Посещений:
РНК ИНТЕРФЕРЕНЦИЯ

Молекулярный Аппарат

A three-dimensional view of the molecular machinery of RNA interference
Martin Jinek & Jennifer A. Doudna
Nature 457, 405-412 (22 January 2009) | doi:10.1038/nature07755; Published online 21 January 2008

In eukaryotes, small non-coding RNAs regulate gene expression, helping to control cellular metabolism, growth and differentiation, to maintain genome integrity, and to combat viruses and mobile genetic elements. These pathways involve two specialized ribonucleases that control the production and function of small regulatory RNAs. The enzyme Dicer cleaves double-stranded RNA precursors, generating short interfering RNAs and microRNAs in the cytoplasm. These small RNAs are transferred to Argonaute proteins, which guide the sequence-specific silencing of messenger RNAs that contain complementary sequences by either enzymatically cleaving the mRNA or repressing its translation. The molecular structures of Dicer and the Argonaute proteins, free and bound to small RNAs, have offered exciting insights into the molecular mechanisms that are central to RNA silencing pathways.


Рис.1.  |  Structure of RNaseIII-family enzymes.


Рис.2.  |  Modular architecture of Argonaute proteins.


Рис.3.  | Recognition of the termini of small RNAs by the PAZ and MID domains of Argonaute proteins.


Рис.4.  |  Mechanism of guide- and target-strand recognition by Argonaute proteins.

Открытие, что RNA interference (RNAi) и родственные пути, обеспечиваемые малыми РНК, играют центральную роль в замалчивании генной экспрессии в клетках эукариот существенно изменили наше понимание регуляции генов. По крайне мере 30% генов человека регулируются с помощью microRNAs, одним из классов малых РНК1. У широкого круга организмов, включая петунью, нематод, плодовых мушек, рыбок данио и мышей, мутации в генетических регионах кодирующих белок и/или РНК компоненты RNAi приводят к тяжелым, иногда и к летальным дефектам в росте и развитии клеток2.
RNAi и родственные пути замалчивания генов инициируются продукцией малых РНК (~20-30 нуклеотидов) с последовательностями. которые комплементарны частям транскриптов, которые они регулируют. Существуют три основных класса малых регуляторных РНК: short interfering RNAs (siRNAs), microRNAs (miRNAs) и PIWI-interacting RNAs (piRNAs) (see page 396). Биогенез и механизм действия основных типов малых РНК показан в Box 1. Короче, siRNAs и miRNAs генерируются из double-stranded RNA (dsRNA) предшественников, которые продуцируются в или вносятся в клетку, а их генерация зависит от ribonuclease (RNase) Dicer3. Эти малые РНК затем ассоциируют с членами семейства белков Argonaute, которые действуют как стержневые компоненты разнообразных наборов белок-РНК комплексов молчания (RNA-induced silencing complexes (RISCs))4. RISCs используют малые РНК в качестве гидов для сиквенс-специфического замалчивания мРНК путем индукции деградации мРНК или репрессии из трансляции. Кроме того, у определенных организмов, специализированные ядерные комплексы, содержащие Argonaute, известные как RNA-induced transcriptional silencing complex (RITS), обеспечивают транскрипционное генное молчание, индуцируя образование гетерохроматина5 (see page 413). Биогенез класса piRNA малых РНК также использует белки, принадлежащие к семейству Argonaute, но отличаются существенно от тех, что используются siRNAs и miRNAs6 (Box 1).
Биохимические и структурно биологические исследования дали фундаментальную информацию о молекулярных деталях RNAi. Структурные аспекты того, как вирусы ингибируют RNAi пути клетки-хозяина, описаны в работах (7 и 8).

