Открытие RNA interference (RNAi) произвело революцию в биологии РНК. Исследователи открыли 'скрытые' слои регуляции генной экспрессии, в которой многие ранее не идентифицированные семейства малых РНК (состоящие приблизительно из 20-30 нуклеотидов) обеспечивают генное молчание. Разнообразный набор ген-регуляторных механизмов, как было установлено, использует ключевые ступени в процессе RNAi, включая механизмы, которые замалчивают эндогенные гены и механизмы, которые ограничивают экспрессию паразитических и патогенных возбудителей, таких как транспозоны и вирусы2-5.
Базовый RNAi процесс может быть подразделен на три ступени6, 7. Во-первых длинная double-stranded RNA (dsRNA), которая экспрессируется в или вносятся в клетку (напр., как результат спаривания оснований смыслового и антисмыслового транскриптов или как результат образования stem-loop структур) подвергается процессингу в малые РНК дуплексы с помощью ribonuclease III (RNaseIII) энзима, известного как Dicer. Во-вторых, эти дуплексы размотаны и одна нить преимущественно загружается на белковый комплекс, известный как RNA-induced silencing complex (RISC). В-третьих, этот комплекс эффективно ищет транскриптом и находит потенциальные РНК мишени. Загруженная single-stranded RNA (ssRNA), наз. ведущей нитью, затем управляет эндонуклеазой, которая присутствует в RISC (иногда наз. 'slicer' и сегодня известна как белок Argonaute8-11), чтобы расщепить мРНК, которые содержат последовательность, гомологичную ssRNA, в течение многих раундов. Т.о., ведущая нить предопределяет специфичность последовательностей в RNAi реакции.
У разных организмов RNAi пути представлены разными белками и механизмами, но они оперируют с помощью поразительно конвергентных стратегий. У всех организмов, которые были изучены, RNAi использует два основных компонента: малые РНК, которые предопределяют специфичность реакции; и белки Argonaute, завершают репрессию. В зависимости от природы Argonaute в RISC и от степени комплементарности между малой РНК и последовательностью мишенью в мРНК, ассоциация RISC с мРНК мишенями, как было установлено, приводит к разным результатам: она может контролировать белковый синтез и стабильность мРНК, поддерживать целостность генома или продуцировать специфические наборы малых РНК8, 12. Анализ биогенеза малых РНК и их механизмов обнаружения мишеней был улучшен благодаря появлению высокопроизводительных технологий секвенирования и сложной биоинформатики13. Возникающая в результате этих исследований картина показывает, что RNAi системы у различных организмов могут быть улучшены многими способами и такие модификации включают встроенные молекулярные 'управители', которые предопределяют размер малых РНК, структуры, которые детерминируют какая нить малой РНК будет селектирована, механизмы, которые управляют дальнейшими раундами амплификации малых РНК или защищают против незаконного (off-target (unrestricted and unrelated)) молчания.
Др. появившейся находкой в этой области является то, что активность пути RNAi является предметом интенсивной регуляции на разных уровнях, от уровня биогенеза малых РНК до способа замалчивания у RISC.
Biogenesis of small RNAs
Отличительным признаком RNAi являются короткие (~20-30 nucleotide) dsRNAs - известные как малые РНК - генерируемые за счет активности RNaseIII энзимов (или одного Dicer или Drosha и Dicer). Две основных категории малых РНК были установлены на базе их предшественников. Расщепление экзогенных длинных предшественников dsRNA в ответ на вирусную инфекцию или после искусственного введения генерирует short interfering RNAs (siRNAs), тогда как процессинг кодируемых геномом stem-loop структур генерирует microRNAs (miRNAs). Используя высокопроизводительную технологию секвенирования, открыто несколько новых классов эндогенных малых РНК , сюда входят PIWI-interacting RNAs (piRNAs) and endogenous siRNAs (endo-siRNAs or esiRNAs).
Общим свойством всех этих малых РНК является то, что они загружаются на Argonaute белки, чтобы осуществить свою targeting функцию. Общая схема генерации малых РНК представлена на Рис. 1.
siRNA biogenesis
Dicer (Table 1) преобразует длинные РНК дуплексы и генерирует siRNAs. Эти малые РНК являются приблизительно в 21-25-нуклеотида дуплексами с фосфатной группой на обоих 5' концах и гидрокисльными группами и в два нуклеотида довесками на обоих 3' концах, все являются характерными особенностями RNaseIII-обеспечиваемого расщепления. Белок Dicer содержит PAZ домен, которые соединяется с 3' концом siRNA, и два RNaseIII домена, которые обладают каталитической активностью. Он функционирует как мономер14, но домены RNaseIII ассоциируют др. с др., чтобы сформировать 'внутренний димер' (see page 405). Расстояние между доменом PAZ и двумя доменами RNaseIII длиной в 25 base pairs (bp) РНК15. Т.о.,, Dicer сам является молекулярным управителем (ruler).
miRNA biogenesis
Сходным образом, miRNAs являются короткими (~21-25-нуклеотидов) РНК молекулами16; , однако их биогенез существенно отличается от такового для siRNAs. Первичные предшественники miRNAs (pri-miRNAs) кодируются в геноме и имеют отношение к геномным областям, они в основном транскрибируются с помощью RNA polymerase II (ref. 17). The pri-miRNAs содержат stem-loop структуры, которые дают убежище miRNA на 5' или 3' половине ствола (stem). Во время продукции miRNA у растений один из типов RNaseIII, Dicer-like protein 1 (DCL1), генерирует miRNA-miRNA* дуплекс в ядре (miRNA* становится последовательностью stem-loop, которая спаривается с miRNA, эквивалентом нити пассажира siRNA дуплекса). Напротив, у животных, miRNAs возникают в результате двухступенчатого процесса, в котором локализованная в ядре RNaseIII Drosha определяет один конец miRNA-miRNA* дуплекса и высвобождает предшественника miRNA (pre-miRNA) ~65-70 нуклеотидов. Шпилька pre-miRNA экспортируется в цитоплазму, где Dicer заканчивает процессинг.
