Гетерохроматин ассоциирует с повторяющимися ДНК последовательностями и транспозонами и играет важные роли в передаче хромосом, поддержании геномной стабильности и в регуляции генной экспрессии^51-53. За исключением почкующихся дрожжей, которые лишены центромерных ДНК повторов, гетерохроматин концентрируется на повторах и транспозонах, которые окружают центромеры, теломеры и др. геномные локусы (Fig. 2a). Два важных определяющих свойства гетерохроматина участвуют в его способе сборки и наследования. Во-первых, сборка гетерохроматина использует сайты nucleation, которые действуют как точки вхождения для рекрутирования и распространения репрессорных белков. В отличие от рекрутирования, которое использует действие сайт-специфического ДНК-связывающего белка или РНК молекулы, распространение происходит независимым от последовательностей образом и использует изменения в структуре хроматина, которые обеспечиваются гистон-модифицирующими энзимами. Во-вторых, определяющим свойством гетерохроматина является его способ наследования. Будучи собранным, гетерохроматин наследуется в ходе многих клеточных делений, по крайней мере, частично независимо от лежащей в основе последовательности ДНК. Механизмы распространения и эпигенетического наследования гетерохроматина изучены плохо, но у S. pombe, нуждаются в компонентах RNAi пути^{3, 53, 54}.

На молекулярном уровне гетерохроматин характеризуется ассоциацией с гипоацетилированными гистонами и у организмов от S. pombe до человека, ассоциацией с H3K9 диметилированием и триметилированием^{3, 51}. H3K9 метилируется с помощью SU(VAR)3-9 у D. melanogaster, с помощью SUV39H у человека и Clr4 у S. pombe, и создает сайт связывания для HP1 (Swi6 и Chp2 у S. pombe)^55-58. HP1 белки содержат chromodomain, который соединяется с метилированным H3K9 и с chromoshadow (CSD) доменом, который участвует в др. межбелковых взаимодействиях⁵⁴.

Биохимическое выделение гетерохроматина S. pombe и RNAi комплексов выявили прямые физические связи между гетерохроматином и RNAi белками, что привело к модели того, как RNAi обеспечивает сборку гетерохроматина и участвует в молчании генов. Помимо HP1 белков, молчание гетерохроматиновых генов у S. pombe нуждается в chromodomain белке Chp1 (ref. 59). Chp1 больше, чем HP1 и подобно хромодоменам подсемейства Polycomb (Pc) содержит только одиночных chromodomain на своем N-конце. Подобно Swi6 и Chp2, Chp1 является структурным компонентом гетерохроматина и необходим для замалчивания гетерохроматиновых генов⁵⁹. В отличие от Swi6 и Chp2, которые не нужны для H3K9 метилирования в регионах центромерных посторов^{58, 60}, отсутствие Chp1 в клетках ведет к заметной потере H3K9 метилирования, указывая тем самым, что Chp1 играют критическую роль в формировании гетерохроматина.

биохимическая очистка Chp1 показала. что он ассоциирует с Ago1 в RITS¹⁰. RITS действует как специфический детерминант для рекрутирования др. RNAi комплексов и хроматин-модифицирующих энзимов, для специфических регионов ДНК. RITS также физически ассоциирует с и необходим для рекрутирования RNA-directed RNA polymerase complex (RDRC) на не кодирующие РНК, которые транскрибируются с центромерных повторов^{61, 62}. RDRC содержит S. pombe RNA-directed RNA polymerase, Rdp1, предполагаемую helicase, наз. Hrr1, и Cid12, члена семейства Trf4 и Trf5 полимераз полиаденилирования⁶¹, которые впервые были идентифицированы у почкующихся дрожжей Saccharomyces cerevisiae и участвуют в деградации аберрантных транскриптов^{30, 31}. Физическая ассоциация RITS и RDRC является siRNA- и Clr4-зависимой, указывающей, что эта ассоциация происходит на хроматине и нуждается в метилировании гистона H3K9⁶¹. Эти наблюдения ещё больше подтверждают, что RITS и RDRC локализуются на связанной с хроматином возникающей РНК с помощью механизма, участвующего в закреплении возникающего транскрипта на хроматине посредством бивалентного комплекса RITS (Fig. 2). Помимо RITS, S. pombe содержит второй Ago1-содержащий комплекс, наз. Argonaute siRNA chaperone (ARC) комплексом⁶³. Белок Ago1 в комплексе ARC содержит дуплексную скорее, чем однонитчатую siRNA, указывая тем самым, что режущая активность Ago1 (refs 63, 64), которая необходима для высвобождения пассажирской нити siRNA, ингибирована в этом комплексе⁶³.