Structural aspects of small RNA biogenesis


Продукция siRNAs и miRNAs базируется на эндонуклеолитическом процессинге dsRNA предшественников. В клетке длинная dsRNAs может возникать в результате репликации РНК вирусов, в результате транскрипции конвергентных клеточных генов или мобильных генетических элементов и в результате само-отжига клеточных транскриптов. Dicer, эндонуклеаза, относящаяся к семейству RNaseIII, преобразует эти длинные dsRNA молекулы в siRNA дуплексы ~21-25 нуклеотидов3. Напротив, miRNAs генерируются из эндогенных транскриптов (известных как первичные miRNAs, pri-miRNAs), которые образуют stem-loop (шпилькообразные) структуры (Box 1). Область шпильки вырезается из pri-miRNA в ядре с помощью эндонуклеазы Drosha9, др. энзима семейства RNaseIII. После их экспорта в цитоплазму, шпильки (известные как precursor miRNA, pre-miRNA) подвергаются следующему эндонуклеолитическому разрезанию, которое катализируется Dicer, генерируя miRNA-miRNA* дуплекс (где miRNA является антисмысловой, или ведущей нитью, а miRNA*является смысловой или пассажирской нитью) ~21-25 нуклеотидов.
Два свойства siRNAs и miRNAs гарантируют, что они эффективно будит инкорпорированы в RISC: длина дуплекса; и характеристики 5' и 3' концов, несущих монофосфатную группу и двунуклеотидный довесок, соотв.10-12. Недавние структурные исследования прокариотических RNaseIII и эукариотической Dicer предоставили информацию о том, как эти критические свойства siRNAs и miRNAs генерируются во время их биогенеза с помощью Drosha и/или Dicer.

The RNaseIII family


Разрезание dsRNA с помощью энзимов семейства RNaseIII, включая Drosha и Dicer, дает продукты с характерными окончаниями, с монофосфатной группой на 5' концах и в два нуклеотида довеском на 3' концах13. Простейшие RNaseIII энзимы найдены у прокариот и некоторых грибов. Эти энзимы состоят из RNaseIII домена, который обладает каталитической активностью, и (обычно) из dsRNA-binding domain (dsRBD) (Fig. 1a), и они действуют как гомодимеры14. Два RNaseIII домена димера ассоциируют, чтобы сформировать один processing центр, при этом каждай каталитический домен ответственен за гидролиз одной нити в дуплексе15. Напротив, и Drosha и Dicer являются мономерными и содержат два тандемно расположенных RNaseIII домена и одиночный dsRBD.
По кристаллической структуре RNaseIII у прокариот Aquifex aeolicus в комплексе с расщепленным dsRNA продуктом16 (Fig. 1b), можно видеть, что гомодимеризация каталитических доменов создает неглубокое расщепление поверхности, разделяющее два активных сайта. Кластер законсервированных аминокислотных остатков в каждом каталитическом центре координируется одиночным ионом магния. После присоединения к субстрату энзим преобразуется так, что dsRBDs прижимают dsRNA субстрат к поверхности каталитического домена димера.

