Роль Sox9 и Shh

Regulation of Sox9 by Sonic Hedgehog (Shh) is Essential for Patterning and Formation of Tracheal Cartilage Jinhyung Park, Jennifer J.R. Zhang, Anne Moro, Michelle Kushida, Michael Wegner, and Peter C.W. Kim Developmental Dynamics 239:514-526, 2010. 2009 Wiley-Liss, Inc.
We report that Sonic Hedgehog (Shh ) regulates both formation and patterning of tracheal cartilage by controlling the expression pattern and level of the chondrogenic gene, Sox9. In Shh tracheo-esophageal tubes, Sox9 expression is transient and not restricted ventrally to the site of chondrogenesis, and is absent at the time of chondrogenesis, resulting in the failure of tracheal cartilage formation. Inhibition of Hedgehog signalling with cyclopamine in tracheal cultures prevents tracheal cartilage formation, while treatment of Shh^-/-tracheal explant with exogenous Shh peptide rescues cartilage formation. Both exogenous Bmp4 and Noggin rescue cartilage phenotype in Shh tracheal culture, while promoting excessive cartilage development in wild-type trachea through induction of Sox9 expression. The ventral and segmented expression of Sox9 in tracheal primordia under Shh modulated by Bmp4 and Noggin thus determine where and when tracheal cartilage develops. These results indicate that Shh signalling is a critical determinant in tracheal cartilage development. Developmental Dynamics 239:514-526, 2010. 2009 Wiley-Liss, Inc. Рис.1.	Хрящи трахеи создают структурную поддержку воздушным путям во время дыхания. Аномальное образование и формирование паттерна вентрально расположенных трахейных хрящевых блоков может создавать угрожающие жизни состояния, такие как tracheomalacia и врожденные стенозы трахеи. Хотя и несходные эти состояния часто ассоциируют с высокой болезненностью и смертностью у людей (Faust et al., 1998; Hasaniya et al., 2006; Rutter et al., 2006). Несмотря на столь важное значение для клиники, процесс развития хрящей трахеи и патогенез аномальных хрящей трахеи остаются неизвестными. У эмбрионов мыши трахея окружается мезенхимными клетками, происходящими из спланхнической мезодермы вследствие отсоединения передней кишки от вентральной части трахеи и дорсальной части пищевода на embryonic day (E) 11.5 вдоль дорсо-вентральной оси. Развитие хрящей трахеи начинается с детерминации этих трахейных мезенхимных клеток на вентральной части трахеи в клон хондроцитов вследствие последовательности хондрогенных событий (McAteer, 1984). Детерминированные в хондроциты мезенхимные клетки пролиферируют образуют агрегаты и конденсируются в пред-хрящевые узлы, которые постепенно дифференцируются в хондроциты и формируют хрящ (Tacchetti et al., 1992; de Crombrugghe et al., 2001). Sox9, транскрипционный фактор, содержащий high-mobility-group (HMG) ДНК-связывающий домен, как известно, необходим для каждой ступени хондрогенеза. Ингибирование Sox9 до образования мезенхимных конденсатов, полностью устраняет образование хряща, тогда как ингибирование Sox9 после образования мезенхимных конденсатов предупреждает дифференцировку в хондроциты клеток мезенхимных конденсатов (Akiyama et al., 2002). Доза Sox9, как было установлено, важна для формирования хряща, т.к. гаплонедостаточность вызывает дефекты образования зачатков хрящей, что ведет к образованию гипопластичных хрящей, включая хрящи трахеи (Bi et al., 2001). Более того, Sox9, как полагают, является важным фактором для спецификации формирования пространственно-временного паттерна зачатков хрящей трахеи во время раннего развития трахеи (Elluru and Whitsett, 2004). Sonic Hedgehog (Shh), секретируемый гликопротеин экспрессируется хордой и вентральной пластинкой нервной трубки, как полагают, является потенциальным регулятором Sox9 в развитии хряща. Культивирование пресомитной мезодермы показало, что Shh способствует хондрогенезу мезенхимных клеток путем индукции экспрессии