Drosha представляет собой большой комплекс, известный как microprocessor комплекс, который функционирует подобно молекулярному управителю, чтобы определить сайт расщепления в pri-miRNAs18, 19. В этом комплексе Drosha взаимодействует со своим кофактором, известным как DGCR8 или Pasha (в зависимости от вида), который также соединяется с dsRNA (посредством своего dsRNA-связывающего домена; dsRBD)20, 21. Типичная pri-miRNA метазоа состоит из ствола в 33-bp, терминальной петли и ssRNA сегментов по флангам. Фланкирующие сегменты являются критическими для связывания с DGCR8, а 33-bp ствол также необходим для эффективного связывания. Drosha может взаимодействовать временно со стволом этого 'pre-cleavage' комплекса и подвергать процессингу центр энзима, расположенный приблизительно на расстоянии 11 от соединения ssRNA-dsRNA, давая несимметричную пару разрывов в РНК, чтобы дать в ~65-70-нуклеотидов pre-miRNA. Т.о., DGCR8 может действовать как молекулярный якорь, который измеряет расстояние от ssRNA-dsRNA соединения. Возможно, что микропроцессорный комплекс д. распознавать терминальную петлю как ssRNA и соединяться со структурой stem-loop в противоположной ориентации. В этом случае может происходить абортивное расщепление по альтернативному сайту ~11 bp от терминальной петли. Однако большинство pri-miRNAs содержит внутренние вздутия или слабо спаренные основания ~11 bp от терминальной петли, это уменьшает процессинг в этом направлении18.
Хотя многие из последовательностей, кодирующие miRNAs располагаются внутри интронов, но недавно были идентифицированы кластеры, кодирующие miRNAs, которые подвергаются процессингу непосредственно с помощью сплайсесом вместо Drosha22, 23. 3' конец stem-loop предшественника этих интронных miRNAs (известный как mirtrons) совпадает с 3' сплайс-сайтом малого аннотированного интрона и разрезается с помощью того же пути сплайсинга, что и pre-mRNA в ядре вместо того, чтобы расщепляться с помощью Drosha. Затем предшественники mirtron, которые высвобождаются с помощью сплайсесом в виде аркана (lasso), линеаризуются с помощью de-branching энзима. Затем они вступают на путь процессинга miRNA непосредственно (путем воспроизведения структурных свойств шпилек pre-miRNA) и после этого экспортируются в цитоплазму и подвергаются процессингу с помощью белка Dicer, обходя обеспечиваемое Drosha расщепление.
Неточность расщепления с помощью Drosha или Dicer может приводить к продукции ряда miRNA-miRNA* дуплексов с разными 5' и 3' концами. Большинство miRNAs животных образуют несовершенные гибриды с последовательностями в мРНК мишени, с наибольшей специфичностью спаривания, обеспечиваемой 5'-проксимальной областью miRNA (т.е., позиции 2-8; также известной как запальная зона (seed region))24, 25. Неточность расщепления или изменяет seed последовательность или инвертирует относительные стабильности 5' и 3' концов дуплекса. Результаты недавних исследований по глубокому секвенированию малых РНК , однако показали, что клетки человека могут получать преимущества от такого неточного расщепления, т.к. генерация разных наборов miRNAs с одиночного предшественника может быть способом расширения сети факторов и процессов. которые регулируются с помощью miRNAs26-28.
RNaseIII-independent pathways of small RNA biogenesis
В некоторых системах малые РНК, по-видимому, не продуцируются в ответ на dsRNA, но сигналы молчания всё ещё амплифицируются. Т.к. эти малые рНК не возникают из dsRNA предшественников, то RNaseIII энзимы не могут использоваться для их генерации. Поэтому эти находки ставят под вопрос определение RNAi. Мы опишем известные RNaseIII-независимые пути продукции малых РНК, включая те, которые производят piRNAs, 21U-RNAs и вторичные siRNAs у Caenorhabditis elegans.
Малые РНК, известные как piRNAs были названы благодаря их способности связывать группу Argonaute белков, известных как PIWI белки. Как отмечалось ранее, члены семейства Argonaute соединяются непосредственно с малыми направляющими РНК и располагаются на сердцевине всех известных RISCs8. Argonaute белки состоят из варьирующего N-терминального домена и трех законсервированных доменов ( PAZ, middle (MID) и PIWI доменов)8, 29, 30. 3' конец малых РНК взаимодействует с PAZ доменом, тогда как фосфатная группа на 5' конце малых РНК соединяется с образующим мостик через расщеп MID доменом и PIWI доменом29, 30 (see page 405). PIWI обладает RNaseH-подобной складчатой структурой10 и режущей активностью (хотя некоторые белки Argonaute, по-видимому, обладают режущей активностью). Существуют три филогенетические группы белков Argonaute29: подсемейство AGO (или AGO clade), названное по члену основателю Arabidopsis thaliana ARGONAUTE 1 (AGO1); подсемейство PIWI, названо по D. melanogaster PIWI (P-element-induced wimpy testis); и WAGO (worm-specific Argonaute) подсемейство белков. специфичных для C. elegans. Белки подсемейства PIWI соединяются с piRNAs31-37 (Table 1). Эти малые РНК были обнаружены только в зародышевых клетках и они важны для развития зародышевой линии и супрессируют активность транспозонов в клетках зародышевой линии млекопитающих, рыб и D. melanogaster. Они приблизительно длиной в 24-31 нуклеотида (немного длиннее, чем miRNAs), обычно имеют uridine на 5' конце и несут 5' monophosphate. В отличие от miRNAs млекопитающих, но одинаково с miRNAs растений, piRNAs имеют 2'-O-methyl (2'-O-Me) модификацию нуклеотида на 3' конце, модификацию, которая выполняется с помощью HEN1-like methyltransferase38-42.Если Dicer мутантен, то продукция piRNAs не затрагивается, указывая тем самым, что их биогенез отличается от такового у miRNAs и siRNAs и не использует dsRNA предшественники31, 42.