Dicer


Эндонуклеаза Dicer преобразует dsRNA субстраты (длинные dsRNAs и pre-miRNAs) в короткие dsRNA фрагменты (siRNAs и miRNAs) определенной длины, обычно ~21-25 нуклеотидов3. Помимо двух копий законсервированного RNaseIII домена и dsRBD на С-конце, энзимы Dicer обычно имеют N-терминальный DEXD/H-box домен, сопровождаемый маленьким доменом с неизвестной функцией (домен DUF283), и PAZ доменом (Fig. 1a). Домен PAZ, который также обнаруживается в белках Argonaute, соединяется специфически с 3' концом single-stranded RNA (ssRNA)17-19.
Кристаллическая структура Dicer из одноклеточных эукариот Giardia intestinalis показывает, что способность энзимов Dicer давать фрагменты dsRNA специфической длины, обусловлена уникальным пространственным расположением домена PAZ и доменов RNaseIII20. G. intestinalis Dicer является естественной 'trimmed-down' версией энзима, сосоящей только из PAZ домена и тандема доменов RNaseIII (RNaseIIIa и RNaseIIIb) (Fig. 1a). Его структура напоминает топор с двумя RNaseIII каталитическими доменами, формирующими лезвие, и PAZ доменом, образующим основание рукояти (Fig. 1c). Домен RNaseIIIa и PAZ домен соединены с помощью длинной спирали, идущей по длине рукояти. Эта соединительная спираль укрепляется областью платформы, сформированной N-терминальным сегментом белка. RNaseIII домены образуют внутримолекулярный гомодимер, которые сильно напоминает гомодимерную структуру прокариотической RNaseIII16 (Fig. 1b). В Dicer 4 законсервированные аминокислоты в активном сайте каждого RNaseIII домена координируют два катиона металла, указывая тем самым, что Dicer использует механизм с двумя ионами металла, чтобы катализировать разрезание РНК. Расстояние в 17.5 Å между двумя парами ионов металла в двух активных сайтах совпадет по ширине с основной бороздой в dsRNA дуплексе. Моделирование связывания dsRNA субстрата с энзимом показало, что дуплекс располагается вдоль плоской поверхности, образуемой platform доменом и обеспечивает электростатические взаимодействия с рядом позитивно заряженных остатков. Мутации последовательности, кодирующей эти остатки, нарушают каталитическую активность Dicer, подчеркивая важность этих позитивно заряженных остатков для соединения с субстратом21.
Домен PAZ в Dicer имеет ту же самую складку и 3'-довесок связывающие остатки, что и PAZ домен белков Argonaute22, 23. Расстояние между карманом, связывающим 3'-довесок PAZ домена и активным сайтом RNaseIIIa домена составляет 65 Å, это соответствует длине в 25-нуклеотидов дуплекса РНК (Fig. 1c). Это хорошее совпадение с размером фрагментов siRNA, продуцируемых G. intestinalis Dicer in vitro. Доменовая архитектура Dicer т.о., указывает на то, что он действует как молекулярная линейка (ruler), генерирующая продукты определенной длины путем закрепления 3' динуклеотида субстратного РНК дуплекса (полученного при инициальном неспецифическом вырезании) на PAZ домене и разрезания на фиксированном расстоянии от этого конца. Это подтверждается наблюдением, что укороченный G. intestinalis Dicer белок, который лишен PAZ домена дает РНК продукты варьирующей длины in vitro21. Структура G. intestinalis Dicer подтверждает, что длина не законсервированной connector спирали является основным детерминантом размера продукта, это дает возможное объяснение вариациям размеров продуктов у разных видов.
Структура фрагмента мышиного Dicer, представленная исключительно RNaseIIIb доменом и dsRBD, была недавно установлено и было показано, что при связывании субстрата dsRBD подвергается конформационным изменениям, аналогичных тем, что наблюдаются в прокариотических RNaseIII энзимах24. Кроме того, укороченный белок Dicer человека, лишенный dsRBD обнаруживает значительно сниженную скорость разрезания РНК субстрата in vitro, но при этом сродство к субстрату остается неизменным25. Большинство энзимов Dicer содержит DEXD/H-box домен. Эти домены обнаруживаются в разнообразных группах белков, которые участвуют в АТФ-зависимом связывании и ремоделировании нуклеиновых кислот26. Хотя некоторые белки Dicer беспозвоночных (такие как Drosophila melanogaster DCR-2), по-видимому, нуждаются в АТФ для processive разрезания длинных dsRNAs (т.е., для множественных раундов разрезания без диссоциации от dsRNA субстрата), бклки Dicer млекопитающих, по-видимому, не зависят от АТФ10, 25, 27, 28. Кинетический анализ дикого типа и мутантных белков Dicer человека показал, что DEXD/H-box домен может обладать автоингибирующей функцией, т.к. удаление этого домена увеличивает скорость расщепления25. Эта находка указывает на то, что DEXD/H-box домен накладывает на белок непродуктивную конформацию, которая д. быть реорганизована, прежде чем произойдет катализ. Дальнейшие структурные и биохимические исследования белков Dicer полной долины и их комплексов с субстратом позволят установить, участвует ли DEXD/H-box домен в соединении и раскручивании РНК дуплексов во время загрузки малых РНК в RISC.

Drosha and the microprocessor complex


Член семейства RNaseIII Drosha катализирует инициальный процессинг pri-miRNAs, давая pre-miRNAs, которые являются шпильками с фосфорилированными 5' концами и 3' довесками в два нуклеотида9. Drosha является ядерным белком и его доменовая структура состоит из богатой пролином области и arginine- и serine-богатой области на N конце, сопровождаемых двумя RNaseIII доменами и dsRBD (Fig. 1a). Очищенный Drosha разрезает dsRNA неспецифически; специфическое разрезание pri-miRNAs нуждается в ассоциации с белком, известным как DGCR8 (также известным как PASHA у беспозвоночных), в комплексе, наз. микропроцессором29, 30. DGCR8 соединяется с основанием шпильки pri-miRNA, позиционируя Drosha для разрезания стебля pri-miRNA на расстоянии в 11 пар оснований между стеблем дуплекса и фланкирующими ssRNA регионами31. Т.о., DGCR8, по-видимому, является транс-действующим детерминантом специфичности, аналогичному PAZ домену в Dicer, который действует в цис-положении. Молекулярная архитектура Drosha неизвестна, но структура центрального региона DGCR8 человека, состоящая из тандемной пары dsRBDs, установлена недавно32. Канонические РНК-связывающие поверхности двух dsRBDs не являются непрерывными, указывая тем самым, что белок соединяется с двумя прерывистыми сегментами pri-miRNA stem-loop структуры.

