мутантов агенез конотрункальной перегородки появляется вторично по отношению к усилению скорости клеточной гибели как мезенхимных клеток конотрункального грабня, так и parietal конотрункальных кардиомиоцитов, указывая тем самым, что RXRα необходим для трансдукции RA сигнала, который контролирует апоптоз в конотрункальном сегменте эмбрионального сердца [Ghyselinck et al., 1998].
Помимо дефектов сердца все Rxrα-нулевые плоды обнаруживают характерный окулярный синдром с PHPV, закрытием складок век, утолщением вентральной части стромы роговицы, вентральной ротацией хрусталика и агенезом склер и укорочением вентральной части сетчатки (Table 2) [Kastner et al., 1994]. Т.к. сходные дефекты присутствуют у VAD плодов и у Rarβ/γ-нулевых мутантов (Table 2) [Ghyselinck et al., 1997; Wilson et al., 1953], то RXRα, по-видимому, играет существенную роль в трансдукции RA сигналов, необходимых для некоторых глазных морфогенетических процессов, осоебнно формирования вентральной части поля сетчатки.
Важен тот факт, что мыши, лишенные RXRβ and RXRγ (Rxrβ/γ-нулевые мутанты) не обнаруживают каких-либо очевидных морфогенетических дефектов, даже когда дополнительно отсутствует один аллель Rxrα, это четко указывает на то, что RXRα функционально наиболее важный RXR во время морфогенеза собственно эмбриона [Krezel et al., 1996].

The AF-1-containing A/B domain and the ligand-dependent AF-2 of RXRα are differentially involved in development


Роль, выполняемая RXRs в качестве или "active" или "silent" партнеров гетеродимеризации, в транскрипции генов мишеней, став ясной в in vitro исследованиях, оказалась дискуссионной. Чтобы установить роль в транскрипции RXRα in vivo, мутантные мыши были преобразованы, так что экспрессировали укороченные RXRα белки, лишенные (i) N-терминальной активационной функции (AF)-1-containing α/β региона (Rxrαaf1o мутанты) [Mascrez et al., 2001], (ii) AF-2 activating domain (AD) core-containing helix 12, локализованного на С-конце E региона (Rxrαaf2o мутанты) [Mascrez et al., 1998] и (iii) обоих AF-1 и AF-2 (Rxrαafo мутанты) [Mascrez et al., 2009].
The Rxrαaf2o мутанты обнаруживают гипоплазию миокарда и окулярный синдром, которые явлюятся характерными признаками Rxrα-нулевого фенотипа [Kastner et al., 1994], но с низкой частотой [Mascrez et al., 1998]. Это может отражать функциональную компенсацию с помощью RXRβ, т.к. (i) частота гипоплазии миокарда увеличивается с 5% у Rxrαaf2o мутантов до 50% после дополнительной инактивации Rxrβ (который сам по себе не оказывает эффекта) [Kastner et al., 1996], и (ii) частота окулярного синдрома увеличивается с ~ 15% e Rxrαaf2o мутантов до 100% после дополнительной инактивации Rxrβ [Mascrez et al., 1998]. Полная пенетрантность Rxrα-нулевого окулярного синдрома, наблюдаемая у Rxrαaf2o/Rxrβ-нулевых мутантов [Mascrez et al., 1998], также как и у Rxrαafo мутантов [Mascrez et al., 2009], подтверждает мнение, что AF-2 из RXRα (и возможно RXR лиганд агонист) обязателен для окулярного морфогенеза. С др. стороны, редкая или скромная пенетрантность гипоплазии миокарда у Rxrαaf2o (5%), а у Rxrαaf2o/Rxrβ-нулевых (50%) и Rxrαaf2o/Rxrβ/γ-нулевых мутантов (50%) указывает на то. что транскрипционная активность RXRα становится необходимой для роста миокарда только на "неблагоприятном" генетическом фоне. Было установлено, что гистология сердца нормальна у 80% Rxrαafo плодов [Mascrez et al., 2009], указывая тем самым, что транскрипционно "молчащий" RXRα может способствовать миокардиальному росту.
Инволюция первичного стекловидного тела представляет процесс развития, который скорее всего нужадается в наивысших концентрациях RA-liganded ретиноидных рецепторов, т.к. VAD [Wilson et al., 1953], устранение Rarβ [Ghyselinck et al., 1997], устранение Rxrα [Kastner et al., 1994], делеция RXRα AF-2 [Mascrez et al., 1998] и делеция RXRα AF-1 и AF-2 [Mascrez et al., 2009] часто дают PHPV. Не говоря о случайных PHPV, мутанты Rxrαaf1o никогда не обладают какими-либо Rxrα-нулевыми дефектами развития [Mascrez et al., 2001]. Такое почти отсутствие дефектов не отражает компенсацию за счет RXRβ или RXRγ, т.к. Rxrαaf1o/Rxrβ-нулевые и Rxrαaf1o/Rxrβ/γ-нулевые мутанты не обладают онтогенетическими дефектами, иными чем PHPV. Однако частота таких PHPV увеличивается с 10% у Rxrαaf1o мутантов до 100% у Rxrαaf1o/Rxrβ/γ-нулевых мутантов [Mascrez et al., 2001]. Хотя эти наблюдения указывают на то, что инволюция первичного стекловидного тела нуждается как в RXRα AF-1, так и в AF-2, тогда как др. RA-зависимые морфогенетические события нуждаются только в RXRα AF-2, т.к. они обычно возникают в отсутствии RXRα AF-1-содержащего A/B домена.
Т.о., эти данные подтверждают мнение, что активация функций RXRα диффцренциально необходима для морфогенеза глаз и что они могут быть необязательны для развития сердца. Они такжу указывают на то, что обусловленная функциональным перекрыванием выполняемая роль каждой функции активации может быть выявлена только не генетических фонах мало пригодных для передачи сигналов RA (или в условиях RA-недостаточности). Если предположить, что часто потребность в RXRα AF-2 для онтогенетических событий отражает связывание лиганда агониста, то возникает вопрос о возможности существования и природе физиологических RXR лиганда(ов) in vivo. Тот факт, что 9-cis RA необнаружима у эмброионов грызунов [Horton and Maden, 1995; Matt et al., 2005b], ставит под сомнение, что этот RXR физиологический лиганд может быть 9-cis RA (rev. [Wolf, 2006]; see also [Calleja et al., 2006]).

The RXRα AF-1-containing A/B domain has a specific function in the involution of the interdigital mesenchyme


AF-2 из RXRα , по-видимому, функционально беолее важен во время развития, чем его AF-1, т.к. (i) Rxrαaf2o/Rxrβ/γ-нулевые плоды все обнаруживают большой набор врожденных дефектов и погибают in utero, тогда как Rxrαaf1o/Rxrβ/γ-нулеые плоды обнаруживают лишь немногие врожденные дефекты и часто жизнеспособны; и (ii) транскрипция RA-чувствительного lacZ репортерного трансгена у мышей нуждается в RXRα AF-2, но не в AF-1 [Mascrez et al., 1998; Mascrez et al., 2001]. Однако RXR? AF-1-содержащий A/B регион обладает уникальной ролью в RA-зависимом исчезновении межпальцевой мезенхимы.
Первые доказательства участия RA в инволюции межпальцевой мезенхимы были предоставлены путем экспериментов с органной культурой с использованием целых кончностей в RA-лишенной среде [Lussier et al., 1993]. Далее было показано, что мыши, лишенные обоих аллелей, или Rarα или Rarγ, также как и мыши, гетерозиготные по Rxrα-нулевой мутации, изредка обнаруживают слабые формы межпальцевых складок (webbing) (т.e., синдактилия мягких тканей) (Table 1) [Ghyselinck et al., 1997; Kastner et al., 1994; Lohnes et al., 1993; Lufkin et al., 1993]. Неожиданно этот дефект отсутствовал у Rarβ-нулевых мутантов, несмотря на то, что Rarβ строго и специфически экспрессируется interdigital necrotic zones (INZs) [Ghyselinck et al., 1997]. Однако разрушение одногj (или обоих) аллелей Rarβ на Rarγ-нулевом генетическом фоне существенно увеличивает образование межпальцеввых складок [Ghyselinck et al., 1997]. Персистенция плодной межпальцевой мезенхимы, отвечающая за образование межпальцевых складок, вызывается заметным снижением запрограммированной клеточной гибели, также как и увеличением пролиферации клеток в мутантных INZs [Dupe et al., 1999a]. Т.к. Rarβ и Rarγ не ко-экспрессируются в INZs, то инволюция межпальцевой мезенхимы д. использовать паракринные взаимодействия между этой мезенхимой, которая экспрессирует Rarβ, и любой хрящевой бластемой пальцев или поверхностым эпидермисом, которые экспрессируют Rarγ (discussed in [Dupe et al., 1999a]).
RXRα AF-1-содержащий A/B регион обязателен для функционирования RXRα/RARβ и/или RXRα/RARγ гетеродимеров, используемых для инволюции межпальцевой мезенхимы, т.к. большинство Rxrαaf1o мутантов и все Rxrαaf1o/Rxrβ/γ-нулевые мутанты обнаруживают синдактилию мягких тканей [Mascrez et al., 2001]. Напротив, Rxrαaf2o и Rxrαaf2o/Rxrβ/γ-нулевые мутанты никогда не обнаруживают подобного дефекта [Mascrez et al., 1998], указывая тем самым на специфическую потребность в RXRα AF-1-containing A/B; регионе для инволюции межпальцевой мезенхимы. Интересно, что фосфорилирование RXR? по специфическому serine остатку, расположенному в A домене, необходимо для анти-пролиферативной реакции клеток F9 teratocarcinoma на RA [Bastien et al., 2002; Rochette-Egly and Chambon, 2001]. Фосфорилирование RXRα A домена может, следовательно, выполнять важную функцию в каскаде молекулярных событий, которые in vivo ведут к обычному исчезновению межпальцевой мезенхимы.