В принципе siRNAs в RITS может спариваться основаниями или с расплетенными регионами ДНК или с зарождающимися не кодирующими РНК, которые транскрибируются со своих ДНК мишеней. Две модели не являются взаимоисключающимися и спаривание оснований с ДНК и РНК может вносить вклад в разные аспекты механизма биогенеза и функции siRNA. Однако поскольку роль спаривания оснований siRNA-ДНК не может быть исключена здесь, а несколько линий доказательств подтверждают взаимодействия спаривания оснований siRNA-РНК, при которых siRNA находит зарождающиеся не кодирующие транскрипты (Fig. 2). Во-первых, RITS ассоциирует с RDRC, который использует ssRNA в качестве матрицы для синтеза dsRNA, предоставляя тем самым доказательства, что RITS сами про себе ассоциированы с РНК⁶¹. Более того, взаимодействие RITS-RDRC нуждается в siRNA и Clr4 H3K9 methyltransferase, подтверждая, что оно происходит на транскриптах, связанных с гетерохроматином⁶¹. Вместе с наблюдением, что белки, необходимые для образования гетерохроматина - такие как Sir2, Swi6, Clr4 и др. компоненты Clr4 methyltransferase complex (CLRC), также как RITS и RDRC - необходимы для накопления siRNA^{10, 61, 65-67}, эти исследования подтвердили, что siRNA-программируемые RITS локализуются на возникающих, связанных с хроматином, не кодирующих транскриптах и рекрутируются на RDRC, чтобы инициировать синтез dsRNA и амплификацию siRNA (Fig. 2b). Прямое подтверждение этой модели получено в экспериментах, в которых Tas3 компонент RITS был слит с фаговым lambda N (lambdaN) белком и закреплен на транскрипте эухроматинового гена ura4+, который был модифицирован за счет добавления пяти lambdaN-связывающих сайтов выше его последовательности окончания транскрипции (ura4-5BoxB)⁶⁶. В клетках. содержащих ura4-5BoxB, белок Tas3-lambdaN может эффективно инициировать генерацию de novo siRNA и образование гетерохроматина⁶⁶. Подобно ситуации в центромерах генерация siRNA в этой системе зависит от H3K9 метилирования, подтверждая, что Tas3-lambdaN ассоциирует с хроматин связанными зарождающимися транскриптами и инициирует RNAi-обеспечиваемую сборку гетерохроматина. Наконец, некоторые сплайс-факторы ассоциируют с RDRC^{61, 68} и необходимы для RNAi-обеспечиваемого молчания центромерных генов⁶⁸. Эти результаты подтверждают ко-транскрипционный процессинг не кодирующих центромерных РНКs, т.к. сплайсесомные компоненты, как известно, ассоциируют с зарождающимися РНК транскриптами co-transcriptionally. Роль зарождающихся транскриптов в действии в качестве матрицы для рекрутирования хроматин-модифицирующих активностей может быть законсервирована у всех эукариот. Напр., крупные не кодирующие РНК, такие как XIST, которая участвует в инактивации Х хромосомы, как полагают, участвуют в рекрутировании гистонов и DNA methyltransferase энзимов⁶⁹. Однако механизм рекрутирования хроматин-модифицирующих активностей на XIST может использовать сайт-специфческие РНК-связывающие белки скорее, чем малые РНК.

Удивительное наблюдение в исследовании RNAi у S. pombe заключается в том, что генерация центромерных siRNAs является событием, зависимым от гетерохроматина^{61, 65}. В модели зарождающихся транскриптов (Fig. 2b), RITS ассоциирует с метилированным H3K9 посредством chromodomain из его Chp1 компонента и залавливает зарождающийся не кодирующий транскрипт посредством спариваний оснований, используя siRNAs, связанные со своим Ago1 белком. В клетках, лишенных H3K9 methyltransferase Clr4 или любого из компонентов CLRC, уровни центромерных siRNAs существенно снижены^{61, 67}. Более того, один из двух HP1 белков , Swi6, необходим для эффективной продукции siRNA^{61, 66, 70} и ассоциация RDRC с центромерными повторами ДНК⁶² и не кодирующими центромерными РНК⁷¹. Более того, критическая хроматин-зависимая ступень в генерации siRNA использует синтез dsRNA с помощью RDRC, т.к. введение длинной dsRNA-содержащей шпильки в клетки S. pombe обходит потребность в RDRC и Clr4 для генерации siRNA⁷⁰. Эти результаты указывают на то, что RDRC единственный способен синтезировать dsRNA на связанных с хроматином матрицах после чего они рекрутируются с помощью RITS, выявляя существование хроматин-зависимой ступени в активации биогенеза dsRNA и в пути амплификации siRNA у ^{S. pombe}. Возникающие в результате dsRNA превращаются в siRNA с помощью Dcr1, который также физически закреплен на RDRC⁷². Регуляция с помощью гетерохроматина продукции малых РНК может быть законсервирована у метазоа. X-TAS (transposable P elements inserted in telomeric-associated sequences on the X chromosome) и flamenco, два основных piRNA-продуцирующих локуса, которые контролируют транспозиции P и gypsy элементов у D. melanogaster, соотв., внедрены в гетерохроматин и их функция по защите генома нуждается как в PIWI, так и HP1 (refs 73, 74).