Секвенирование малых РНК, ассоциированных с D. melanogaster PIWI-подсемейством белков (PIWI, Aubergine (AUB) и AGO3)43, 44 показало, что piRNAs, ассоциированные с AUB и PIWI, происходят в основном и антисмысловой нити ретротранспозонов, тогда как AGO3-ассоциированные piRNAs возникают главным образом со смысловой нити. AUB- и PIWI-ассоциированные piRNAs обнаруживают строгое предпочтение к uridine на их 5' концах, тогда как AGO3-ассоциированные piRNAs обнаруживают предпочтение к adenosine нуклеотида 10. Первые 10 нуклеотидов из AUB-ассоциированных piRNAs могут быть комплементарными первым 10 нуклеотидам из AGO3-ассоциированных piRNAs. Кроме того, подсемейство белков PIWI облают режущей активностью, которая позволяет им расщеплять РНК субстрат оппозитный позиции 10 связанной с ним piRNA32, 44. Эти наблюдения указывают на то, что piRNAs обладают само-амплифицирующейся петлей (Fig. 1), в которой смысловые piRNAs, ассоциированные с AGO3, разрезают длинные антисмысловые транскрипты и руководят образованием 5' конца антисмысловых piRNAs, связанных с AUB или PIWI, и vice versa. Т.о., в этой амплификационной петле, которая называется ping-pong циклом43, транспозоны являются как источником piRNAs, так и мишенью для piRNA-обеспечиваемого молчания. После образования продукты расщепления загружаются на др. члена подсемейства PIWI, затем (пока не идентифицированная) нуклеазная активность генерирует 3' конец piRNA, при этом специфический размер piRNA предопределяется с помощью отпечатка белка подсемейства PIWI на РНКЮ ступень. которая, по-видимому, предшествует 2'-O-Me модификации38. В каждом белке PIWI-подсемейства, домен PAZ может располагаться на расстоянии от MID домена, это соответствует длине каждой из piRNA. Т.о., PAZ домен может функционировать как часть молекулярного управителя для процессинга piRNAs определенного размера. Сигнатуры этого амплификационного цикла наблюдаются также в зародышевых клетках рыбок данио (Danio rerio) и в зародышевых клетках млекопитающих до ст. пахитены мейоза во время сперматогенеза42, 45.
Подсемейство белков PIWI и , по-видимому, ассоциированные с ними piRNAs загружаются в эмбрион с яйца8, это позволяет допустить, что piRNAs, которые инициируют амплификацию цикла биогенеза piRNA (который генерирует вторичные piRNAs), д. поставляться за счет передачи с зародышевой линией. Но некоторые находки указывают на то, что д.с существовать механизмы биогенеза piRNA иные, чем амплификация, индуцируемые с помощью материнских piRNAs. Во-первых, цикл амплификации у D. melanogaster задействует в основном AGO3 и AUB43, 44, а piRNAs всё ещё загружаются на PIWI, которые пространственно отделены от этих белков на субклеточном и клеточном уровне32, 43, 44. Во-вторых, piRNAs происходят из определенного кластера piRNA в геноме (локус flamenco), ассоциированы почти исключительно с PIWI43. Эти находки указывают на то, что происходящие из flamenco piRNAs продуцируются за счет пути, независимого от амплификационой петли. Существует ли такой путь биогенеза piRNA предстоит определить.
Что сначала казалось является др. типом малых РНК, 21U-RNA, была обнаружена у C. elegans. Эти малые РНК точно в 21 нуклеотид и обнаруживают склонность к уридину на 5' конце (но не к остальным 20 нуклеотидам), а генетические регионы, которые кодируют их, содержат характерный мотив последовательностей ~42 bp выше первого нуклеотида малой РНК46. Возможно, что эти РНК происходят тысяч отдельных, автономно экспрессируемых локусов, которые широко разбросаны по двум крупным регионам одной хромосомы. Они экспрессируются только в зародышевой линии и взаимодействуют с белком подсемейства PIWI PRG-1 (refs 47, 48); следовательно, 21U-RNAs являются у C. elegans эквивалентами piRNAs по определению. Подобно piRNAs, они зависят от активности PRG-1 для своего накопления и их продукция не зависит от DCR-1 ( C. elegans Dicer белок) . C. elegans с мутациями в prg-1 меньшие размеры выводков и чувствительный к температуре фенотип стерильности, это согласуется с идеей, что белки подсемейства PIWI участвуют в поддержании зародышевой линии. Подобно piRNAs обнаруживаются в зародышевых клетках млекопитающих в пахитене33, 34, 21U-RNAs обладают удивительным разнообразием последовательностей, но лишены очевидных мишеней.
Малые РНК с ролью подобной piRNAs были также найдены у снабженных ресничками Tetrahymena thermophila. Эти scan РНК (scnRNAs) управляют устранением подобных транспозону последовательностей ДНК и ассоциируют с белком PIWI-подсемейства, TWI1 (ref 8), но, в отличие от piRNAs и 21U-РНК, произведены Dicer-зависимым путем49. Эти три примера (piRNAs, 21U-RNAs и scnRNAs) указывают на то, что центральный PIWI and piRNA аппарат может участвовать в продукции малых РНК и заставлять молчать мишени с помощью разных стратегий.