Sox9 (Zeng et al., 2002). Трансгенные мыши, избыточно экспрессирующие Shh, особенно в хондроцитах, погибают при рождении из-за тяжелых скелетных дефектов, затрагивающих ребра, грудину и конечности. Такие мыши обнаруживают избыточную активацию экспрессии Sox.9 в хрящевых элементах, что ведет к задержке дифференцировки гипертрофированных хондроцитов, которое предшествует формированию кости (Tavella et al., 2004). Передача сигналов Shh и с её помощью регуляция Sox9 во время хондрогенеза ведет к формированию хрящей трахеи, но это не установлено четко. Shh передает свои сигналы путем соединения со своим рецепторным белком, Patched-1 (Ptch-1) или Patched-2 (Ptch-2). Соединение Shh с Ptch активирует трансмембранный рецепторный комплекс Smoothened (Smo), который в свою очередь ведет к активации стоящих ниже Shh транскрипционных факторов Gli генов (Gli1, Gli2 и Gli3) (Villavicencio et al., 2000). Shh вместе с Gli генами играет важную роль для роста и дифференцировки передней кишки. Эмбрионы с мутациями в генах Shh и Gli обнаруживают уродства передней кишки, варьирующие от развития гипопластичных легких и трахео-пищеводной трубки до полного отсутствия трахеи, пищевода и лёгких (Litingtung et al., 1998). Несмотря на подобные детальные характеристики уродств передней кишки и лёгких, включая персистенцию эмбриональной tracheoesophageal трубки (Litingtung et al., 1998), исследования развития хрящей трахеи были ограничены в основном морфологическими описаниями гипоплазии хрящей трахеи, наблюдаемой у Gli2^-/- and Gli2^-/- Gli3^-/+ мышей (Motoyama et al., 1998). Важная потребность в передаче сигналов Shh для развития хрящей трахеи подтверждается и недавним сообщением, описывающим полное отсутствие хрящевых колец в трубке передней кишки у эмбрионов Shh (Miller et al., 2004). Здесь мы продемонстрировали, что передача сигналов Shh контролирует формирование паттерна и образование хрящей трахеи за счет пространственно-временной регуляции хондрогенного гена Sox9. Мы показали, что у Shh^-/- эмбрионов три последовательные ступени хондрогенеза-пролиферация, конденсация и дифференцировка хондроцитов - нарушены, это нарушает развитие хрящей трахеи. Потеря экспрессии Sox9, гена, необходимого для всех хондрогенных событий у Shh эмбрионов, ведет к дефектному хондрогенезу. Shh существенен для пространственного и временного ограничения и поддержания экспрессии Sox9 во время развития хрящей трахеи, как наблюдается при изменение времени п паттерна экспрессии Sox9 у Shh^-/- эмбрионов. Блокирование передачи сигналов hedgehog с использованием Shh ингибитора cyclopamine in vitro культуре трахей ведет к отсутствию образования хрящей трахеи. Напротив, добавление экзогенного Shh пептида в in vitro культуру передней кишки от Shh^-/- эмбрионов ведет к восстановлению образования и формирования паттерна хрящей трахеи. Интересно, что воздействие на Shh переднюю кишку и дикого типа культуру трахей экзогенными Bmp4 или Noggin, известными нижестоящими регуляторами хондрогенеза, частично восстанавливает развитие хрящей или вызывает избыточное образование хрящей трахеи, соотв. Это сопровождается индукцией экспрессии Bmp4 и Sox9, что чётко указывает на участии передачи сигналов Shh в регуляции нижестоящих хондрогенных генов во время развития хрящей трахеи. Итак, передача сигналов Shh является ключевым инициатором и критическим регулятором формирования хрящей трахеи и формирования их паттерна во время развития передней кишки. DISCUSSION В этом исследовании мы предположили, что передача сигналов Shh играет важную роль в развитии хрящей трахеи. Мы исследовали, как клеточные и генетические события контролируют развитие хрящей трахеи и как они нарушаются в отсутствии передачи сигналов Shh, приводя к отсутствию образованиях хрящей трахеи. Мы показали. что пространственное и временное ограничение экспрессии Sox9 коррелирует с Shh транскрипционным