Важным вопросом, касающимся роли РНК в молчании генов, является вопрос, могут ли малые РНК инициировать de novo модификации хроматина. Хотя малые РНК являются важными компонентами некоторых механизмов CDGS, их способность инициировать модификации хроматина, по-видимому, находится под строгим контролем с помощью др. механизмов. У S. pombe, эктопически продуцированные шпилечные siRNAs могут инициировать H3K9 метилирование м молчание генов только в субнаборе локусов мишеней⁷⁰. siRNA-обусловленное CDGS коррелирует с хромосомной локализацией и появлением антисмысловой транскрипции в targeted локусе и нуждается в избыточной экспрессии Swi6 (HP1) белка⁷⁰. Это может отражать важность кооперативных эффектов в рекрутировании RITS и др. Argonaute или PIWI эффекторных комплексов на хроматин. В дополнение к siRNAs, необходима стабильная ассоциация RITS с chromodomain в Chp1 с H3K9-метилированными нуклеосомами^{10, 65}. В отсутствие H3K9 метилирования инициальное соединение RITS с хроматином может быть неэффективным. Избыточная продукция Swi6 может помочь в инициальном связывании RITS посредством стабилизации низких уровней метилирования H3K9, которое происходит по всему геному или альтернативно путем закрепления зарождающегося транскрипта на локусе мишени в хроматине⁷¹ (Fig. 2b). Сходные ограничения могут объяснить зависимую от контекста способность siRNAs способствовать метилированию ДНК у растений⁷⁵, а также наблюдаемую изменчивость в siRNA-обеспечиваемых модификациях хроматина в клетках животных (refs 76, 77). Способность siRNAs действовать в качестве инициаторов напоминает роль ДНК-свзывающих транскрипционных факторов в регуляции транскрипции, которая часто использует кооперативные эффекты между двумя или более транскрипционными факторам и которая чувствительна к локальной структуре хроматина.

Механизмы, которые обеспечивают цис-наследование хроматиновых состояний и ассоциированных с ним паттернов генной экспрессии, остаются загадочными. Давно известно, что во время репликации ДНК старые родительские гистоны случайно распределяются в двух вновь синтезированных дочерних ДНК нитях⁷⁸. Это сохранение старых гистонов во время репликации ДНК подсказывает идею, что гистоновые модификации обеспечивают эпигенетическое наследование хроматиновых состояний. Гистоновые модификации, такие как H3K9 метилирование, создают сайты связывания для белков. таких как Chp1, Chp2 и Swi6, а также для methyltransferase Clr4 (ref. 79) (Fig. 2b). Их сохранение во время репликации ДНК может, в принципе, служить как метка для повторного рекрутирования новых хроматин-модифицирующих активностей, чтобы воссоздать старые паттерны модификаций. Однако сродство модифицируемых гистонов в отношении специфических связывающих белков может быть слишком низким, чтобы сделасть возможным специфическое воссоздание состояний хроматина и необходимы др. импульсы для этого механизма⁴⁴. Модель зарождающегося транскрипт, описанная выше, предоставляет возможный механизм для эпигенетического наследования гетерохроматина. Т.к. у растений и в др. системах, которые содержат RdRP-зависимый механизм амплификации siRNA^{2, 80}, механизм генерации siRNA у S. pombe скорее всего формирует петлю позитивной обратной связи^{61, 62}. Два специфических свойства этой петли могут лежать в основе механизма, который гарантирует эпигенетическое наследование метилирования H3K9 гистона и гетерохроматина. Во-первых, siRNAs могут рекрутировать H3K9 метилирование на хроматин, возможно посредством физических взаимодействий с CLRC или dsRNA^{70, 81}. Т.о., до тех пор пока siRNAs, соответствующие специфическим доменам хроматина, присутствуют, они могут рекрутировать H3K9 метилирование на эти домены (Fig. 2b). Второе свойство связано с потребностью в H3K9 метилировании и локализации хроматина в активирующей siRNA петле позитивной обратной связи^{61, 62, 65}. Это гарантирует, что siRNAs будут цис-ограничены и центральной ролью siRNAs будет эпигенетическое поддержание факторов: siRNAs действуют только на эти дочерние нити ДНК , которые наследуют старые родительские молекулы H3 гистонов. содержащие H3K9 метилирование. Такие cooperativity-based механизмы, участвующие в двойном распознании гистоновых меток и др. факторов специфичности (siRNAs или ДНК-связывающих белков), скорее всего и будут лежать в основе всех эпигенетических механизмов цис-наследования.