Пути замалчивания РНК включают механизмы, которые подавляют эндогенные гены и ограничивают экспрессию эгоистичного или экзогенного генетического материала, и эти пути часто обладают общими компонентами такими как Dicer. Следовательно, д. существовать конкуренция между разными путями замалчивания для определенных компонентов. Пути преодоления такой конкуренции также д. существовать; напр., путем амплификации слабого сигнала к молчанию. У
C. elegans, оперируют самостоятельные белки Argonaute на разных стадиях RNAi, управляя молчанием генов последовательным способом
50 - вторая стадия которого использует RNaseIII-независимый биогенез малых РНК. Во-первых, первичных белок Argonaute (такой как RDE-1 для экзогенных siRNAs (exo-siRNAs) и ERGO-1 для endo-siRNAs) управляется с помощью 'первичных' siRNAs (т.е., первый раунд siRNAs), которые получаются из длинных dsRNAs с помощью DCR-1. Во-вторых, сигнал молчания амплифицируется за счет продукции 'вторичных' siRNAs за счет действия RNA-зависимых RNA polymerases (RdRPs) (Fig. 1). Эти вторичные siRNAs затем соединяются дифференциально со вторичными белками Argonaute (SAGOs, членами подсемейства WAGO), которые обеспечивают нижестоящее молчание. У растений РНК с аберрантными свойствами, включая отсутствие poly(A) хвоста и отсутствие 5' cap, копируются в двунитчатые формы с помощью RdRPs и становятся субстратами для Dicer, который превращает их в дуплексы siRNA
12. Напротив у
C. elegans соматический RdRP в основном продуцирует в 21-нуклеотид однонитчатые, 5'-triphosphorylated малые РНК непосредственно из мРНК мишеней directly from the target mRNA независимым от затраки способом без необходимости в Dicer-обеспечиваемом расщеплении dsRNA
51-53. Такое рекрутирование RdRP непосредственно на мРНК мишень делает возможным синтез dsRNA без использования siRNAs, генерируемых в ответ на исходный триггер, хотя неясно, как формируется 3' конец этих вторичных siRNAs и каков молекулярный управитель (ruler), который предопределяет их размер.
Blurring of the boundaries between small RNA types
Итак три основных класса малых РНК - siRNAs, miRNAs и piRNAs - различаются по своему биогенезу и роли в клетках. Однако недавние находки размывают эти различия и показывают, что существуют даже более сложные взаимодействия между факторами, участвующими в биогенезе малых РНК. Глубокое секвенирование малых РНК из соматических тканей и культивируемых соматических клеток у D. melanogaster выявило др. класс малых РНК, состоящий из 3'-methylated, в 21-нуклеотид РНК, происходящих из генома D. melanogaster . Эти эндогенные РНК происходят из транспозонов и из некоторых локусов, включая локусы, кодирующие cis-natural антисмысловые пары транскриптов и длинные stem-loop структуры, содержащие множество не совпадающих пар в своих стеблях (stems)54-57. У D. melanogaster, самостоятельные Dicer-содержащие комплексы продуцируют exo-siRNAs и miRNAs58, 59. DCR-1 генерирует miRNAs, действуя со своим партнером dsRNA-связывающим белком, Loquacious (LOQS)60, 61 и miRNAs загружаются на AGO1. Напротив, DCR-2, вместе сос своим партнером dsRNA-связывающим белком, R2D2 (ref. 62), генерирует exo-siRNAs, которые загружаются на AGO2. Подобно exo-siRNAs, недавно открытые эндогенные малые РНК продуцируются с помощью DCR-2-зависимого пути и загружаются на AGO2 и они поэтому наз. endo-siRNAs. Однако генерация большинства endo-siRNAs нуждается в LOQS54, 56, dsRBD-содержащем партнере DCR-1 на пути miRNA60, 61, но не в R2D2, партнере DCR-2 (ref. 62). У D. melanogaster при недостаточности по DCR-2 или AGO2, экспрессия транспозонов усиливается, так что endo-siRNAs могут оказаться основным механизмом замалчивания 'эгоистических (selfish)' генетических элементов в соматических клетках, которые лишены piRNA пути. Следовательно, endo-siRNAs и piRNAs фундаментально сходны в том, что они защищают организмы против базирующихся на нуклеиновых кислотах 'parasites'. Эти находки также показывают, что D. melanogaster имеет два RNAi пути, которые репрессируют экспрессию транспозонов. Ооциты мышей, как было установлено, также содержат endo-siRNAs. Эти РНК происходят из различных источников, включая транспозоны63, 64; однако некоторые подвергаются процессингу из перекрывающихся регионов функциональных генов и родственных им псевдогенов. Эти находки подтверждают, что псевдогены, которые как полагали являются нефункциональными белковыми 'ископаемыми', могут регулировать экспрессию своих генов основателей.