Structural insights into Argonaute function


Общим свойством RNAi и всех родственных путей замалчивания, обеспечиваемых малыми РНК является ассоциация со small silencing RNA (также известных как ведущие РНК в этом контексте) с белком семейства Argonaute4. Возникающие в результате белок-РНК комплексы формируют минимальный стержневой эффекторный комплекс, известный как RISC. Внутри RISC малая РНК функционирует как сиквенс-специфический поводырь, который рекрутирует белок Argonaute на комплементарные транскрипты мишени благодаря взаимодействиями спаривающихся оснований. Транскрипты мишени, обычно мРНК, затем или разрезаются или защищаются от трансляции на рибосомах, что ведет к их деградации.
В ходе эволюции семейство Argonaute разошлось на специализированные clades (или подсемейства), которые распознают разные типы малых РНК и обеспечивают специфические эффекты разных путей замалчивания с помощью малых РНК33. И siRNAs и miRNAs ассоциируют с членами AGO clade белков Argonaute, в то время как piRNAs соединяются с PIWI clade. При классической RNAi, которая обеспечивается siRNAs, белки Argonaute заставляют молчать мРНК мишени путем катализа их эндонуклеолитического разрезания, процесса известного как slicing. PIWI clade из семейства белков Argonaute, как полагают, используются для резки на фрагменты при piRNA-обеспечиваемом молчании мобильных генетических элементов в зародышевой линии34, 35. Во время расщепления РНК мишень разрезается по готовой к расщеплению фосфатной группе, которая оппозитна фосфатной группе между 10-м и 11-м нуклеотидами ведущей нити РНК, если мерить от 5' конца ведущей нити11, 12. Резка нуждается в точной комплементарности между ведущей нитью и мишенью вокруг места разреза36-38. Белки Argonaute могут также замалчивать транскрипты независимо от режущей активности. В пути miRNA животных белки Argonaute репрессируют мРНК мишени путем ингибирования их трансляции и индукции deadenylation и последующего распада мРНК. Однако точный механизм обеспечиваемого miRNA молчания понятен не совсем39.
Функция в качестве эффектора малыми РНК обеспечиваемого молчания белка Argonaute может быть связана с ведущей нитью РНК, отторгая не-ведущую (пассажирскую) нить из siRNA или miRNA-miRNA* дуплекса (где miRNA* пассажирская нить) во время загрузки и последущего распознавания РНК мишени (Box 1). В путях молчания, которые базируются на резке РНК, белок Argonaute выполняет множественные циклы связывания мишени, разрезания и высвобождения продукта, тогда как ведущая нить остается связанной с белком. У метазоа путь miRNA, при котором молчание достигается slicer-независимым способом, белок Argonaute д. оставаться тесно ассоциированным с мРНК мишенью, чтобы удерживать репрессию её трансляции.