Retinoic acid signals are transduced by specific RXRα/RAR heterodimers during development


Крмпаундные мутанты, у которых нулевая мутация данного RAR изотипа ассоциирует или с Rxrα-null, Rxrαaf1o или Rxrαaf2o мутацией в целом воспроизводят аномалии, обнаруживаемые у Rar-нулевых мутантов (Table 4) [Kastner et al., 1994; Kastner et al., 1997a; Mascrez et al., 1998; Mascrez et al., 2001]. Такой синергизм между мутациями потери функции Rar и Rxrα подтверждает заключение, что RXRα/RARα, RXRα/RARβ и RXRα/RARγ гетеродимеры являются функциональными единицами, передающими RA сигналы во время эмбриогенеза. Более того, Rxrβ/γ-нулевые мутанты развиваются нормально, указывая тем самым, что RXRα функционально наиболее важный RXR изотип во время развития [Krezel et al., 1996]. Это подтверждается отсутствием синергизма во время эмбриогенеза между Rarα-, Rarβ- или Rarγ-нулевыми мутациями и Rxrβ- или Rxrγ-нулевыми мутациями [Kastner et al., 1997a].
Сравнение тяжести и пенетрантности данной аномалии между разными мутантами привело к идентификации гетеродимеров, преимущественно участвующих в трансдукции сигналов RA в данном процессе развития. Напр., гипоплазия миокарда не обнаружена ни у одного Rxrαaf1o мутантов и только в 5% у Rxrαaf2o мутантов. Она наблюдается в 45% у Rxrαaf1o/Rarα-нулевых и в 80% у Rxrαaf2o/Rarα-нулевых мутантов, но ни у одного Rxrαaf1o/Rarβ-null или Rxrαaf1o/Rarγ-нулевых мутантов и только в 20% у Rxrαaf2o/Rarβ-null bkb Rxrαaf2o/Rarγ-нулевых мутантов [Mascrez et al., 1998; Mascrez et al., 2001]. Итак, эти данные указывают на то, что RXRα/RARα гетеродимеры преимущественно передают RA сигнал, влияя на рост миокарда.
Сходным образом, хотя все три RARs экспрессируются в развивающихся глазных структурах [Mori et al., 2001], несколько линий доказательств указывают на вовлечение RXRα/RARβ и RXRα/RARγ но не RXRα/RARα гетеродимеров во время морфогенеза глаз. Во-первых, имеется строгий синергизм между Rxrα- и Rarβ- или Rarγ-нулевыми мутациями, который проявляется в заметном увеличении тяжести Rxrα-нулевых глазных дефектов, тогда как не обнаруживается синергизма с Rarα-нулевыми мутациями (Table 4) [Kastner et al., 1997a]. Во-вторых, имеется также строгий синергизм между Rarβ- или Rarγ-нулевыми мутациями и устранением или AF-1-содержащего A/B домена или AF-2 из RXRα в отношении генерации глазных дефектов (Table 4) [Mascrez et al., 1998; Mascrez et al., 2001]. Фактически, не говоря уже о PHPV рассмотренного выше, характерный Rxrα-нулевой окулярный синдром никогда не наблюдается у Rxrαaf1o мутантов и обнаруживается менее чем в 15% у Rxrαaf2o мутантов. C др. стороны, окулярный синдром обнаруживается в 100% у Rxrαaf1o/Rarβ-null, Rxrαaf1o/Rarγ-null, Rxrαaf2o/Rarβ-null и Rxrαaf2o/Rarγ-нулевых мутантов, тогда как он отсутствует у всех Rxrαaf1o/Rarα-null и Rxrαaf2o/Rarα-нулевых мутантов [Mascrez et al., 1998; Mascrez et al., 2001]. Следовательно, эти генетические данные указывают на то, что RXRα/RARβ и RXRα/RARγ являются гетеродимерами, которые служат средством морфогенеза глаз.

Pharmacological and somatic mutagenesis approaches provide clues on RAR-controlled mechanisms operating in the head region during development


Энтодерма бранхиальных дуг является мишенью для действия RA, опосредованного с помощью RARα и/или RARβ
Rarα/β-нулевые мутанты, проанализированные на плодной стадии, обнаруживают полный набор дефектов, которые ммогут быть генерированы у кур хирургическим удалением post-otic NCC, а именно агенез или эктопии тимуса и паратироидных желез, абберрантное образование паттерна цефалических артерий, отсутствие легочных артерий и aorticopulmonary перегородки ([Ghyselinck et al., 1997; Mark et al., 1998; Mendelsohn et al., 1994]and references therein). Эти дефекты присутствуют также при CATCH22 синдроме, который является archetype neurocristopathy у человека (т.e., врожденных уродств структур, производных NCC). Эти и др. наблюдения ведут к предположению, что краниальные NCC , дающие мезенхимные производные (т.e., мезэктодермальные клетки) Являются главными мишенями действия RA (rev. [Mark et al., 2004]).
Неожиданно Rarα/β-нулевые мутанты, проанализированные на эмбриональных стадиях беременности, обнаруживали очень небольшие каудальные бранхиальные дуги (branchial arches (BA)), но не обнаруживали изменений в NCC [Dupe et al., 1999b]. BA являются временными выпячиваниями на эмбриональной голове и шее, частично заполненные NCC и отделенные одно от др. эвагинациями энтодермы, глоточными карманами. Каудальные BA и карманы дают взрослые органы, затрагиваемые в экспериментах по удалению NCC. Т.к. дефекты BA, наблюдаемые у Rarα/β-нулевых эмбрионов менее тяжелы, чем те, что у эмбрионов, лишенных RALDH2 (т.e., эмбрионов, лишенных RA) [Niederreither et al., 1999], они не отражают полного блокирования сигнальной трансдукции RA. Чтобы проанализировать миграцию NCC, а также образование BA и глоточных карманов в ситуации, когда степень блокирования передачи сигналов RA может быть точно контролируема, была разработана культуральная система, при которой эмбрионы дикого типа подвергали воздействию в избранные промежутки времени panRAR антагониста BMS493 [Wendling et al., 2000].
Воздействие BMS493 вызывает отсутствие каудальных BA и глоточных карманов и слегка нарушает пути post-otic миграции NCC, не влияя на количества NCC. Более того, что особенно интересно, воздействие ингибирует развитие каудальныхl BA только во время узкого временного промежутка, который не соответствует периоду post-otic миграции NCC. Т.о.. в противоположность тому, что ожидалось исходя из набора аномалий у Rarα/β-нулевых плодов [Dupe et al., 1999b], мигрирующие NCC, предназначенные для каудальных BA не представляют собой исключительные первичные мишени для действия RA. С др. стороны, BMS493-индуцированные отклонения в энтодермальной экспрессии "patterning" генов и генов, кодирующих пептиды, участвующие в путях паракринной передачи сигналов, указывают на то, что передача сигналов RA (i) необходима, чтобы специфицировать фарингеальную энтодерму, и (ii) и может создавать пермиссивные условия для миграции NCC посредством секреции специфических паракринных факторов фарингеальной энтодермой [Mark et al., 2004; Wendling et al., 2001]. Эти данные открывают также возможность, что гены, ответственные за синдром CATCH22 у человека, действительно экспрессируются в энтодерме под контролем RA во время четвертой и пятой недель беременности.