Хотя siRNAs и miRNAs отнесены к разным категориям в терминах их происхождения скорее, чем их размеров и функции
7, 12, открытие endo-siRNAs делает трудно различимыми siRNAs и miRNAs. Это размывание границ между разными типами малых РНК имеет интересно эволюционное значение. Длинные stem-loop структуры, которые преобразуются, чтобы сформировать endo-siRNAs напоминают pre-miRNAs растений. Одна из гипотез эволюционного происхождения растительных miRNAs заключается в том, что новые локусы растительных miRNA развиваются из инвертированной дупликации локусов основателей, которые если транскрибируются, то д. давать шпилечные RNAs
12. Эти шпилечные РНК д. обладать практически полной само-комплементарностью и м. преобразовываться с помощью Dicer-подобных энзимов, отличных от DCL1, основного miRNA-processing энзима растений, т.к. DCL1 обладает ограниченной активностью против таких субстратов. Последующее накопление мутаций в результате генетического дрейфа д. давать шпильки с несовершенной комплементарностью, которые затем преобразуются с помощью DCL1. Т.о., stem-loop структуры, из которых происходят endo-siRNAs д. быть эволюционно промежуточными образованиями, которые постепенно трансформируются в предшественников miRNA. Возможно, что такое адаптивное переключение может также происходить во время эволюции генов, кодирующих miRNA у
D. melanogaster, у которых DCR-1 д. затем генерировать miRNAs вместо endo-siRNAs, генерируемых с помощью DCR-2.
Loading and sorting of small RNAs by the RISC
На путях замалчивания генов, инициируемых с помощью dsRNA предшественников, Dicer-обусловленное расщепление дает промежуточные образования малых dsRNA (дуплексы малых РНК). Эти дуплексы малых РНК д. быть диссоциированы на 'компетентные' одиночные нити с тем, чтобы функционировать как поводыри для RISCs. Для каждого дуплекса малой РНК только одна нить, ведущая нить, загружается на специфический белок Argonaute и собирается в активный RISC; др. нить, нить-пассажир, разрушается. Большинство эукариот экспрессируют более одного белка Argonaute и эти белки соединяются с малыми РНК в независимой от последовательности манере. Как же малые РНК сортируются и загружаются на специфический белок Argonaute?
Loading
Малые РНК, полученные из dsRNA предшественников, превращаются из дуплексов в однонитчатую форму, фактически загружаемую в RISC. Ключевой ступенью в превращении RISC из его формы предшественника (pre-RISC), которая содержит дуплекс малой РНК, в её зрелую форму (holo-RISC), которая содержит только ведущую нить, является разматывание нити малой РНК и предпочтительный выбор нити. Распространенное представление о загрузке RISC состоит в том, что термодинамическая асимметрия вдоль дуплекса малой РНК определяет, какая нить РНК будет сохранена, а какая удалена. Конкретнее, нить, которая имеет свой собственный 5' конец на термодинамически менее стабильном конце дуплекса малой РНК преимущественно загружается в RISC в качестве ведущей нити, феномен, обозначаемый как правило асимметрии65, 66.
Для siRNAs, известные взаимодействия между белками Dicer и Argonaute8 показывают, что продукция малых РНК и сборка RISC могут быть физически связанными. Напр., у D. melanogaster, DCR-2 не просто переносчик siRNAs а отдельные RISC, но и формирует часть RISC вместе с siRNAs, указывая на то. что роль DCR-2 распространяется за пределы фазы инициации. Загрузка дуплексов siRNA на AGO2 облегчается с помощью RISC-загружающего комплекса, который содержит DCR-2 и его dsRBD-содержащего партнера, R2D2 (refs 62, 67). Определенная нить дуплекса siRNA , которая загружается на AGO2, по-видимому, детерминируется по ориентации DCR-2-R2D2 гетеродимера на дуплексе siRNA68. R2D2 , как полагают, ощущает термодинамическую стабильность дуплекса siRNA и соединяется с более стабильным концом siRNA, в то время как DCR-2 рекрутируется на менее стабильный конец. Гетеродимер, по-видимому, рекрутирует AGO2 благодаря взаимодействию между DCR-2 и AGO2. Предыдущие модели предполагали, что переход от двунитчатого silencing trigger к однонитчатой структуре обеспечивается за счет неидентифицированной ATФ-зависимой РНК helicase. Однако расплетание дуплекса siRNA и загрузка одиночной нити в RISC облегчаются за счет отрезания не включенной (пассажирской) нити с помощью AGO2, процесс, который не нуждается в АТФ69-71 (Fig. 1). Разрезание в середине пассажирской нити, как если бы пассажирская нить была РНК мишенью, следует ожидать будет уменьшать температуру отжига (annealing) и свободную энергию формирования дуплекса, это в свою очередь, облегчает разделение нитей siRNA. Эти данные подтверждают модель, согласно которой siRNAs первоначально загружаются в виде дуплекса на AGO2-содержащий pre-RISC (Fig. 2).
Напротив у человека pre-miRNAs, как известно, соединяются с предварительно организованным тримерным комплексом из AGO2, DICER1 и DICER1's dsRBD-содержащего партнера, TRBP72. Этот комплекс может расщеплять РНК мишени, используя pre-miRNA и может делать различия между miRNA и miRNA*, в отсутствие гидролиз АТФ72, 73, указывая тем самым, что DICER1-обеспечиваемое расщепление и ощущение термодинамической стабильности происходит последовательно в AGO2-DICER1-TRBP комплексе.
Этот процесс, с помощью которого pre-RISC превращается в holo-RISC, может также происходить путем независимого от разрезания механизма. 3 из 4-х Argonaute белков у человека (AGO1, AGO3 и AGO4) лишены расщепляющей активности, но тем не менее загружаются с однонитчатыми ведущими siRNAs
9, 11, 28. Сходным образом, однонитчатые miRNAs обнаруживаются ассоциированными с AGO2 у человека, несмотря на ожидание, что несовпадения в не распутанной pre-miRNA будут блокировать активность AGO2 по отщеплению нити-пассажира. Т.о., д. существовать независимый от расщепления (обходной) механизм сборки RISC. RNA helicase A , была идентифицирована в качестве кандидата на роль распутывания дуплексов в этом процессе
74.