Functional domains


Белки Argonaute являются мультидоменовыми белками, которые содержат N-терминальный домен и PAZ, middle (MID) и PIWI домены (Fig. 2a). Кристаллические структуры прокариотических белков Argonaute обнаруживают двухлопастную архитектуру с MID и PIWI доменами, формирующими одну долю и с N-терминальным и PAZ доменами, составляющими др. (Fig. 2b). Два характерных домена семейства Argonaute - PAZ домен и C-терминальный PIWI домен - были первоначально идентифицированы с помощью филогенетического анализа последовательностей40. Трехмерные структуры изолированных PAZ доменов из D. melanogaster белков Argonaute выявили складку, сходную с теми что в oligosaccharide/oligonucleotide-binding (OB)-fold домене и в Sm-fold домене17-19. первая кристаллическая структура белка Argonaute полной длины из archaeal вида Pyrococcus furiosus, показала, что последовательность мотива, первоначально обозначенного как PIWI домен Lorenzo Cerutti et al.40, состоит из двух структурных доменов, обозначенных как MID и PIWI, соединенных способом хорошо законсервированного интерфейса, который оказывается центральным в углубленном C конце белка41 (Fig. 2b). Домен MID напоминает сахар-связывающий домен lac репрессора. Домен PIWI принимает форму складки, сходной с таковой в RNaseH, endoribonuclease, которая разрезает RNA-DNA гибриды42. Кристаллическая структура PIWI-подобного белка (наз. Piwi) из archaeal вида Archaeoglobus fulgidus (состоит из домена A и домена B, которые эквиваленты MID и PIWI доменам, соотв.) и полная длина белка Argonaute из бактерий A. aeolicus, также обнаруживают присутствие RNaseH-подобной складки в своих PIWI доменах43, 44. Биохимические исследования подтверждают, что подобно RNaseH, прокариотические Argonaute белки функционируют как ДНК направляемые ribonucleases44, 45, в отличие от своих эукариотических аналогов, которые развиваются, используя РНК молекулы в качестве поводырей.

Slicer activity


Находка, что PIWI домен белков Argonaute приробретает RNaseH складку, прямо указывает на то, что Argonaute белки отвественны за 'slicer' активность RISC41. Подобно потребностям для активности RNaseH, RISC-катализируемое разрезание РНК нуждается в бивалетных ионах металлов и дает 5' продукт, который имеет свободную 3' гидроксильную группу и 3' продукт, которые несет 5' фосфатную группу46-48. Аективный сайт RNaseH содержит Asp-Asp-Glu/Asp мотив, который координирует два бивалентных катиона, необходимых для катализа42. Сходным образом кристаллическая структура P. furiosus Argonaute (Ago) , впитавшая ионы марганца, обнаруживает законсервированный мотив Asp-Asp-His, чтобы координировать одиночный ион марганца49 (Fig. 2b). Мутагенез этого мотива в AGO2 человека подтверждает его необходимость для режущей активности in vivo и in vitro, и тем самым определяет белок Argonaute как каталитический компонент RISCs46, 49. Сходный анализ у Schizosaccharomyces pombe (делящихся дрожжей) Ago1, компонента RITS, показал. что режущая активность необходима для транскрипционного молчания50. Из 4-х белков Argonaute у человека (AGO1, AGO2, AGO3 и AGO4), только AGO2 обнаруживает режущую активность46, 51. Мотивы в AGO1 и AGO4 не в точности соответствуют консенсусной последовательности, но AGO3 имеет полную Asp-Asp-His последовательность и пока неактивен in vitro. Более того, как было недавно показано, что D. melanogaster PIWI (один из трех членов PIWI clade белков Argonaute у дрозофилы), который обладает Asp-Asp-Lys мотивом, является каталитически активным52, в согласии с постулируемой потребностью для резки piRNA пути34, 35. D. melanogaster AGO1 и AGO2 имеют полные мотивы Asp-Asp-His и оба способны к резке. Но AGO1 значительно менее эффективен, чем AGO2, т.к. он высвобождает продукты с более низкой скоростью, приводя к более медленному обороту53. Эти находки указывают на то. что факторы, дополнительные к законсервированным каталитическим остаткам, могут детерминировать будет ли данный белок Argonaute эффективным резчиком (slicer) in vivo.