RARs act on top of a genetic cascade controlling hindbrain segmentation


Эмбриональный задний мозг временно подразделяется на сегменты (ромбомеры)Ю из которых 7 (R1 to R7) видны у млекопитающих. Т.о., ранняя и временная сегментация заднего мозга является средством для организации взрослых структур, таких как краниальные нервы. Задний мозг Rarα/γ-нулевых эмбрионов обнаруживает заднюю экспансию маркеров R3 и R4, но неспособен экспрессировать kreisler, специфический маркер R5 и R6 [Wendling et al., 2001]. Напротив, нейроэктодермальные территории, соответствующие R5 и R6 заметно увеличены у Rarα/β-нулевых эмбрионов [Dupe et al., 1999b]. Обработка на эмбриональный день (E)7.0 эмбрионов дикого типа panRAR антагонистом BMS493 воспроизводит аномальный фенотип заднего мозга Rarα/γ-нулевых эмбрионов, тогда как применение BMS493, начиная с E8.0 дает Rarα/β-null-подобный фенотип [Wendling et al., 2000]. Следовательно, разные фенотипы у Rarα/β- и Rarα/γ-нулевых эмбрионов связаны с действием RA во время разных промежутков времени. На ст. E7.5 (когда начинается синтез RA у эмбрионов) [Niederreither et al., 1999], RARγ и RARα передают сигнал. необходимый для спецификации R5/R6 территории. На E8.0, RARβ и RARα обеспечивают локальное увеличение передачи сигналов RA в задней части заднего мозга, чтобы контролировать положение каудальной границы R6, тем самым делая возможным спецификацию следующего каудального ромбомера, R7 [Mark et al., 2004; Serpente et al., 2005; Wendling et al., 2000].
То, что домены экспрессии нескольких важных паттерн-формирующих генов заднего мозга изменяются у Rarα/β- и Rarα/γ-нулевых эмбрионов доказывает, что RA действует на вершине генетической иерархии, контролирующей формирование паттерна заднего мозга [Wendling et al., 2001]. Более того, генерация градированного блокирования передачи сигналов у эмбрионов RA посредством варьирующих концентраций panRAR антагониста в культурах, демонстрирует, что индивидуальные ромбомеры специфицируются при разных порогах передачи сигналов RA и подтверждает мнение, что RA действует как posteriorizing сигнал при формировании паттерна эмбрионального заднего мозга ([Dupe and Lumsden, 2001; Serpente et al., 2005; Wendling et al., 2001]and references therein). Пороговые уровни передачи сигналов RA могут быть созданы за счет модуляций уровней экспрессии RAR или RA-синтезирующих и катаболизирующих энзимов (RALDHs и CYP26s, соотв.) [Abu-Abed et al., 2001; MacLean et al., 2001; Niederreither et al., 2000; Tahayato et al., 2003; Uehara et al., 2007].

Retinoic acid-dependent eye morphogenesis is orchestrated by the neural crest


Как упоминалось выше, Rarβ/γ-, Rxrα/Rarβ- and Rxrα/Rarγ-нулевые мутанты, но не Rxrα/Rarα-нулевые мутанты, обнаруживают сходные, хотя и более тяжелые глазные дефекты, чем Rxrα-нулевые мутанты, указывая тем самым. что RXRα/RARβ и RXRα/RARγ гетеродимеры служат орудием морфогенеза глазных структур, включая вентральную часть сетчатки (Table 2, Table 3, and Table 4). Как Rarβ так и Rarγ экспрессируются в периокулярной мезенхиме (POM), но не в сетчатке [Ghyselinck et al., 1997; Mori et al., 2001]. Следовательно, передача сигналов RA в POM (ткани, производной NCC) может обеспечивать морфогенез сетчатки (в ткани, производной нейроэктодермы). Используя соматический мутагенез (reviewed in [Metzger and Chambon, 2001]), мы продемонстрировали, что избирательная эксцизия как Rarβ так и Rarγ генов в клетках предшественниках POM (Rarβ/γ NCCα/α мутанты) воспроизводит глазные дефекты, вызываемые устранением в зародышевой линии тех же самых рецепторных генов. В клетках POM , RXRα/RARβ и RXRα/RARγ гетеродимеры, по-видимому, контролируют степень клеточной гибели, участвующей в ремоделировании POM и экспрессии Foxc1 и Pitx2 генов [Matt et al., 2005a], которые играют критическую роль в развитии переднего глазного сегмента у мышей и людей [Cvekl and Tamm, 2004]. Интересно, что POM не экспрессирует каких-либо RA-синтезирующих энзимов (RALDHs), и , следовательно, неспособна синтезировать RA. Вместо этого нейральная сетчатка, пигментный эпителий сетчатки и эктодерма роговицы экспрессируют и RALDH1 и RALDH3 ([Matt et al., 2005a] and references therein). Тот факт, что у мутантов, лишенных и RALDH1 и RALDH3 (i) активность RA-чувствительных репортерных трансгенов исчезает из POM и (ii) и глазные дефекты, которые генерируются, воспроизводят дефекты, наблюдаемые у Rarβ/γ-нулевых мутантов, это указывает на то, что два RA-синтезирующих энзима предоставляют RA, необходимую, чтобы активировать RXRα/RARβ и RXRα/RARγ гетеродимеры в POM. Следовательно, в развивающемся глазу, RA действует как паракринный сигнал: она синтезируется эпителиальными компартментами (т.e., сетчаткой, пигментным эпителием сетчатки и эктодермой роговицы), но осуществляет свой эффект в мезенхимном компартменте (т.e., POM). Напротив, мезенхимный компартмент, по-видимому, отвечает на RA сигнал синтезом ещё неизвестного паракринного фактора, необходимого для роста вентральной части сетчатки Клинические находки и экспериментальные подходы выявили, что витамин A (retinol) и его активные производные (т.e., retinoids) вызывают широкий круг эффектов на фомообразование тела эмбриона позвоночных и органогенез, тканевой гомеостаз, клеточную пролиферацию, дифференцировку и апоптоз (rev. [Blomhoff, 1994; Kastner et al., 1995; Mark et al., 2006; Morriss-Kay and Ward, 1999; Sporn et al., 1994]). После первой демонстрации Hale's, что vitamin A-deficiency (VAD) вызывает врожденные уродства глаз [Hale, 1933], Warkany с сотр. показали, что огромный массив врожденных уродств касается глаз, сердца, дыхательной и мочеполовой системы (обозначаемых суммарно как VAD синдром) возникает у плодов у vitamin A-deficient (VAD) крыс (rev. [Wilson et al., 1953]). Позднее было показано, что retinoic acid (RA) д. заместить vitamin A во время эмбриогенеза, по крайней мере на определенных стадия и в определенных органах [Dickman et al., 1997; White et al., 1998].
Как RA может осуществлять такие плейотропные эффекты. Ответ был получен с открытием двух классов RA-связывающих транскрипционных регуляторов, retinoic acid receptors (множественных изоформ из RARα, β иγ изотипов), и retinoid X receptors (множественных изоформа из RXRα, β и γ изотипов) (rev. [Chambon, 1996; Leid et al., 1992].

RARs and RXRs are instrumental to retinoic acid signalling during embryonic development