Sorting
Будучи собранными, RISCs обеспечивают ряд эффекторных ступеней во всех механизмах замалчивания РНК, от репрессии трансляции до поддержания стабильности генома. Специализированные функции RISCs скорее всего являются результатом определенных белков, которые ассоциируют с каждым белком Argonaute. Др. словами, разные варианты RISC отличаются по их составляющему белку Argonaute. Т.о., важно, чтобы специфический набор малых ведущих РНК направлялся на специфический белок Argonaute. Анализ того, как разные типы малых РНК направляются на разные Argonaute белки, показывает, что существуют множественные механизмы: детерминанты сортировки для малых РНК варьируют в зависимости от структуры дуплекса малой РНК, чтобы идентифицировать 5' нуклеотид , присутствие и степень модификаций этого нуклеотида.
У D. melanogaster, pre-miRNAs преобразуется с помощью DCR-1, тогда как дуплексы exo-siRNA продуцируются с помощью DCR-2 из длинных dsRNAs58 (Fig. 2a). Малые РНК затем, по-видимому, загружаются или на AGO1 или AGO2, в зависимости от структуры дуплексов малых промежуточных РНК75. Если дуплексы имеют вздутия в середине (часто наблюдаемые у предшественников miRNA), то малая РНК направляется на AGO1. Ели дуплекс в точности подогнан, то малая РНК направляется на AGO2. Это происходит из-за того, что гетеродимер DCR-2-R2D2, который рекрутируется на AGO2, чтобы сформировать pre-RISC, соединяется с высоко спаренными дуплексами малых РНК, но плохо с дуплексами с центральным несовпадением. Т.о., DCR-2-R2D2 гетеродимер не только предопределяет полярность загружаемой siRNA на базе правила термодинамической стабильности, но и также функционирует как сторож (gatekeeper) для сборки содержащего AGO2 RISC, способствуя инкорпорации siRNAs по сравнению с miRNAs. Эти наблюдения указывают на то, что siRNA дуплекс диссоциирует от активного сайта белка Dicer после того как он продуцируется и затем повторно залавливается гетеродимером DCR-2-R2D2. Однако, хотя AGO1 благоприятствует связыванию дуплексов малых РНК с центральными несовпадениями, большая часть miRNA-miRNA* дуплексов со спаренной центральной областью всё ещё вступает в содержащие AGO1 RISCs55, указывая тем самым, что путь с загрузкой AGO1 является избирательным, а не рядовым путем для малых РНК, отторгаемых с помощью AGO2 пути.
Качественные особенности нуклеотида на 5' конце и степень, с которой этот нуклеотид фосфорилируется, также влияет на то, какой белок Argonaute ассоциирует с малой РНК. В противоположность наблюдаемому у D. melanogaster, процессинг с помощью Dicer может быть не связан с белками Argonaute у A. thaliana из-за того, что у этого вида miRNAs все генерируются с помощью одного определенного белка Dicer, DCL1, но всё ещё сортируются и загружаются на разные Argonaute белки. У A. thaliana, miRNAs и транс-действующие siRNAs (ta-siRNAs), класс малых РНК, которые регулируют развитие растений12, обычно имеют 5' uridine и преимущественно ассоциируют с AGO1 (ref. 76) (Fig. 2b). Напротив, AGO2 ассоциирует преимущественно с малыми РНК, содержащими 5' аденозины, а AGO5 предпочитает 5' cytidines. Интересно, что если противоположная нить miRNA (т.е., miRNA*) имеет 5' adenosine или 5' cytidine, то она соединяется или с AGO2 или AGO5, соотв. Эти находки привели к предположению, что сродство связывания белков Argonaute для малых РНК детерминируется нуклеотидом на 5' конце. Хотя эти предпочтения 5'-нуклеотида верны для этих белков Argonaute у растений, наблюдаются исключения: A. thaliana miRNA, известная как miR-172 имеет 5' adenosine, но преимущественно ассоциирует с AGO1 (ref. 77); а AGO7 преимущественно ассоциирует с miR-390, которая имеет 5' adenosine77. Следовательно, 5' нуклеотид, по-видимому, не единственный детерминант ассоциации Argonaute.
Второй механизм может оперировать, давая вторичные siRNAs у C. elegans. Эти малые РНК специфически загружаются на SAGOs50. Вторичные siRNAs несут 5'-triphosphate модификацию51, 52, признак RdRP продуктов, которые могут функционировать как элемент распознавания для связывания SAGO, тогда как исключение связывания обеспечивается первичным Argonaute, таким как RDE-1.
Endo-siRNAs у C. elegans (включая уже упомянутые вторичные siRNAs) и у Schizosaccharomyces pombe (делящиеся дрожжи) имеют поразительную смещенную нить, в которой только антисмысловая нить siRNA, соответствующая нити РНК, синтезируемой с помощью RdRP, она загружается на комплексы, содержащие Argonaute. Т.к. C. elegans RdRPs продуцируют малые РНК непосредственно из мРНК мишеней primer-независимым способом (Fig. 2c), все вторичные siRNAs имеют негативную полярность и действуют, чтобы усиливать молчание мРНК мишеней50-52. У S. pombe, предпочтительная (bias) нить, по-видимому, результат др. механизма. Физическая ассоциация Dicer с RdRP-содержащим комплексом, известным как RDRC, и с Argonaute-содержащим комплексом, известным как RNA-induced transcriptional silencing complex (RITS) (see page 413) может облегчать загрузку siRNAs на белки Argonaute направленным способом, т.к. Dicer движется вдоль и расщепляет dsRNA продукты RdRP, давая антисмысловую нить bias. Это указывает на то, что полярность Dicer процессинга предопределяет полярность нити siRNA, загружаемой на белок Argonaute.