Recognition of RNA termini


Включение siRNAs и miRNAs в RISC нуждается в присутствии 5' фосфатных групп и в 3' динуклеотидных довесках на концах10-12. Открытие, что PAZ домен является РНК связывающим доменом, который специфически распознает 3' концы ssRNAs, подтверждает, что он может функционировать как модуль для закрепления 3' конца ведущей нити РНК в RISC17-19. Информация о механизма распознавания РНК получена из кристаллической структуры PAZ домена из AGO1 человека в комплексе с siRNA-подобный дуплексом22 и из ядерно-магнитно резонансной структуры PAZ домена D. melanogaster AGO2 в комплексе с ssRNA олигонуклеотидами23. В этих структурах 3' динуклеотид вставляется в уже существующий гидрофобный карман, который выстилается законсервированными ароматическими остатками (Fig. 3a). Хотя отсутствуют сиквенс-специфические контакты, основание терминального нуклеотидного стека (stacks) оказывается против ароматического кольца из законсервированного phenylalanine остатка (Fig. 3a).
5' фосфатные группы siRNAs и miRNAs, которые возникают в результате механизма их биогенеза, являются критическими для эффективной сборки этих малых РНК в RISC10, 12, 38, 46. Более того, 5' фосфатная группа является существенной для безукоризненной резки, т.к. позиция места разреза в нити РНК мишени предопределяется с помощью расстояния от 5' фосфатной группы ведущей нити РНК12, 49, 54. Кристаллическая структура A. fulgidus Argonaute белка Piwi, связанного с коротким dsRNA дуплексом (это воспроизводит взаимодействие между ведущей нитью и нитью мишенью внутри RISC), показала, что 5' нуклеотид ведущей нити искажается и не происходит спаривания основания с нитью мишенью РНК дуплекса45, 55 (Fig. 3b). Это согласуется с наблюдением, что несовпадение оснований в этой позиции допустимо и может увеличивать режущую активность56. 5' фосфатная группа ведущей нити РНК погружается в глубокий карман на интерфейсе между MID и PIWI доменами и соединяется с ионом марганца, который, в свою очередь, скоординирован с C концом белка (Fig. 3c). Мутация любого из 4-х остатков, участвующих в координации иона металла и 5'-phosphate связывании, которые находятся среди наиболее законсервированных остатков в семействе белков Argonaute, нарушает режущую активность45. Это подчеркивает функциональное значение 5'-phosphate-связывающего кармана в закреплении ведущей нити РНК.
У растения Arabidopsis thaliana, самостоятельные типы малых не кодирующих РНК ассоциируют с разными белками Argonaute на базе идентичности 5' нуклеотида57, 58. A. thaliana AGO1 соединяет в основном РНК с уридином на своем 5' конце, тогда как AGO2 рекрутирует РНК с 5' аденозином. Domain-swap эксперименты, затрагивающие химерные белки, показали, что специфичность 5' нуклеотида определяется с помощью MID и PIWI доменов белков Argonaute57. Сходным образом, PIWI clade белков семейства Argonaute ассоциирует с piRNAs, которые являются видами РНК в ~24-31-нуклеотида, которые являются 2'-O-метилированными и обнаруживают склонность к уридину как первому нуклеотиду59, 60. Поэтому возможно, что PAZ и MID домены белков Argonaute, которые соединяются с разными видами малых РНК, подвергаются эволюционной адаптации, которя позволяет малым РНК рассортировываться на базе их характерных 3' и 5' концов.

RISC loading


В siRNA- и miRNA-обеспечиваемых путях генного молчания загрузка ведущей нити РНК на белок Argonaute тесно связана с её биогенезом (Box 1). Начиная с siRNA дуплекса или с miRNA-miRNA*, генерируемых с помощью Dicer-обеспечиваемого вырезания, нить с 5' концом с менее термодинамически стабильным концом дуплекса избирается в качестве ведущей нити61. Наблюдение структуры A. fulgidus Piwi, связанного с siRNA-подобным дуплексом, в котором первый нуклеотид ведущей нити является непарным и погруженным в 5'-phosphate-связывающий карман, указывает на то, что этот способ связывания ведущей нити вносит вклад в очевидную избирательность ведущей нити45, 55. Argonaute белки также способствуют выбору ведущей нити с помощью последующего отрезания пассажирской нити, облегчая тем самым её высвобождение62-65. Однако для дуплексов с множественными несовпадениями, как это часто в случае miRNA пути, разрезание не нужно во время загрузки63. Т.о., Argonaute белки, лишенные режущей активности (такие как AGO1, AGO3 и AGO4 человека) всё ещё могут быть нагружены miRNAs.
RISC загрузка происходит в контексте RISC-загружающего комплекса. В клетках человека RISC-loading комплекс состоит из белка Argonaute, Dicer и dsRBD-содержащего белка TRPB66-68. In vitro, этот трехсоставной комплекс может преобразовывать pre-miRNA, загружая правильную ведущую нить и расщепляя мРНК мишень, всё это в отсутствие АТФ67. Какова же роль dsRBD-содержащих белков для выбора собстрата и загрузки RISC? У D. melanogaster, DCR-1 ассоциирует с dsRBD-содержащим белком Loquacious (LOQS), чтобы превратить pre-miRNAs в miRNA-miRNA* дуплекс69-71. Напротив. комплекс DCR-2 со своим dsRBD-содержащим белком партнером, R2D2, необходим для эффективной продукции siRNAs из длинного dsRNA предшественника и для их последующей загрузки на AGO2 (refs 63, 72-74). Недавние исследования показали, что структура и степень спаривания оснований (т.е., присутствие несовпадений) внутри siRNA и miRNA предшественников дуплексов предопределяют, будет ли ведущая нить ассоциирована с AGO1 или AGO2 у D. melanogaster53, 75. Сродство DCR-2-R2D2 является наивысшим для точно совпадающих дуплексов, чем для дуплексов 'со вздутиями' (таких как шпильки pre-miRNA), и этоп, по-видимому, основной источник избирательности малых РНК во время загрузки на AGO275.