Передача сигналов посредством RARs необходима для формирования эмбрионального паттерна и органогенеза. Rarα, Rarβ, and Rarγ нулевые мутантные мыши жизнеспособны. Они обнаруживают некоторые аспекты фетального (и постнатального) VAD синдромов, а также немногие дополнительные врожденные уродства (Table 1). Однако их аномалии ограничены субнабором тканей, обычно экспрессирующих эти рецепторы, это возможно отражает существование функционального перекрывания между RARs (discussed in [Kastner et al., 1995; Kastner et al., 1997a; Mark and Chambon, 2003; Mark et al., 1995; Mascrez et al., 1998]). Чтобы проверить эту гипотезу получены мутанты, лишенные двух RAR изотипов (Rarα/β-, Rarα/γ- и Rarβ/γ-нулевые мутанты), или некоторых изоформ, принадлежащих к разным изотипам. Ради ясности, только аномалии, выявляемые у двойных нулевых мутантов, лишенных нескольких RAR изотипов (все изоформы делетированы) представлены в Table 2 и Table 3. Сходные аномалии, хотя часто и менее выраженные у "isoform-specific" двойных нулевых мутантов представлены у [Kastner et al., 1995] (мутанты, лишенные RARα1/RARβ2/4, RARα1/RARγ, RARα1α2+/-/RARγ and RARβ2/4/RARγ), у [Subbarayan et al., 1997] (мутанты, лишенные RARα/RARγ1 and RARβ/RARγ2), у [Luo et al., 1996] (мутанты, лишенные RARα1/RARβ), у [Ghyselinck et al., 1998] (мутанты, лишенные RARα/RARβ1/3 и RARβ1/3/RARγ) и у [Grondona et al., 1996] (мутанты, лишенные RARβ2/RARγ2).
Rarα/β-, Rarα/γ- и Rarβ/γ-нулевые мутанты погибали in utero или при рождении из-за тяжелых дефектов развития, которые в целом включали полный набор уродств, относящихся к плодному VAD-индуцированному синдрому, описанному Warkany's группой 55 лет тому назад [Wilson et al., 1953] (Table 2). Как и Rar-одиночные нулевые мутанты (see Table 1), Rar-двойные нулевые мутанты (Table 3) также обнаруживали врожденные аномалии, которые не были описаны в пионерских исследованиях Hale's и Warkany's плодных VAD [Hale, 1933; Wilson et al., 1953], касающиеся агенеза гардеровых желез, дефектов скелета черепа, лица, позвонков, конечностей и переднего мозга [Ghyselinck et al., 1997; Lohnes et al., 1993; Lohnes et al., 1994; Luo et al., 1996; Mendelsohn et al., 1994; Subbarayan et al., 1997]. Появление этих "non-VAD" дефектов у Rar-одиночных и двойных нулевых мутантных мышей в основном возможно объясняется трудностями достижения с помощью пищевой депривации состояния выраженного VAD, сравнимого с беременностью. Фактически почти все эти "non-VAD" дефекты были впоследвтвии вызваны у эмбрионов грызунов (i) дефицитом vitamin A, но с добавлением RA [Dickman et al., 1997; White et al., 2000; White et al., 1998]; (ii) дефицитом как RBP (retinol-binding protein) , так и vitamin A [Quadro et al., 2005]; (iii) отсутствием retinaldehyde синтезирующего энзима RDH10 (retinol dehydrogenase 10) [Sandell et al., 2007]; (iv) отсутствием RA синтезирующего энзима RALDH2 (retinaldehyde dehydrogenase 2) [Halilagic et al., 2007; Molotkova et al., 2007; Niederreither et al., 2002a; Niederreither et al., 1999; Niederreither et al., 2001; Niederreither et al., 2000; Niederreither et al., 2002b; Ribes et al., 2006] или RALDH3 [Dupe et al., 2003; Halilagic et al., 2007] или (v) обработкой синтетическими retinoids, обладающими panRAR антагонистической активностью [Kochhar et al., 1998; Wendling et al., 2000; Wendling et al., 2001]. Кроме того, недавно было установлено, что Matthew-Wood синдром, который согласуется со спектром врожденных аномалий, также наблюдаемым у Rarα/β, Rarα/γ and Rarβ/γ-нулевых мутантов, вызывается мутациями в RBP рецепторном гене, STRA6 [Golzio et al., 2007; Pasutto et al., 2007]. Т.к. мутации потери функции STRA6 скорее всего вызывают состояние RA недостаточности в эмбриональных тканях [Kawaguchi et al., 2007], то это открытие предоставляет доказательства того, что передача сигналов RAR осуществляет сходные функции во время эмбрионального развития у мышей и людей.
Сравнение фенотипов Rar-нулевых мутантов с таковыми у грызунов и людей, несущих упомянутый выше блок сигнальной трансдукции RA, демонстрирует, что связанные с лигандом RARs играют критическую роль на многих разных стадиях развития многочисленных органов ([Kastner et al., 1995] and references therein). Напр., тяжелые уродства, обнаруживаемые у Rarα/γ-нулевых эмбрионов [Wendling et al., 2001], сходны с теми, что у Aldh1a2 (первоначально Raldh2)-нулевых эмбрионов [Niederreither et al., 1999], и отражают ранние роли передачи сигналов RAR в аксиальной ротации, сегментации и закрытии заднего мозга, формировании отоцистов, фарингеальных дуг и зачатков передних конечностей, а также в закрытии примитивной кишки. RARs таже необходимы для онтогенеза (почти) всех анатомических структур, которые происходят из мезодермальных клеток, т.е. краниальной части neural crest cells (NCC), которые дают мезенхимные производные (rev. [Kastner et al., 1995; Mark et al., 1998; Mark et al., 1995]). RARs участвуют в формировании передне-заднего паттерна сомитной мезодермы и нейроэктодермы заднего мозга [Dupe et al., 1999b; Ghyselinck et al., 1997; Lohnes et al., 1993; Lohnes et al., 1994; Wendling et al., 2001], скорее всего посредством контроля экспрессии гомеобоксных генов [Allan et al., 2001; Dupe et al., 1997; Dupe et al., 1999b; Houle et al., 2000; Oosterveen et al., 2003; Serpente et al., 2005]. RARs также участвуют в установлении передне-задней оси конечностей [Dupe et al., 1999a; Lohnes et al., 1994; Mascrez et al., 1998]. RARs необходимы для развития большого количества глазных структур (Table 2 and Table 3) и для гистогенеза сетчатки [Ghyselinck et al., 1997; Grondona et al., 1996; Lohnes et al., 1994], дифференцировки кардиомиоцитов [Kastner et al., 1994; Kastner et al., 1997b], а также для контроля физиологического апоптоза в сетчатке [Grondona et al., 1996], в фронтоназальной и межпальцевой мезенхиме [Crocoll et al., 2002; Dupe et al., 1999a; Ghyselinck et al., 1997; Lohnes et al., 1994], conotruncal сегменте эмбрионального сердца [Ghyselinck et al., 1998] и эмбриональных нефрических протоков [Batourina et al., 2005]. В эмбриональном мочеполовом тракте, RARs контролируют эпителиально-мезенхимные взаимодействия в почках посредством экспрессии рецепторной тирозин киназы Ret [Batourina et al., 2002; Batourina et al., 2001; Mendelsohn et al., 1999], а также образование генитальных протоков и мочеточников [Batourina et al., 2001; Batourina et al., 2005; Ghyselinck et al., 1997; Mendelsohn et al., 1994]. В развивающемся респираторном тракте, связанные с RA лигандом RARs необходимы для морфогенеза носовых полостей и для их коммуникаций с более каудальными частями воздушных путей [Dupe et al., 2003; Ghyselinck et al., 1997] (Table 2 and Table 3). RA-liganded RARs также необходимы для расшепления примитивной передней кишки на пишевод и трахею и регулируют морфогенез ветвления в легких [Chen et al., 2007; Desai et al., 2006; Malpel et al., 2000; Mollard et al., 2000; Wang et al., 2006], а также разделение на камеры легочных альвеол [Massaro and Massaro, 2003; Massaro et al., 2003; Massaro et al., 2000; McGowan et al., 2000] (Table 1, Table 2, and Table 3).
Хотя аномалии развития у Rar-нулевых мутантных мышей в точности воспроизводят таковые у грызунов, лишенных RAR лиганда или из-за пищевой депривации витамина А или генетически нарушенного синтеза RA. Существуют однако два примечательных исключения из этого правила, которые связаны с контролем посредством передачи сигналов RA, (i) симметрия формирования паттерна сомитов и (ii) дифференцировка зародышевых клеток в овариях эмбрионов. Относительно сомитогенеза, первоначально было установлено у нескольких видов позвоночных, что RA служит средством для генерации билатерально симметричных пар сомитов [Echeverri and Oates, 2007; Kawakami et al., 2005; Sirbu and Duester, 2006; Vermot and Pourquie, 2005]. Недавно было также продемонстрировано, что передача сигналов с помощью RA необходима для экспрессии Stra8 (stimulated by retinoic acid 8), который, в свою очередь, запускает мейоз в эмбриональных овариях [Baltus et al., 2006; Bowles et al., 2006; Koubova et al., 2006]. Однако дефекты в симметрии производных сомитов, таких как позвонки и мышцы или в гистологии яичников никогда не наблюдались у Rarα/β-, Rarα/γ- и Rarβ/γ-нулевых мутантных мышей. Как упоминалось выше, кажущееся отсутствие фенотипической конвергенции между животными моделями, лишенными RA и теми, что лишены RARs, является возможно следствием искусственной компенсации функций RARs, которые отсуствуют у нокаутных мышей, за счет оставшихся.