фактором GUI, что сопровождается соотв. клеточными изменениями, такими как снижение пролиферации и увеличение апоптоза, это объясняет отсутствие хрящей трахеи у Shh эмбрионов. Ингибирование передачи сигналов Shh in vitro с помощью ингибитора Shh cyclopamine ведет к полному подавлению образования хрящей трахей в трахее дикого типа, что воспроизводит in vivo фенотип, тогда как экзогенный пептид Shh восстанавливает хрящевой фенотип в Shh⁺ трахеопищеводной трубке. Более того, экзогенные Bmp4 и Noggin индуцируют хондрогенез в отсутствие Shh без восстановления формированя и паттерна хондрогенеза. Базируясь на своих находках, мы полагаем, что передача сигналов Shh необходима как для образования, так и формирования паттерна хрящей трахей. Shh Signalling Is Essential for the Formation of Tracheal Cartilage Отсутствие хрящей трахеи у эмбрионов Shh embryos, неспособность развивать хрящи трахеи в обработанных cyclopamine эксплантах трахей дикого типа и устранение дефектов хрящей трахей в Shh эксплантах трахей экзогенным Shh указывает на необходимую роль Shh в развитии хрящей трахеи. В отсутствие передачи сигналов Shh, затрагиваются все три стадии хондрогенеза и это сопровождается соотв. отсутствием экспрессии Sox9 (Fig. 2D). Sox9, как было показано ранее, необходим для хондрогенеза и без его экспрессии не возникают не мезенхимные конденсаты, ни дифференцированные хондроциты (Akiyama et al.. 2002). Следовательно, наблюдаемый дефектный процесс хондрогенеза в персистирующей трахеопищеводной трубке эмбрионов Shh скорее всего обусловлен отсутствие экспрессии Sox9 во время хондрогенеза, а передача сигналов Shh регулирует образование хрящей трахеи за счёт поддержания экспрессии Sox9. Потеря экспрессии Sox9 подтверждается нашими результатами in situ . Принимая во внимание, что Sox9 непосредственно взаимодействует с и активирует Col2a1 (Bell et al., 1997), отсутствие достаточной экспрессии Sox9 можно также объяснить не обнаружимой экспрессией Col2a1 на ст. E11.5 в Shh^- трахеопищеводной трубке (Fig. 3J). Отсутствие экспрессии Col2a1, которая необходима для формирования хрящевых клеток (Barbien et al., 2003) вносит вклад в дальнейшее отсутствие образованиях хрящей трахеи у Shh эмбрионов. Мы выявили снижение уровня экспрессии Gli на ст. E11.5 and E13.5 Shh в трахеопищеводной фистуле на 50 и 90%, соотв. Этот результат указывает на то, что в отсутствие Shh, экспрессия Gli1 регулируется во времен и. Достоверное снижение уровня экспрессии Gli мРНК на ст. E13.5 коррелирует с изменениями, которые мы наблюдали в экспрессии Sox9, которая также теряется после E13.5. Этот результат согласуется с уже известной функцией Gli, который непосредственно взаимодействует с Sox9, чтобы усиливать его экспрессию (Bien-Willner et al., 2007). Следовательно, поддержание экспрессии Sox9 во время образования хрящей трахеи, скорее всего, необходимо как для непрерывной активации с помощью Gli, так и для зависимой от дозы реакции экспрессии Sox9, чтобы способствовать образованию хрящей трахеи. Экспрессия Gli 1 на E11.5, хотя и снижается на 50%, также открывает возможность дрю потенциальных активаторов Gli, иных нежели самoго Shh, которое ещё предстоит идентифицировать. Фактически, экспрессия Gli у Shh эмбрионов, как сообщалось ранее (Bai et al., 2002) слабее, чем у дикого типа, обнаруживается в Shh кишечнике, включая переднюю кишку на ст. E10.5, а Indian hedgehog (Ihh), как полагают, является потенциальным альтернативным активатором экспрессии Gli в отсутствие передачи сигналов Shh (Bai et al., 2002). Однако, наше иммуноокрашивание экспрессии Ihh показало отсутствие экспрессии Ihh в Shh передней кишке (data not shown), по-видимому, дополнительные потенциальные регуляторы принадлежат др. семейству генов. Путь передачи сигналов Shh ,как полагали, регулирует клеточный апоптоз и пролиферацию. Обработка клеток пролиферирующего головного