Target recognition


В структуре A. fulgidus Piwi-RNA комплекса, дуплекс ведущая нить-мишень позиционируется поверх законсервированного базового канала, который распространяется по поверхности как MID домена, так и PIWI домена45, 55 (Fig. 3c). Важно, что эти структуры показывают, что основания нуклеотидов 2-6 ведущей нити (начиная с 5' конца) экспозированы и свободны для спаривания оснований с мРНК мишенью. Это хорошо согласуется с многочисленными компьютерными и биохимическими исследованиями, показавшими, что нуклеотиды 2-8 ведущей нити (известные как 'seed' регион) являются критическими детерминантами специфичности распознавания мишени с помощью miRNAs76-78. Моделирование траектории полной длины siRNA-target дуплекса помещает расщепляемую фосфатную группу РНК мишени в предполагаемый slicer каталитический сайт, т.о., обеспечивая рациональное объяснение специфичности разрезания на фиксированном расстоянии от 5' конца ведущей нити11, 12. Точная комплементарность вокруг места разреза в дуплексе guide-target является обязательным для разрезания36-38. По-видимому, спаривание оснований вокруг 10-11-оснований гарантирует корректную ориентацию расщепляемой фосфатной группы в активном сайте.
В контексте двухдолевой архитектуры белков Argonaute полной длины, guide-target дуплекс, как предполагается, соединен с позитивно заряженной расщелиной между PAZ-N-terminal и MID-PIWI долями41, 44, 49. Недавняя кристаллическая структура полной длины белка Thermus thermophilus Argonaute, соединенного с ведущей ДНК нитью, идентифицировала молекулярные детали распознавания ведущей нити79. Структура T. thermophilus Ago в комплексе с 5'-фосфорилированной 21-nucleotide ДНК показывает, что ведущая нить, связанна с 5' фосфатной группой в MID домене и своим 3' концом в домене PAZ79 (Fig. 4a). Благодаря взаимодействиям с консервативными остатками arginine, нуклеотиды 2-10 ведущей нити принимают стековую (stacked) спиральную конформацию. Т.о., seed регион ведущей нити оказывается уже организованным, чтобы инициировать спаривание оснований с нитью мишенью (Fig. 4a). В отсутствие нити мишени ведущая нить изогнута на участке 10-11-оснований, указывая, что дальнейшая структурная перестройка происходит при распознавании РНК мишени.
Наиболее недавняя информация о механизме распознавания РНК мишени получена благодаря кристаллической структуре трехсоставного комплекса, состоящего из T. thermophilus Ago, 21-nucleotide ведущей нити ДНК и 20-nucleotide РНК мишени с несовпадающими основаниями, внесенными на участок 10-11-оснований80 (Fig. 4b). Оба конца ведущей нити закреплены в своих соответствующих связывающих карманах так,как это происходит в случае T. thermophilus комплекса Ago-ведущая ДНК. Регион seed ведущей нити (нуклеотиды 2-8) задействован в Watson-Crick взаимодействиях спаривания оснований с РНК мишенью, предполагая A-форму спиральной конформации. Чтобы приспособиться к нити РНК мишени в центральном канале, Ago подвергается выраженным конформационным изменениям в более открытую конформацию, это достигается ротированием N-terminal и PAZ доменов прочь от доли, содержащей MID и PIWI домены.
Предложены две модели для распознавания мишени и расщепления с помощью белков Argonaute81, 82. Модель фиксированного конца постулирует, что оба конца ведущей РНК остаются связанными с белком Argonaute во время разрезания. Это обеспечивает топологическое ограничение взаимодействия guide-target, и это д. ограничивать степень спаривания оснований менее, чем на один виток спирали (11 пар оснований) и может служить фактором, который ограничивает seed регион нуклеотидами 2-8 ведущей РНК. Напротив, модель бистабильности предполагает, что мишень соединяется с seed регионом ведущей нити и затем происходит распространение спаривания оснований в направлении 3' конца ведущей нити, заставляя этот конец ведущей нити диссоциировать от PAZ домена. В настоящее время неясно, является ли структура T. thermophilus Ago трехсоставного комплекса репрезентабельной для комплекса, компетентного к разрезанию, как предполагается моделью фиксированных концов, или она изображает собой заловленное промежуточное образование, как это постулирует модель бистабильности. Дальнейшие структурные исследования каталитически неактивных Argonaute белков в комплексах с точно спаренными guide-target дуплексами необходимы для выяснения этого вопроса. Тем не менее, способ распознавания РНК мишени, наблюдаемый в T. thermophilus Ago трехсоставном комплексе, может быть репрезентативным для распознавания мРНК мишени во время miRNA-обусловленного молчания у метазоа, у которых разрезание обычно предупреждается несовпадением основания между miRNA и мишенью вокруг участка 10-11-го оснований.