RARs have been instrumental to the phylogenesis of mesectodermal derivatives


В дополнение к драматическим черепно-лицевым скелетным нехваткам, возникающим у Rarα/γ-нулевых мутантов [Lohnes et al., 1994], наблюдаются незначительные дефекты, которые часто изменяют форму одиночных кусочков скелета у некоторых Rar-нулевых мышей, включая: хрящевые или костные соединения между наковальней костей среднего уха и alisphenoid косточкой (элементом pterygoquadrate), хрящевое отделение тройничного ганглия от головного мозга (pila antotica) и агенез рострального ethmoturbinate и maxillary синуса (Table 3) [Ghyselinck et al., 1997; Lohnes et al., 1994; Mark et al., 1998]. Элемент pterygoquadrate и pila antotica, которые были потеряны в ходе эволюции от рептилий к млекопитающим, представлют собой атавистические признаки (discussed in [Mark et al., 1998; Mark et al., 1995]). Точно также ethmoturbinate косточки и paranasal синусы (такие как maxillary синус) являются типичными признаками млекопитающих, которые отсутствуют у рептилий [Novacek, 1993]. Поэтому вполне возможно, что агенез носовых структур у Rar-нулевых мутантов также воспроизводит атавистические признаки. Присутствие атавистических характеристик у Rar-нулевых мутантов подтверждает возможность того, что изменения во временном и пространственном паттернах экспрессии Rar генов представляют собой генеральный механизм модификации количества и формы индивидуальных краниальных скелетных элементов во время эволюции позвоночных. Интересно, что недавние тератогенные эксперименты с использованием RA в избыте привели к сходным выводам [Vieux-Rochas et al., 2007].
Персистирующие и гиперпластичные vitreous body (PHPV), обнаруживаемые у Rarβ-нулевых мутантов сравнимы с pecten oculi, обычными сосудистыми и пигментными проекциями из оптического диска, обнаруживаемыми у некоторых рептилий, некоторые, как полагают, участвуют в питании сетчатки [Mann, 1937]. Укорочение вентральной части сетчатки, наблюдаемое у Rarβ/γ-нулевых мутантов также можно интерпретировать как модификацию в направлении родоначального состояния, т.к. сравнительная эмбриология сетчатки показывает, что вентральная часть поля сетчатки увеличивается в размерах при переходе от рыб к амфибиям, рептилиям и млекопитающим [Mann, 1937]. Т.о., RARβ и RARγ могут служить средством в экспансии вентрального поля сетчатки во время эволюции позвоночных.

RXRα is the main RXR isotype involved in embryogenesis


Rxrα-нулевые мутанты все обнаруживают гипоплазию компактного слоя миокарда желудочков (Table 2), которая является основной причиной гибели мутантов из-за сердечной недостаточности примерно на ст. E14.5 [Kastner et al., 1994; Kastner et al., 1997b; Ruiz-Lozano et al., 1998; Sucov et al., 1994]. Сходный дефект миокарда обнаруживается при VAD и у Rar-нулевых плодов [Mendelsohn et al., 1994; Wilson et al., 1953], указывает на то, что RXRα участвует в трансдукции RA сигнала, необходимого для роста миокарда. Эта потребность вряд ли является клеточно автономной, т.к. избыточная экспрессия RXRα в кардиомиоцитах посредством трансгенеза, не предупреждает Rxrα-нулевой мутацией индуцированную гипоплазию вентрикулярного миокарда [Subbarayan et al., 2000]. Др. данные также указывают на то, что экспрессия Rxrα в эпикарде необходима для запуска паракринных сигналов, необходимых для роста миокарда [Chen et al., 2002; Kang and Sucov, 2005; Merki et al., 2005].
Примерно треть Rxrα-нулевых мутантов лишены conotruncal перегородки, которая обычно подразделяет тракт оттока эмбрионального сердца (или conotruncus) на внутрикардиальную часть аорты и пульмональный ствол [Kastner et al., 1994]. Интересно, что дефицит этой перегородки присутствует как в классических VAD дефектах у грызунов, так и является ведущей причиной врожденных дефектов сердца у людей, варьируя от значительных внутривентрикулярных дефектов перегородки до двойного выхода в правый желудочек (double outlet right ventricle (DORV)). У Rxrα-нулевых мутантов агенез конотрункальной перегородки появляется вторично по отношению к усилению скорости клеточной гибели как мезенхимных клеток конотрункального гребня, так и parietal конотрункальных кардиомиоцитов, указывая тем самым, что RXRα необходим для трансдукции RA сигнала, который контролирует апоптоз в конотрункальном сегменте эмбрионального сердца [Ghyselinck et al., 1998].
Помимо дефектов сердца все Rxrα-нулевые плоды обнаруживают характерный окулярный синдром с PHPV, закрытием складок век, утолщением вентральной части стромы роговицы, вентральной ротацией хрусталика и агенезом склер и укорочением вентральной части сетчатки (Table 2) [Kastner et al., 1994]. Т.к. сходные дефекты присутствуют у VAD плодов и у Rarβ/γ-нулевых мутантов (Table 2) [Ghyselinck et al., 1997; Wilson et al., 1953], то RXRα, по-видимому, играет существенную роль в трансдукции RA сигналов, необходимых для некоторых глазных морфогенетических процессов, особенно формирования вентральной части поля сетчатки.
Важен тот факт, что мыши, лишенные RXRβ and RXRγ (Rxrβ/γ-нулевые мутанты) не обнаруживают каких-либо очевидных морфогенетических дефектов, даже когда дополнительно отсутствует один аллель Rxrα, это четко указывает на то, что RXRα функционально наиболее важный RXR во время морфогенеза собственно эмбриона [Krezel et al., 1996].

The AF-1-containing A/B domain and the ligand-dependent AF-2 of RXRα are differentially involved in development


Роль, выполняемая RXRs в качестве или "active" или "silent" партнеров гетеродимеризации, в транскрипции генов мишеней, став ясной в in vitro исследованиях, оказалась дискуссионной. Чтобы установить роль в транскрипции RXRα in vivo, мутантные мыши были преобразованы, так что экспрессировали укороченные RXRα белки, лишенные (i) N-терминальной активационной функции (AF)-1-containing α/β региона (Rxrαaf1o мутанты) [Mascrez et al., 2001], (ii) AF-2 activating domain (AD) core-containing helix 12, локализованного на С-конце E региона (Rxrαaf2o мутанты) [Mascrez et al., 1998] и (iii) обоих AF-1 и AF-2 (Rxrαafo мутанты) [Mascrez et al., 2009].
The Rxrαaf2o мутанты обнаруживают гипоплазию миокарда и окулярный синдром, которые являются характерными признаками Rxrα-нулевого фенотипа [Kastner et al., 1994], но с низкой частотой [Mascrez et al., 1998]. Это может отражать функциональную компенсацию с помощью RXRβ, т.к. (i) частота гипоплазии миокарда увеличивается с 5% у Rxrαaf2o мутантов до 50% после дополнительной инактивации Rxrβ (который сам по себе не оказывает эффекта) [Kastner et al., 1996], и (ii) частота окулярного синдрома увеличивается с ~ 15% e Rxrαaf2o мутантов до 100% после дополнительной инактивации Rxrβ [Mascrez et al., 1998]. Полная пенетрантность Rxrα-нулевого окулярного синдрома, наблюдаемая у Rxrαaf2o/Rxrβ-нулевых мутантов [Mascrez et al., 1998], также как и у Rxrαafo мутантов [Mascrez et al., 2009], подтверждает мнение, что AF-2 из RXRα (и возможно RXR лиганд агонист) обязателен для окулярного морфогенеза. С др. стороны, редкая или скромная пенетрантность гипоплазии миокарда у Rxrαaf2o (5%), а у Rxrαaf2o/Rxrβ-нулевых (50%) и Rxrαaf2o/Rxrβ/γ-нулевых мутантов (50%) указывает на то, что транскрипционная активность RXRα становится необходимой для роста миокарда только на "неблагоприятном" генетическом фоне. Было установлено, что гистология сердца нормальна у 80% Rxrαafo плодов [Mascrez et al., 2009], указывая тем самым, что транскрипционно "молчащий" RXRα может способствовать миокардиальному росту.
Инволюция первичного стекловидного тела представляет процесс развития, который скорее всего нужадается в наивысших концентрациях RA-liganded ретиноидных рецепторов, т.к. VAD [Wilson et al., 1953], устранение Rarβ [Ghyselinck et al., 1997], устранение Rxrα [Kastner et al., 1994], делеция RXRα AF-2 [Mascrez et al., 1998] и делеция RXRα AF-1 и AF-2 [Mascrez et al., 2009] часто дают PHPV. Не говоря о случайных PHPV, мутанты Rxrαaf1o никогда не обладают какими-либо Rxrα-нулевыми дефектами развития [Mascrez et al., 2001]. Такое почти отсутствие дефектов не отражает компенсацию за счет RXRβ или RXRγ, т.к. Rxrαaf1o/Rxrβ-нулевые и Rxrαaf1o/Rxrβ/γ-нулевые мутанты не обладают онтогенетическими дефектами, иными чем PHPV. Однако частота таких PHPV увеличивается с 10% у Rxrαaf1o мутантов до 100% у Rxrαaf1o/Rxrβ/γ-нулевых мутантов [Mascrez et al., 2001]. Хотя эти наблюдения указывают на то, что инволюция первичного стекловидного тела нуждается как в RXRα AF-1, так и в AF-2, тогда как др. RA-зависимые морфогенетические события нуждаются только в RXRα AF-2, т.к. они обычно возникают в отсутствии RXRα AF-1-содержащего A/B домена.
Т.о., эти данные подтверждают мнение, что активация функций RXRα дифференциально необходима для морфогенеза глаз и что они могут быть необязательны для развития сердца. Они также указывают на то, что обусловленная функциональным перекрыванием выполняемая роль каждой функции активации может быть выявлена только не генетических фонах мало пригодных для передачи сигналов RA (или в условиях RA-недостаточности). Если предположить, что часто потребность в RXRα AF-2 для онтогенетических событий отражает связывание лиганда агониста, то возникает вопрос о возможности существования и природе физиологических RXR лиганда(ов) in vivo. Тот факт, что 9-cis RA необнаружима у эмбрионов грызунов [Horton and Maden, 1995; Matt et al., 2005b], ставит под сомнение, что этот RXR физиологический лиганд может быть 9-cis RA (rev. [Wolf, 2006]; see also [Calleja et al., 2006]).