мозга и опухоли простаты cyclopamine ингибирует митогенные эффекты передачи сигналов Shh (Dahmane et al., 2001; Sanchez et al., 2004). Более того, передача сигналов Shh, как было установлено, ингибирует апоптоз путем блокирования Ptch-индуцированного апоптоза в развитии спинного мозга эмбрионов кур (Thibert et al., 2003). Сходным образом, наши результаты подтверждают как способствующую пролиферации, так и противодействующую апоптозу роли передачи сигналов Shh, которые в конечном счёте достигают кульминации в продукции необходимых количеств мезенхимных клеток, детерминированных к развитию хрящей трахеи в обычных условиях. В отсутствии передачи сигналов Shh, оба эти процесса нарушаются и к ст. E13.5 количество мезенхимных клеток существенно снижается (data not shown), препятствуя развитию хрящей трахеи. Следовательно, передача сигналов Shh, по-видимому, непосредственно регулирует экспрессию Sox9 посредством Gli и, во-вторых, посредством своих про-пролиферативной и анти-апоптической ролей, это в конечном итоге увеличивает количество Sox9-экспрессирующих клеток. Shh Signalling Regulates Ventralization and Segmentation of Tracheal Cartilage Передача сигналов Shh участвует также в формировании паттерна многих органов во время эмбриогенеза, таких как конечности (Lopez-Martinez et al.. 1995), ЦНС (Schell-Apacik et al., 2003) и волосяные фолликулы (Mill et al., 2003). Мы исследовали роль передачи сигналов Shh в сегментации вентральной спецификации хрящей трахеи. Пролиферация вентральной мезенхимы трахеи становится сегментированной у эмбрионов дикого типа до формирования хрящей трахеи (Fig. 2B), указывая тем самым на потенциальную роль клеточной пролиферации в формировании сегментированного паттерна хрящей трахеи. С др. стороны, TUNEL окрашивание сагитальных срезов трахеи дикого типа на ст. E13.5 - E15.5 не обнаруживает известных апоптических клеток в мезенхиме трахеи (data not shown). Это указывает на то, что апоптоз может не играть непосредственной или доминирующей роли в сегментации хрящей трахеи дикого типа. У Shh^- эмбрионов, однако несмотря на значительную редукцию мезенхимная пролиферация в трахеопищеводной трубке всё ещё обнаружима на ст. E14.5, хотя вентрально специфическое и сегментированное формирование паттерна пролиферации теряется и усиливается апоптоз в виде неспецифического паттерна (data not shown). Эти результаты указывают на то, что передача сигналов Shh может регулировать формирование паттерна хрящей трахеи, частично, путём контроля специфического формировании паттерна мезенхимной пролиферации в трахее. Мы продемонстрировали, что передача сигналов Shh контролирует формирование паттерна хрящей трахеи путем регуляции паттерна экспрессии Sox9. Наши in situ результаты показали, что экспрессия Sox9 обнаруживается в вентральной мезенхиме трахеи и становится сегментированной в начале хондрогенеза. Места экспрессии совпадают с сайтами, где будут сформированы хрящи трахеи. У Shh эмбрионов специфическая вентральная экспрессия Sox9 нарушена (Fig. 3D) и обнаруживается в не респираторной области трахеопищеводной трубки (Fig. 5C). Мы не с состоянии оценить, насколько сегментация экспрессии Sox9 также нарушается у Shh эмбрионов, поскольку экспрессия Sox9 уже существенно снижена на ст. E13.5, когда экспрессия Sox9 становится сегментированной. Т.