Argonaute белки стали разнообразными в ходе эволюции, приобретя ряд функций
8, 12. Эти находки, связанные с сортировкой малых РНК, предполагают, что диверсификация белков Argonaute является следствием того, какие малые РНК они рекрутируют. Возможно, что конформация белка Argonaute диктует, какие малые РНК будут его партнерами, но структуры эукариотических белков Argonaute необходимо определить прежде, чем это можно будет оценить.
Safeguards in silencing pathways
Во время замалчивания РНК одиночный не специфичный к последовательностям РНК-связывающий белок (Argonaute) нагружается малыми ведущими РНК с разнообразными последовательностями, давая эффекторные комплексы (RISCs). Т.о., эта система нуждается в охране, чтобы гарантировать, что Argonaute будет соединяться с малой ведущей РНК, а не с деградирующей малой РНК, тем самым избегая 'off-target' молчания. Такие охранные системы, по-видимому, зависят в основном от структурных свойств, специфичных для малых ведущих РНК.
Как упоминалось ранее, Dicer помогает загружать siRNAs в RISC, предупреждая siRNAs от свободной диффузии в цитоплазме после их продукции. Эта функция Dicer, по-видимому, также нацелена на дискриминацию подлинных siRNAs от различных продуктов деградации РНК в клетке. Процессинг с помощью RNaseIII энзимов (таких как Dicer) характерным образом дает малые РНК с 5' monophosphates и 3' в два нуклеотида довеском. Домен PAZ белков Argonaute может в качестве первого шага отличать деградирующие РНК (производные неродственных путей) от этих малых РНК путем соединения с характерными 3' довесками на малых РНК8, 12. Кроме того, чтобы инкорпорироваться в RISC и обеспечить расщепление мРНК мишени ведущая нить siRNA д. иметь фосфатную группу на 5' конце78. У человека 5' конец siRNAs фосфорилируется с помощью энзима CLP1 (ref. 79), который также играет роль в сплайсинге transfer РНК и формировании 3' концов мРНК. Интересно, что как сплайсинг tRNA, так и образование 3'-у мРНК происходят в ядре80, 81, указывая тем самым, что дуплексы siRNA с 5' гидроксильной группой транспортируются в или диффундируют в ядро и после фосфорилирования с помощью CLP1 экспортируются в цитоплазму и собираются в RISC.
Амплификация сигнала молчания д. быть сбалансирована против опасной амплификации молчание вне мишеней. Напр., slicer-обеспечиваемый ping-pong механизм для продукции piRNA не ведет к 'transitive' молчанию РНК (при котором RdRPs синтезируют siRNAs, комплементарные последовательностям, стоящим выше или ниже инициального региона триггера в мРНК мишени mRNA). Вместо этого он ведет к консервативной амплификации функциональных первичных piRNA последовательностей (которые наследуются с помощью передачи через зародышевую линию). Однако вполне возможно, что любое событие вне мишени, обеспечиваемое RdRPs может приводить к цепи реакций или переходному эффекту молчания с вредными последствиями. Т.о., необходима защита, чтобы предупредить распространяющееся использование RdRPs. Поразительный аспект запуска, базирующейся на RdRP амплификации, проявляется только тогда, когда затрагивается мишень, так что амплификация сигнала молчания ограничивается случаями, в которых имеется реальная мишень51, 52. У C. elegans, процессинг trigger dsRNA и загрузка первичных siRNAs на RDE-1-содержащий комплекс, по-видимому, врождённо неэффективны, ограничиваются первым раундом распознавания мишени с помощью RDE-1-содержащих комплексов и минимизируют риск амплификации реакций молчания за пределами мишеней50. Кроме того, каждая вторичная siRNA, по-видимому, генерируется с помощью non-processive самозавершения за счет RdRP, тем самым ограничиваются переходные эффекты51-53. Более того, вторичные siRNAs ассоциируют с SAGOs, который лишен каталитических остатков для расщепления мРНК, указывая тем самым, что эти комплексы не могут генерировать расщепленные субстраты для дальнейшей амплификации, это в свою очередь предупреждает их от индукции экспоненциальной генерации вторичных siRNAs50 (but see also ref. 53 for a conflicting viewpoint). SAGOs также присутствует в ограниченном доступе и тем самым имеет ограниченную способность поддерживать множественные одновременные реакции молчания.
Др. фактор, который в C. elegans и S. pombe RNAi аппарате негативно регулируется с помощью законсервированной siRNA nuclease, наз. enhanced RNAi (ERI-1 и Eri1, соотв.)82, 83. У S. pombe, молчание трансгена связано с белковым комплексом, напоминающим комплекс TRAMP Saccharomyces cerevisiae (почкующиеся дрожжи), которые осуществляют надзор за ядром, направляя аберрантные транскрипты на деградацию с помощью экзосом84. Т.о., RNAi у S. pombe активно ограничивается от осуществления ею эффектов по всему геному и, по-видимому, является объектом конкуренции со стороны аппарата контроля качества РНК.
Target-sensing modes and effector modes of the RISC
Когда на RISC загружается ведущая нить малой РНК, как она находит мРНК мишень? Большая часть энергии связывания, которая закрепляет RISC на мРНК мишени получается от нуклеотидов в seed регионе малой РНК85. Очевидно, что доступность сайта-мишени может ощущаться с помощью врожденного, неспецифического сродства RISC к ssRNA, которое следует за инициальной специфической ассоциацией между RISC и мишенью (посредством 5' seed региона малой РНК)86. Но доступность сайта-мишени коррелирует непосредственно с эффективностью расщепления, указывая тем самым, что RISC не может разворачивать структуированную РНК.