The RXRα AF-1-containing A/B domain has a specific function in the involution of the interdigital mesenchyme


AF-2 из RXRα , по-видимому, функционально более важен во время развития, чем его AF-1, т.к. (i) Rxrαaf2o/Rxrβ/γ-нулевые плоды все обнаруживают большой набор врожденных дефектов и погибают in utero, тогда как Rxrαaf1o/Rxrβ/γ-нулевые плоды обнаруживают лишь немногие врожденные дефекты и часто жизнеспособны; и (ii) транскрипция RA-чувствительного lacZ репортерного трансгена у мышей нуждается в RXRα AF-2, но не в AF-1 [Mascrez et al., 1998; Mascrez et al., 2001]. Однако RXR? AF-1-содержащий A/B регион обладает уникальной ролью в RA-зависимом исчезновении межпальцевой мезенхимы.
Первые доказательства участия RA в инволюции межпальцевой мезенхимы были предоставлены путем экспериментов с органной культурой с использованием целых кончностей в RA-лишенной среде [Lussier et al., 1993]. Далее было показано, что мыши, лишенные обоих аллелей, или Rarα или Rarγ, также как и мыши, гетерозиготные по Rxrα-нулевой мутации, изредка обнаруживают слабые формы межпальцевых складок (webbing) (т.e., синдактилия мягких тканей) (Table 1) [Ghyselinck et al., 1997; Kastner et al., 1994; Lohnes et al., 1993; Lufkin et al., 1993]. Неожиданно этот дефект отсутствовал у Rarβ-нулевых мутантов, несмотря на то, что Rarβ строго и специфически экспрессируется interdigital necrotic zones (INZs) [Ghyselinck et al., 1997]. Однако разрушение одного (или обоих) аллелей Rarβ на Rarγ-нулевом генетическом фоне существенно увеличивает образование межпальцеввых складок [Ghyselinck et al., 1997]. Персистенция плодной межпальцевой мезенхимы, отвечающая за образование межпальцевых складок, вызывается заметным снижением запрограммированной клеточной гибели, также как и увеличением пролиферации клеток в мутантных INZs [Dupe et al., 1999a]. Т.к. Rarβ и Rarγ не ко-экспрессируются в INZs, то инволюция межпальцевой мезенхимы д. использовать паракринные взаимодействия между этой мезенхимой, которая экспрессирует Rarβ, и любой хрящевой бластемой пальцев или поверхностым эпидермисом, которые экспрессируют Rarγ (discussed in [Dupe et al., 1999a]).
RXRα AF-1-содержащий A/B регион обязателен для функционирования RXRα/RARβ и/или RXRα/RARγ гетеродимеров, используемых для инволюции межпальцевой мезенхимы, т.к. большинство Rxrαaf1o мутантов и все Rxrαaf1o/Rxrβ/γ-нулевые мутанты обнаруживают синдактилию мягких тканей [Mascrez et al., 2001]. Напротив, Rxrαaf2o и Rxrαaf2o/Rxrβ/γ-нулевые мутанты никода не обнаруживают подобного дефекта [Mascrez et al., 1998], указывая тем самым на специфическую потребность в RXRα AF-1-containing A/B; регионе для инволюции межпальцевой мезенхимы. Интересно, что фосфорилирование RXR? по специфическому serine остатку, расположенному в A домене, необходимо для анти-пролиферативной реакции клеток F9 teratocarcinoma на RA [Bastien et al., 2002; Rochette-Egly and Chambon, 2001]. Фосфорилирование RXR? A домена может, следовательно, выполнять важную функцию в каскаде молекулярных событий, которые in vivo ведут к обычному исчезновению межпальцевой мезенхимы.

Retinoic acid signals are transduced by specific RXRα/RAR heterodimers during development


Компаундные мутанты, у которых нулевая мутация данного RAR изотипа ассоциирует или с Rxrα-null, Rxrαaf1o или Rxrαaf2o мутацией в целом воспроизводят аномалии, обнаруживаемые у Rar-нулевых мутантов (Table 4) [Kastner et al., 1994; Kastner et al., 1997a; Mascrez et al., 1998; Mascrez et al., 2001]. Такой синергизм между мутациями потери функции Rar и Rxrα подтверждает заключение, что RXRα/RARα, RXRα/RARβ и RXRα/RARγ гетеродимеры являются функциональными единицами, передающими RA сигналы во время эмбриогенеза. Более того, Rxrβ/γ-нулевые мутанты развиваются нормально, указывая тем самым, что RXRα функционально наиболее важный RXR изотип во время развития [Krezel et al., 1996]. Это подтверждается отсутствием синергизма во время эмбриогенеза между Rarα-, Rarβ- или Rarγ-нулевыми мутациями и Rxrβ- или Rxrγ-нулевыми мутациями [Kastner et al., 1997a].
Сравнение тяжести и пенетрантности данной аномалии между разными мутантами привело к идентификации гетеродимеров, преимущественно участвующих в трансдукции сигналов RA в данном процессе развития. Напр., гипоплазия миокарда не обнаружена ни у одного Rxrαaf1o мутантов и только в 5% у Rxrαaf2o мутантов. Она наблюдается в 45% у Rxrαaf1o/Rarα-нулевых и в 80% у Rxrαaf2o/Rarα-нулевых мутантов, но ни у одного Rxrαaf1o/Rarβ-null или Rxrαaf1o/Rarγ-нулевых мутантов и только в 20% у Rxrαaf2o/Rarβ-null bkb Rxrαaf2o/Rarγ-нулевых мутантов [Mascrez et al., 1998; Mascrez et al., 2001]. Итак, эти данные указывают на то, что RXRα/RARα гетеродимеры преимущественно передают RA сигнал, влияя на рост миокарда.
Сходным образом, хотя все три RARs экспрессируются в развивающихся глазных структурах [Mori et al., 2001], несколько линий доказательств указывают на вовлечение RXRα/RARβ и RXRα/RARγ но не RXRα/RARα гетеродимеров во время морфогенеза глаз. Во-первых, имеется строгий синергизм между Rxrα- и Rarβ- или Rarγ-нулевыми мутациями, который проявляется в заметном увеличении тяжести Rxrα-нулевых глазных дефектов, тогда как не обнаруживается синергизма с Rarα-нулевыми мутациями (Table 4) [Kastner et al., 1997a]. Во-вторых, имеется также строгий синергизм между Rarβ- или Rarγ-нулевыми мутациями и устранением или AF-1-содержащего A/B домена или AF-2 из RXRα в отношении генерации глазных дефектов (Table 4) [Mascrez et al., 1998; Mascrez et al., 2001]. Фактически, не говоря уже о PHPV рассмотренного выше, характерный Rxrα-нулевой окулярный синдром никогда не наблюдается у Rxrαaf1o мутантов и обнаруживается менее чем в 15% у Rxrαaf2o мутантов. C др. стороны, окулярный синдром обнаруживается в 100% у Rxrαaf1o/Rarβ-null, Rxrαaf1o/Rarγ-null, Rxrαaf2o/Rarβ-null и Rxrαaf2o/Rarγ-нулевых мутантов, тогда как он отсутствует у всех Rxrαaf1o/Rarα-null и Rxrαaf2o/Rarα-нулевых мутантов [Mascrez et al., 1998; Mascrez et al., 2001]. Следовательно, эти генетические данные указывают на то, что RXRα/RARβ и RXRα/RARγ являются гетеродимерами, которые служат средством морфогенеза глаз.