о., наши результаты показывают, что передача сигналов Shh контролирует вентральную спецификацию хрящей трахеи посредством регуляции паттерна экспрессии прехондрогенного гена, Sox9. Всё ещё неясно, регулирует ли передача сигналов Shh непосредственно или косвенно вентрализацию экспрессии Sox9. Вполне возможно, что передача сигналов Shh регулирует вентрализацию экспрессии Sox9 путем индукции bone morphogenetic protein 4 (Bmp4). Bmp4 и Shh, как известно, регулируют др. др. посредством петли обратной связи. В мезенхиме лёгких мышей Bmp4 чётко активируется с помощью передачи сигналов Shh (Weaver et al., 2003) и экспрессия Bmp4 подавлена у Shh (Litingtung et al., 1998). Bmp4 также играет вентрализующую роль в развитии (Que et al., 2006). Следовательно, передача сигналов Shh скорее всего активирует Bmp4, который затем контролирует вентральное ограничение экспрессии Sox9 в развивающейся трахее. Тот факт, что регион экспрессии Bmp4 в мезенхиме трахеи дикого типа на ст. E11.5 перекрывается с местом экспрессии Sox9 (Supp. Fig. S2A), указывает на возможное взаимодействие между двумя генами. Это подтверждается существенной потерей экспрессии Bmp4 в Shh траехео-пищеводной трубке (Supp. Fig. S2B), где вентральное ограничение экспрессии Sox9 также нарушено. Экспрессия Noggin в дорсальной мезенхиме трахеи дикого типа на ст. E11.5 также значительно снижается, если вообще присутствует, в отсутсвии передачи сигналов Shh (Supp. Fig. S2D). Учитывая дорсализующую роль Noggin (Que et al., 2006), дорсальное ограничение экспрессии Noggin в сочетании с вентрализации экспрессии Bmp4 гарантирует отсутствие экспрессии Bmp4 в мезенхиме дорсальной части трахеи и соответствует вентральному ограничению экспрессии Sox9. Всё это указывает на то, что хотя передача сигналов Shh может непосредственно активировать экспрессию Sox9 посредством своего нижестоящего гена Gli, она может косвенно индуцировать вентрализацию экспрессии Sox9 посредством активации Bmp4. В дополнение к своей вентрализующей роли, Bmp4 также, как было установлено, регулирует экспрессию Sox9 (Shum et al., 2003) и т.о., активация Bmp4 с помощью Shh может служить в качестве косвенного способа гарантии адекватной экспрессии Sox9. И потеря такой экспрессии Bmp4 в отсутствие передачи сигналов Shh скорее всего является фактором, вносящим вклад в неспособность поддержания экспрессии Sox9 в Shh трахеопищеводной трубке. Bmp4 and Noggin in Tracheal Cartilage Development Bmp4 и его скоординировання экспрессия с Noggin необходимы для собственно развития хрящей (Nifuji and Noda, 1999; Tsumaki et al., 2002). Bmp4 активирует Sox9, который затем включает Noggin. Noggin затем ингибирует Bmp4, ограничивая в конечном итоге размер и положение развивающихся хрящей (Capdevila and Johnson, 1998; Pathi et al., 1999; Zehentner et al., 2002). Чтобы проверить относительный вклад Noggin и Bmp4 в отсутствие Shh в развитие хрящей трахеи, мы попытались восстановить фенотип хрящей трахеи добавлением Shh⁺ эксплантов трахеи с экзогенными Bmp4 или Noggin пептидами. В данном исследовании ы изучали роль этих двух генов в развитии хрящей трахеи. Неожиданно оба экзогенных фактора Bmp4 и Noggin восстанавливали образование хрящей трахеи в Shh эксплантах трахеи, но не в респираторных областях. Воздействие на экспланты трахеи дикого типа Bmp4 индуцировало образование обширных и почти кольцевых хрящей трахеи по сравнению с контролем. Это согласуется с ранее установленной функцией Bmp4, которая усиливает хондрогенез и способствует генерации хряща (Duprez et al., 1996; Pizette and Niswander, 2000). Неожиданно, экзогенный Noggin также индуцировал формирования хрящей при этом образование хрящей было пространственно неограниченным и кольцевым. Noggin, как было установлено, выполняет анти-хондрогенную роль. Напр., добавление Noggin к эксплантам конечностей также ингибировало уровень хондрогенеза (Nifuji et al., 2004). Несмотря на такую анти-хондрогенную функцию Noggin, происходит увеличение уровня Bmp4 в ответ на индукцию эктопической экспрессии Noggin, как было установлено, на конечностях эмбрионов кур (Pathi et al., 1999). Было предположено, что Bmp4 подвергается воздействию ауторегуляторной негативной петли обратной связи, которая затем возможно элиминируется с помощью эктопической экспрессии Noggin, тем самым частично восстанавливается ингибирующий эффект Noggin на Bmp4 (Pathi et al., 1999). Точно также вполне возможно, что экзогенный Noggin