мРНК мишени присутствуют в клетке в виде комплекса с ribonucleoproteins (RNPs)87, так что доступность контролируется также некоторыми РНК-связывающими белками, которые или маскируют сайт связывания мишени или облегчают расправление мишени. Следовательно, функция RISC, по-видимому, зависит от контекста, так что на его способ действия влияет не только структура сайтов связывания малых РНК на мишени, но и также определенные белки, ассоциированные с каждым из белков Argonaute. Напр., замалчивание генной экспрессии животными miRNAs осуществляется, по крайней мере, тремя независимыми механизмами посредством сайтов связывания, которые в основном располагаются в 3' нетранслируемой области мРНК мишеней: с помощью раcщепления мРНК, путем репрессии их трансляции и/или путем обеспечения деградации мРНК88, 89. Однако вклад репрессии трансляции или деградации мРНК в молчание генов, по-видимому, отличен для каждой miRNA-mRNA пары. Т.о., финальный исход регуляции miRNA возможно зависит от др. белков, взаимодействующих с мРНК мишенями или RISC, и противодействует эффектам miRNA, возникающим в результате дифференциальной регуляции в зависимости от белков. присутствующих в каждой ткани90.
Regulation of silencing pathways
Итак, картины путей молчания РНК, которые мы представили (shown in Figs 1 and 2) статичны. Чтобы внести дополнительную информацию в процесс молчания, важно усвоить информацию о том. как эти пути регулируются. Уже ясно, что конкуренция между разными путями замалчивания (напр., конкуренция между endo-siRNAs и miRNAs для LOQS у D. melanogaster) является ключевой ступенью в том, как каждая стадия механизма RNAi регулируется. Большинство вирусов растений и животных, как известно, кодируют супрессорные белки, которые блокируют RNAi хозяина, а следовательно и молчание, на разных стадиях91. Клеточные белки могут также регулировать RNAi. Напр., процессинг, чтобы сформировать miRNA let-7 человека, которая является опухолевым супрессором и регулятором клеточного цикла, ингибируется пост-транскрипционно в эмбриональных клетках с помощью фактора плюрипотентности LIN28, который , по-видимому, блокирует микропроцессорным комплексом обеспечиваемое расщепление pri-let-7 и обеспечиваемый Dicer последовательный процессинг pre-let-792, 93. Напротив, у человека передача сигналов, обеспечиваемая с помощью семейств transforming growth factor-beta (TGF-beta) и bone morphogenetic protein (BMP) быстро увеличивает продукцию зрелых miR-21 (которая является онкогенной), способствуя процессингу pri-miR-21в pre-miR-21 с помощью DROSHA94. Конкретнее, TGF-beta-и BMP-специфические трансдукторы сигналов из семейства SMAD рекрутируются на pri-miR-21 в комплексе с RNA helicase p68, компонентом микропроцессорного комплекса, облегчая накопление pre-miRNA. Кроме того, гетерогенный ядерный RNP A1 (hnRNP A1), хорошо известный регулятор сплайсинга мРНК предшественников, также ассистирует DROSHA чтобы эффективно выщепить и высвободить pre-miR-18, вообще-то с помощью переупаковки шпилек или путем создания места разреза для DROSHA , благодаря непосредственному соединению с pri-miRNA95. Это означает, что могут формироваться некоторые шпильки в pri-miRNAs и подвергаться процессингу только после связывания белка с RNA chaperone активностью.
Активность RISC также может регулироваться. У A. thaliana, ген, не кодирующий белка, IPS1 (INDUCED BY PHOSPHATE STARVATION 1), содержит мотив с комплементарной последовательностью к phosphate-starvation-induced miRNA miR-399, но спаривание прерывается с помощью петли несовпадения в сайте разрезания в miRNA96. IPS1 мРНК не разрезается, но, вместо этого конфискуется miR-399. Т.о., избыточная экспрессия IPS1 ведет к усилению накопления мишеней для miR-399, PHO2 мРНК. Идея мимикрии мишеней вносит непредвиденную сложность в сеть взаимодействий с регуляторной РНК и открывает возможность, что большое количество мРНК-подобных некодирующих РНК, недавно идентифицированный у человека97 могут быть ослабителями регуляции комплексов малая РНК-Argonaute.
Perspective
Recent studies hint that human cells contain a large number of small RNAs similar to miRNAs or siRNAs, with the potential to regulate the expression of almost all human genes. The future challenges in this field are clear. Many questions remain to be answered. How many types of small RNA are there? How are these small RNAs generated? What are their biological functions? How are these pathways regulated? One potential problem is that because many types of small RNA are modified at their 5' and 3' ends98, it is unclear whether the current sequencing technologies are sampling the entire range of small RNAs present in cells. But next-generation sequencing technologies13 should soon help to uncover the full range of small RNA molecules.
One major challenge will be to identify how specific RNA-binding proteins affect the final outcome of gene regulation by small RNAs, given that RNAs in a cell are usually associated with multiple proteins that regulate many aspects of gene expression. For example, genome-wide in vivo approaches using a combination of immunoprecipitation and high-throughput sequencing will be required to establish protein–mRNA interactions or RNP complex occupancy at certain regions of mRNA, where expression is suppressed.
Finally, changes in the activity and specificity of silencing pathways could create quantitative and qualitative genetic variation in gene expression, thereby generating new gene-expression networks. Such changes might have contributed to many processes, including human evolution16. Given that all vertebrates have almost exactly the same number of protein-coding genes and therefore cannot readily be distinguished in this way, it might be prophetic that the first small guide RNA to be identified, the C. elegans miRNA lin-4, has been found to regulate a gene involved in the timing of development99, 100. In humans, unlike other mammals, the brain tissue of newborns continues to grow at a similar rate to that of the fetus. This is a good example of a change in developmental timing, and there is much speculation about whether changes in this rate contributed to the evolution of humans as a new species.
Сайт создан в системе
uCoz 