Slicer-independent functions


У метазоа замалчивание генов с помощью miRNAs происходит с помощью просто закрепления miRNA-содержащего RISC на мРНК мишени, в отсутствие slicer-зависимого разрезания мРНК мишени83. Механизм miRNA-обусловленной репрессии неясен, но он д. использовать взаимодействия между RISC и клеточным аппаратом, который ответственен за трансляцию и распад мРНК. Недавние исследования с использованием in vitro систем показали, что miRNAs могут влиять на инициацию трансляции благодаря столкновению с функцией EIF4F, комплекса, который соединяется с мРНК шапочкой (7-methylguanosine)84. Домен MID AGO2 человека обнаруживает ограниченную гомологию последовательностей с cap-связывающим мотивом фактора инициации трансляции EIF4E, субъединицей EIF4F, указывая тем самым, что AGO2 человека конкурирует с EIF4E за соединение со структурой шапочки мРНК85. Однако домен MID белков Argonaute лишен какой-либо различимой структурной гомологии с EIF4E. Т.о., взаимодействие AGO2-cap, если оно действительно непосредственное, может быть неканоническим способом распознавания шапочки мРНК.
Argonaute белки, miRNAs и их мишени мРНК ко-локализуются в P тельцах, которые являются цитоплазматическими фокусами, где, как полагают, происходит распад мРНК. В клетках млекопитающих и D. melanogaster, взаимодействие между белками Argonaute и белком P-телец GW182 необходимо для miRNA-обусловленной репрессии мРНК, а также для локализации Argonaute86-89. Недавно было показано, что glycine- и tryptophan-rich (GW) мотивы GW182 непосредственно взаимодействуют с MID-PIWI регионом белков Argonaute человека и что минимальный фрагмент (названный Ago hook), соответствует двум тандемным GW мотивам, он достаточен, чтобы обеспечить это взаимодействие90. Интересно, что мутации, нарушающие взаимодействие Argonaute-GW182 картируются в основном в 5'-phosphate-связывающем кармане, расположенном на интерфейсе между MID и PIWI доменами 89, 90.

Future prospects


Structural studies and structure-based biochemical studies will continue to improve our understanding of the mechanisms and evolutionary relationships of RNAi pathways. An important future goal will be to determine the structures of some of the proteins and protein complexes that operate in eukaryotic cells. Elucidating the molecular architecture of the RISC-loading complex will bring important insights into the coupling of small RNA biogenesis, Argonaute loading and guide-strand selection. Recent proteomic studies have uncovered a multitude of Argonaute-interacting proteins (for example GW182, MOV10 and FXR1) that might link Argonaute proteins to downstream effector events91, 92. Obtaining structural and structure-based functional insights into these interactions will help to uncover the molecular mechanisms that underlie the functions of Argonaute proteins in small-RNA-mediated gene silencing. Results from these studies will not only provide new mechanistic details but also lay the foundation for the informed engineering of RNAi as a therapeutic tool
Сайт создан в системе uCoz