в Shh^-/- эксплантах трахеи элиминирует ауторегуляторную негативную петлю обратной связи Bmp4, и тем самым частично восстанавливает экспрессию Bmp4 и восстанавливает формирование хрящей трахеи. Такие механизмы могут быть также ответственны за избыточное образование хряща, наблюдаемое в культуре дикого типа, обработанной Noggin. Чтобы оценить эту возможность мы окрашивали срезы культивируемых трахей дикого типа Bmp4. Bmp4 иммуноокрашивание четко демонстрировало экспрессии Bmp4 в хрящах при всех трех условиях (контрольные, Bmp4- и Noggin-обработанные культуры) в одинаковой степени (Fig. 7J,K,L). Этот результат подкрепляет модулирующую роль экзогенного Noggin, вмешивающегося в ауторегуляторную петлю обратной связи Bmp4, это компенсируется ингибированием экспрессии Bmp4 с помощью Noggin. Однако точное генетическое взаимодействие Noggin с Shh, Bmp4 и Sox9 в хондрогенезе, который ведет к формированию хрящей трахеи, ещё предстоит определить. In conclusion, we show that Shh signalling is necessary and critical in the formation and patterning of tracheal cartilage by maintaining the Sox9 expression level and by regulating the expression sites of Sox9. The regulation of Sox9 expression is done both directly through Gli and indirectly possibly through interaction with another chondrogenic gene such as Bmp4. Proper patterning and formation of tracheal cartilage are critical for the formation of a functional airway system, which otherwise would result in serious clinical complications. We believe that our findings shed light on tracheal cartilage repair and regeneration studies by demonstrating that Shh signalling is a key gene that is responsible for the ventralization and segmentation of tracheal cartilage and its formation.

Хрящи трахеи создают структурную поддержку воздушным путям во время дыхания. Аномальное образование и формирование паттерна вентрально расположенных трахейных хрящевых блоков может создавать угрожающие жизни состояния, такие как tracheomalacia и врожденные стенозы трахеи. Хотя и несходные эти состояния часто ассоциируют с высокой болезненностью и смертностью у людей (Faust et al., 1998; Hasaniya et al., 2006; Rutter et al., 2006). Несмотря на столь важное значение для клиники, процесс развития хрящей трахеи и патогенез аномальных хрящей трахеи остаются неизвестными.

У эмбрионов мыши трахея окружается мезенхимными клетками, происходящими из спланхнической мезодермы вследствие отсоединения передней кишки от вентральной части трахеи и дорсальной части пищевода на embryonic day (E) 11.5 вдоль дорсо-вентральной оси. Развитие хрящей трахеи начинается с детерминации этих трахейных мезенхимных клеток на вентральной части трахеи в клон хондроцитов вследствие последовательности хондрогенных событий (McAteer, 1984). Детерминированные в хондроциты мезенхимные клетки пролиферируют образуют агрегаты и конденсируются в пред-хрящевые узлы, которые постепенно дифференцируются в хондроциты и формируют хрящ (Tacchetti et al., 1992; de Crombrugghe et al., 2001). Sox9, транскрипционный фактор, содержащий high-mobility-group (HMG) ДНК-связывающий домен, как известно, необходим для каждой ступени хондрогенеза. Ингибирование Sox9 до образования мезенхимных конденсатов, полностью устраняет образование хряща, тогда как ингибирование Sox9 после образования мезенхимных конденсатов предупреждает дифференцировку в хондроциты клеток мезенхимных конденсатов (Akiyama et al., 2002). Доза Sox9, как было установлено, важна для формирования хряща, т.к. гаплонедостаточность вызывает дефекты образования зачатков хрящей, что ведет к образованию гипопластичных хрящей, включая хрящи трахеи (Bi et al., 2001). Более того, Sox9, как полагают, является важным фактором для спецификации формирования пространственно-временного паттерна зачатков хрящей трахеи во время раннего развития трахеи (Elluru and Whitsett, 2004).