Это может выглядеть парадоксально, что RNAi, которая нуждается в транскрипции, необходима для сборки гетерохроматина, состояния, ассоциированного с инактивацией генов и TGS^{3, 51}. Однако множественные механизмы, по-видимому, гарантируют, что транскрипция в гетерохроматине не приводит к продукции зрелых транскриптов, тем самым гетерохроматиновые гены остаются выключенными, несмотря на транскрипцию. Во-первых, гетерохроматиновые транскрипты деградируют или превращаются в siRNAs с помощью аппарата RNAi собственно с помощью процесса, обозначаемого как CTGS или cis-PTGS^{65, 66} (Fig. 2b). CTGS нуждается в прикреплении аппарата RNAi к гетерохроматину с помощью H3K9 метилирования. Этот механизм вносит значительный вклад в замалчивание некоторых промоторов в центромерных ДНК повторах, хотя TGS также является механизмом, вносящим важный вклад^{66, 71, 82}. Во-вторых, RNAi-независимый механизм надзора за РНК с участием TRAMP комплекса полиаденилирования, который содержит Cid14 (Trf4/5 гомолог), Air1, и Mtr1 у S. pombe, также направляет гетерохроматиновые транскрипты на деградацию²⁸. У S. cerevisiae, TRAMP распознает аберрантные транскрипты, которые лишены сигналов полиаденилирования и направляет их на деградацию с помощью экзосом, 3'→5' экзонуклеазного комплекса^{30, 31, 83}. Присутствие др. члена Trf4 polyadenylation полимеразного семейства, Cid12, в RDRC⁶¹ подтвержает. что RDRC и TRAMP могут конкурировать за обладание гетерохроматиновыми транскриптами (Fig. 1b). Более того, TRAMP и RDRC могут конкурировать более широко за РНК субстраты, т.к. при cid14 делеции в клетках новые классы РНК становятся мишенями для RNAi и превращаются в siRNAs²⁹. Вовлечение членов семейства Trf4 в RNAi процесс у C. elegans и T. thermophila указывает на консервативную роль членов этого семейства по координации экзсомами обеспечиваемого надзора за РНК с RNAi^{84, 85}. Наконец, транскрипция в гетерохроматине регулируется клеточным циклом и в основном ограничена S фазой клеточного цикла^{82, 86}. Эта транскрипция ассоциирует с высокими уровнями siRNAs во время S фазы, это может быть важным для эпигенетического восстановления H3K9 метилирования гистонов с помощью RITS-RDRC-CLRC комплексов. Однако ещё предстоит опередить, являются ли увеличение центромерной транскрипции и уровней siRNA в S фазе в основном отражением изменений в структуре хроматина, ассоциированных с клеточным циклом, или выполняют важную роль в RNAi-обеспечиваемой сборке гетерохроматина.

Почти все изученные ко-транскрипционные события процессинга РНК, включая pre-mRNA capping, сплайсинг и процессинг 3'-концов, используют ассоциацию между компонентами аппарата процессинга и RNA polymerase II (Pol II). Ассоциация с полимеразой, как полагают, помогает гарантировать, что процессинг произойдет упорядоченно и связывает созревание мРНК с экспортом мРНК. Кроме того, эти ассоциации служат для связи контроля качества РНК с транскрипцией, гарантируя, что только настоящие мРНК будут экспортированы из ядра для трансляции. Имеются доказательства, что RNAi-обеспечиваемая ко-транскрипционная сборка гетерохроматина использует также взаимодействия с Pol II^{87, 88}. Точковые мутации в двух разных субъединицах Pol II у S. pombe, Rpb2 и Rpb7, были выделены при скрининге на дефекты сборки центромерного гетерохроматина. Не было мутаций, ассоциированных с дефектами роста или общими нарушениями транскрипции^{87, 88}, это указывает на то. что мутации могут затрагивать специфические взаимодействия с компонентами аппарата RNAi или с CLRC. Такие взаимодействия могли бы вносить вклад в эффективную генерацию siRNA или H3K9 метилирование за счет стабилизации ассоциации RITS-RDRC с возникающими транскриптами. Интересно. что у A. thaliana, РНК зависимое метилирование ДНК использует взаимодействия между белком Argonaute и RNA Pol IV, специфичной для растений ДНК-зависимой РНК полимеразы⁸⁹ (discussed below).