Pharmacological and somatic mutagenesis approaches provide clues on RAR-controlled mechanisms operating in the head region during development


Энтодерма бранхиальных дуг является мишенью для действия RA, опосредованного с помощью RARα и/или RARβ
Rarα/β-нулевые мутанты, проанализированные на плодной стадии, обнарживают полный набор дефектов, которые могут быть генерированы у кур хирургическим удалением post-otic NCC, а именно агенез или эктопии тимуса и паратироидных желез, аfmthhfynyjt образование паттерна цефалических артерий, отсутствие легочных артерий и aorticopulmonary перегородки ([Ghyselinck et al., 1997; Mark et al., 1998; Mendelsohn et al., 1994]and references therein). Эти дефекты присутствуют также при CATCH22 синдроме, который является archetype neurocristopathy у человека (т.e., врожденных уродств структур, производных NCC). Эти и др. наблюдения ведут к предположению, что краниальные NCC , дающие мезенхимные производные (т.e., мезэктодермальные клетки) Являются главными мишенями действия RA (rev. [Mark et al., 2004]).
Неожиданно Rarα/β-нулевые мутанты, проанализированные на эмбриональных стадиях беременности, обнаруживали очень небольшие каудальные бранхиальные дуги (branchial arches (BA)), но не обнаруживали изменений в NCC [Dupe et al., 1999b]. BA являются временными выпячиваниями на эмбриональной голове и шее, частично заполненные NCC и отделенные одно от др. эвагинациями энтодермы, глоточными карманами. Каудальные BA и карманы дают взрослые органы, затрагиваемые в экспериментах по удалению NCC. Т.к. дефекты BA, наблюдаемые у Rarα/β-нулевых эмбрионов менее тяжелы, чем те, что у эмбрионов, лишенных RALDH2 (т.e., эмбрионов, лишенных RA) [Niederreither et al., 1999], они не отражают полного блокирования сигнальной трансдукции RA. Чтобы проанализировать миграцию NCC, а также образование BA и глоточных карманов в ситуации, когда степень блокирования передачи сигналов RA может быть точно контролируема, была разработана культуральная система, при которой эмбрионы дикого типа подвергали воздействию в избранные промежутки времени panRAR антагониста BMS493 [Wendling et al., 2000].
Воздействие BMS493 вызывает отсутствие каудальных BA и глоточных карманов и слегка нарушает пути post-otic миграции NCC, не влияя на количества NCC. Более того, что особенно интересно, воздействие ингибирует развитие каудальных BA только во время узкого временного промежутка, который не соответствует периоду post-otic миграции NCC. Т.о.. в противоположность тому, что ожидалось исходя из набора аномалий у Rarα/β-нулевых плодов [Dupe et al., 1999b], мигрирующие NCC, предназначенные для каудальных BA не представляют собой исключительные первичные мишени для действия RA. С др. стороны, BMS493-индуцированные отклонения в энтодермальной экспрессии "patterning" генов и генов, кодирующих пептиды, участвующие в путях паракринной передачи сигналов, указывают на то, что передача сигналов RA (i) необходима, чтобы специфицировать фарингеальную энтодерму, и (ii) и может создавать пермиссивные условия для миграции NCC посредством секреции специфических паракринных факторов фарингеальной энтодермой [Mark et al., 2004; Wendling et al., 2001]. Эти данные открывают также возможность, что гены, ответственные за синдром CATCH22 у человека, действительно экспрессируются в энтодерме под контролем RA во время четвертой и пятой недель беременности.

RARs act on top of a genetic cascade controlling hindbrain segmentation


Эмбриональный задний мозг временно подразделяется на сегменты (ромбомеры)Ю из которых 7 (R1 to R7) видны у млекопитающих. Т.о., ранняя и временная сегментация заднего мозга является средством для организации взрослых структур, таких как краниальные нервы. Задний мозг Rarα/γ-нулевых эмбрионов обнаруживает заднюю экспансию маркеров R3 и R4, но неспособен экспрессировать kreisler, специфический маркер R5 и R6 [Wendling et al., 2001]. Напротив, нейроэктодермальные территории, соответствующие R5 и R6 заметно увеличены у Rarα/β-нулевых эмбрионов [Dupe et al., 1999b]. Обработка на эмбриональный день (E)7.0 эмбрионов дикого типа panRAR антагонистом BMS493 воспроизводит аномальный фенотип заднего мозга Rarα/γ-нулевых эмбрионов, тогда как применение BMS493, начиная с E8.0 дает Rarα/β-null-подобный фенотип [Wendling et al., 2000]. Следовательно, разные фенотипы у Rarα/β- и Rarα/γ-нулевых эмбрионов связаны с действием RA во время разных промежутков времени. На ст. E7.5 (когда начинается синтез RA у эмбрионов) [Niederreither et al., 1999], RARγ и RARα передают сигнал. необходимый для спецификации R5/R6 территории. На E8.0, RARβ и RARα обеспечивают локальное увеличение передачи сигналов RA в задней части заднего мозга, чтобы контролировать положение каудальной границы R6, тем самым делая возможным спецификацию следующего каудального ромбомера, R7 [Mark et al., 2004; Serpente et al., 2005; Wendling et al., 2000].
То, что домены экспрессии нескольких важных паттерн-формирующих генов заднего мозга изменяются у Rarα/β- и Rarα/γ-нулевых эмбрионов доказывает, что RA действует на вершине генетической иерархии, контролирующей формирование паттерна заднего мозга [Wendling et al., 2001]. Более того, генерация градированного блокирования передачи сигналов у эмбрионов RA посредством варьирующих концентраций panRAR антагониста в культурах, демонстрирует, что индивидуальные ромбомеры специфицируются при разных порогах передачи сигналов RA и подтверждает мнение, что RA действует как posteriorizing сигнал при формировании паттерна эмбрионального заднего мозга ([Dupe and Lumsden, 2001; Serpente et al., 2005; Wendling et al., 2001]and references therein). Пороговые уровни передачи сигналов RA могут быть созданы за счет модуляций уровней экспрессии RAR или RA-синтезирующих и катаболизирующих энзимов (RALDHs и CYP26s, соотв.) [Abu-Abed et al., 2001; MacLean et al., 2001; Niederreither et al., 2000; Tahayato et al., 2003; Uehara et al., 2007].

Retinoic acid-dependent eye morphogenesis is orchestrated by the neural crest


Как упоминалось выше, Rarβ/γ-, Rxrα/Rarβ- and Rxrα/Rarγ-нулевые мутанты, но не Rxrα/Rarα-нулевые мутанты, обнаруживают сходные, хотя и более тяжелые глазные дефекты, чем Rxrα-нулевые мутанты, указывая тем самым, что RXRα/RARβ и RXRα/RARγ гетеродимеры служат орудием морфогенеза глазных структур, включая вентральную часть сетчатки (Table 2, Table 3, and Table 4). Как Rarβ так и Rarγ экспрессируются в периокулярной мезенхиме (POM), но не в сетчатке [Ghyselinck et al., 1997; Mori et al., 2001]. Следовательно, передача сигналов RA в POM (ткани, производной NCC) может обеспечивать морфогенез сетчатки (в ткани, производной нейроэктодермы). Используя соматический мутагенез (reviewed in [Metzger and Chambon, 2001]), мы продемонстрировали, что избирательная эксцизия как Rarβ так и Rarγ генов в клетках предшественниках POM (Rarβ/γ NCCα/α мутанты) воспроизводит глазные дефекты, вызываемые устранением в зародышевой линии тех же самых рецепторных генов. В клетках POM , RXRα/RARβ и RXRα/RARγ гетеродимеры, по-видимому, контролируют степень клеточной гибели, участвующей в ремоделировании POM и экспрессии Foxc1 и Pitx2 генов [Matt et al., 2005a], которые играют критическую роль в развитии переднего глазного сегмента у мышей и людей [Cvekl and Tamm, 2004]. Интересно, что POM не экспрессирует каких-либо RA-синтезирующих энзимов (RALDHs), и , следовательно, неспособна синтезировать RA. Вместо этого нейральная сетчатка, пигментный эпителий сетчатки и эктодерма роговицы экспрессируют и RALDH1 и RALDH3 ([Matt et al., 2005a] and references therein). Тот факт, что у мутантов, лишенных и RALDH1 и RALDH3 (i) активность RA-чувствительных репортерных трансгенов исчезает из POM и (ii) и глазные дефекты, которые генерируются, воспроизводят дефекты, наблюдаемые у Rarβ/γ-нулевых мутантов, это указывает на то, что два RA-синтезирующих энзима предоставляют RA, необходимую, чтобы активировать RXRα/RARβ и RXRα/RARγ гетеродимеры в POM. Следовательно, в развивающемся глазу, RA действует как паракринный сигнал: она синтезируется эпителиальными компартментами (т.e., сетчаткой, пигментным эпителием сетчатки и эктодермой роговицы), но осуществляет свой эффект в мезенхимном компартменте (т.e., POM). Напротив, мезенхимный компартмент, по-видимому, отвечает на RA сигнал синтезом ещё неизвестного паракринного фактора, необходимого для роста вентральной части сетчатки [Matt et al., 2005a; Matt et al., 2008].

Conclusions and perspectives


The phenotypic analyses of mutants lacking retinoid receptors have provided compelling evidence that RA is actually the metabolite of vitamin A, which is active during early embryogenesis, organogenesis, as well as postnatally. This conclusion was subsequently strengthened by the demonstration that RA, synthesized by the retinaldehyde dehydrogenases (RALDH1, RALDH2 and RALDH3), acts as an indispensable developmental hormone [Dupe et al., 2003; Matt et al., 2005a; Mic and Duester, 2003; Mic et al., 2002; Mic et al., 2003; Mic et al., 2004; Niederreither et al., 2002a; Niederreither et al., 1999; Niederreither et al., 2001; Niederreither et al., 2000; Niederreither et al., 2002b; Vermot et al., 2003]. Furthermore, the results from genetic and pharmacological studies conducted in the mouse have proven that the molecular mechanisms underlying transduction of the RA signal by retinoid receptors, which were suggested from in vitro studies, are actually instrumental to retinoid signalling under physiological conditions. They have also conclusively established that the teratogenic effects resulting from administration of exogenous RA to embryos do not reflect the physiological role of endogenous RA in the corresponding developmental processes (discussed in [Mark et al., 2006]).
RXRα/RAR heterodimers are clearly the main functional units transducing RA signals during development, and specific heterodimers are involved in given developmental processes (reviewed in [Mark and Chambon, 2003]). This strongly supports the initial proposal that the pleiotropic effects of RA reflect sophisticated combinatorial mechanisms, through which multiple RXR/RAR heterodimers differentially transduce retinoid signals to selectively control the expression of numerous sets of RA target genes [Leid et al., 1992]. Secondly, in vivo, the RXR partner can be either transcriptionally active (thus acting in synergy with its RAR partner) or inactive within RXR/RAR heterodimers, depending on the developmental event under consideration. Thirdly, the transcriptional activity of RXR is subordinated to ligand binding to the RAR partner in vivo [Elmazar et al., 2001; Matt et al., 2003; Mic et al., 2003], as is the case in cultured cells in vitro [Durand et al., 1994; Rochette-Egly and Chambon, 2001; Roy et al., 1995], and when RXRα is transcriptionally active, either one or both activation functions (AF-1 and AF-2) can be involved, their activity depending on the nature of the RA-controlled developmental event [Mascrez et al., 2009; Mascrez et al., 1998; Mascrez et al., 2001].
The genetic studies summarized in this review have revealed an extensive functional redundancy within the members of each family (RARs or RXRs), although each of these members appears to individually exert at least one specific physiological function. Since the members of each family share a common ancestor [Escriva et al., 2004], such a redundancy is not surprising. However, it raises the question as to whether it is physiologically relevant or artefactually generated when a given receptor is missing, as is the case in cultured F9 cells [Rochette-Egly and Chambon, 2001; Taneja et al., 1995; Taneja et al., 1996]. In this respect, note that the existence of two fully redundant genes is, in an evolutionary sense, unlikely [Brookfield, 1992; Thomas, 1993]. It is also noteworthy that the occurrence of a given morphological defect in Rar double-null mutants contrasting with its absence in Rar single-null mutants should not be taken as a definite proof of a cell-autonomous functional redundancy. Another possible explanation could imply the action of distinct RARs in different tissues, which may independently direct the making of a given structure. Such a possibility may apply to the case of the interdigital soft tissue, which involutes normally in all Rarb- and in almost all Rarg-null mutants, but persists in all Rarβ/γ-null mutants yielding webbed digits (Table 1 and Table 3). In this instance, a functional cell-autonomous redundancy between RARβ and RARγ is hardly conceivable, as Rarb and Rarg exhibit non-overlapping expression patterns in the limbs [Ghyselinck et al., 1997].
Importantly, there is much less functional redundancy in RXRα/RAR compound mutants (Table 2, Table 3, and Table 4). As RXRα/RAR heterodimers are the functional transducing units, the easiest way to interpret these observations is to postulate that redundancy occurs only when a single partner of the “physiological heterodimer” is missing [Kastner et al., 1997a; Mascrez et al., 1998; Mascrez et al., 2001]. In other words, the activity of the “alternative heterodimer” may still be above the functional threshold level when either the RXR or the RAR partner of the “physiological heterodimer” is missing, but not when both are deleted. According to this interpretation, the selective involvement of a given RAR or RXR could be revealed only under conditions where the functional threshold level is not reached. This would notably account for the observations that the role of the RXRα AF-1 or AF-2 cannot be fully revealed, unless the activity of the “physiological heterodimer” is altered by the additional ablation of either the RAR partner or the redundant RXR isotypes [Mascrez et al., 1998; Mascrez et al., 2001]. Thus, any conditions which would lower the activity of RXR/RAR heterodimers (for instance a decreased availability of RA), may reduce or abrogate functional redundancy. As the supplies in vitamin A, the precursor of RA, could be more limiting in wild-life than in the context of an animal facility, the functional redundancies between RAR and RXR may therefore be much less prominent in natural environments.
Quite surprisingly, RXR loss-of-function mutants do not display defects in morphogenesis other than those observed in the fetal VAD syndrome or upon ablation of the RA-synthesizing enzymes. This suggests that RXRs are involved in morphogenesis solely through their heterodimerization with RARs. Accordingly, mice harbouring null mutations for the other nuclear receptors (NRs) dimerizing with RXRs and for which a ligand is known (i.e., PPARα, PPARβ, TRα, TRβ, VDR, LXRα, LXRβ, FXR, PXR, CAR) do not display morphological abnormalities [Flamant and Samarut, 2003; Kato, 2000; Lee and Gonzalez, 1996; Peet et al., 1998; Peters et al., 2000; Sinal et al., 2000; Staudinger et al., 2001; Wei et al., 2000; Xie et al., 2001], with the exception of PPARγ-null mice [Barak et al., 1999]. In this latter case, the embryonic heart defect is clearly secondary to a severe placental hypoplasia [Barak et al., 1999]. Thus, amongst the multiple “hormone-like” signals that RXR/NR heterodimers can integrate, RA appears to be the most crucial, if not the only one involved in morphogenesis of the embryo proper.
The genetic approach summarized in this review has provided valuable insights on the functions of RA receptors during development. However, this strategy has intrinsic limitations, which are mostly due to the introduction of mutations in the germline. First, the effect of a germline mutation may be functionally compensated for during development, thus precluding the appearance of a defect. On the other hand, the mutation can be lethal in utero (e.g., the Rxra knockout and the RAR compound null mutants), thus preventing analysis of the functions of the gene at postnatal stages. The mutation can also arrest the development of a given organ at an early stage, thus precluding further analysis of the gene functions at a later stage. Moreover, introducing mutations in germline makes it difficult to distinguish cell-autonomous from non-cell autonomous functions of genes belonging to families, such as RARs and RXRs that are involved in pleiotropic signalling pathways. In many instances, these limitations may actually prevent the determination of the function of a given gene product in a defined cell type/tissue and/or at a given time of the life of the animal. This is obviously the case for RARs and RXRs.
To overcome all these limitations, strategies for spatio-temporally-controlled somatic mutagenesis of RARs and RXRs in mice have been designed, which are based on the cell type-specific expression of a tamoxifen-inducible form of the Cre recombinase (called Cre-ERT and Cre-ERT2) (reviewed in [Metzger and Chambon, 2001; Metzger et al., 2003]). The combined use of transgenic mice expressing chimeric tamoxifen-inducible Cre recombinases in specific cell types and of mouse lines harbouring loxP-flanked conditional alleles for RAR and RXR genes will provide invaluable models to elucidate the postnatal functions of retinoid receptors.
Сайт создан в системе uCoz