Sonic Hedgehog (Shh), секретируемый гликопротеин экспрессируется хордой и вентральной пластинкой нервной трубки, как полагают, является потенциальным регулятором Sox9 в развитии хряща. Культивирование пресомитной мезодермы показало, что Shh способствует хондрогенезу мезенхимных клеток путем индукции экспрессии Sox9 (Zeng et al., 2002). Трансгенные мыши, избыточно экспрессирующие Shh, особенно в хондроцитах, погибают при рождении из-за тяжелых скелетных дефектов, затрагивающих ребра, грудину и конечности. Такие мыши обнаруживают избыточную активацию экспрессии Sox.9 в хрящевых элементах, что ведет к задержке дифференцировки гипертрофированных хондроцитов, которое предшествует формированию кости (Tavella et al., 2004). Передача сигналов Shh и с её помощью регуляция Sox9 во время хондрогенеза ведет к формированию хрящей трахеи, но это не установлено четко.

Shh передает свои сигналы путем соединения со своим рецепторным белком, Patched-1 (Ptch-1) или Patched-2 (Ptch-2). Соединение Shh с Ptch активирует трансмембранный рецепторный комплекс Smoothened (Smo), который в свою очередь ведет к активации стоящих ниже Shh транскрипционных факторов Gli генов (Gli1, Gli2 и Gli3) (Villavicencio et al., 2000). Shh вместе с Gli генами играет важную роль для роста и дифференцировки передней кишки. Эмбрионы с мутациями в генах Shh и Gli обнаруживают уродства передней кишки, варьирующие от развития гипопластичных легких и трахео-пищеводной трубки до полного отсутствия трахеи, пищевода и лёгких (Litingtung et al., 1998). Несмотря на подобные детальные характеристики уродств передней кишки и лёгких, включая персистенцию эмбриональной tracheoesophageal трубки (Litingtung et al., 1998), исследования развития хрящей трахеи были ограничены в основном морфологическими описаниями гипоплазии хрящей трахеи, наблюдаемой у Gli2^-/- and Gli2^-/- Gli3^-/+ мышей (Motoyama et al., 1998). Важная потребность в передаче сигналов Shh для развития хрящей трахеи подтверждается и недавним сообщением, описывающим полное отсутствие хрящевых колец в трубке передней кишки у эмбрионов Shh (Miller et al., 2004).

Здесь мы продемонстрировали, что передача сигналов Shh контролирует формирование паттерна и образование хрящей трахеи за счет пространственно-временной регуляции хондрогенного гена Sox9. Мы показали, что у Shh^-/- эмбрионов три последовательные ступени хондрогенеза-пролиферация, конденсация и дифференцировка хондроцитов - нарушены, это нарушает развитие хрящей трахеи. Потеря экспрессии Sox9, гена, необходимого для всех хондрогенных событий у Shh эмбрионов, ведет к дефектному хондрогенезу. Shh существенен для пространственного и временного ограничения и поддержания экспрессии Sox9 во время развития хрящей трахеи, как наблюдается при изменение времени п паттерна экспрессии Sox9 у Shh^-/- эмбрионов. Блокирование передачи сигналов hedgehog с использованием Shh ингибитора cyclopamine in vitro культуре трахей ведет к отсутствию образования хрящей трахеи. Напротив, добавление экзогенного Shh пептида в in vitro культуру передней кишки от Shh^-/- эмбрионов ведет к восстановлению образования и формирования паттерна хрящей трахеи. Интересно, что воздействие на Shh переднюю кишку и дикого типа культуру трахей экзогенными Bmp4 или Noggin, известными нижестоящими регуляторами хондрогенеза, частично восстанавливает развитие хрящей или вызывает избыточное образование хрящей трахеи, соотв. Это сопровождается индукцией экспрессии Bmp4 и Sox9, что чётко указывает на участии передачи сигналов Shh в регуляции нижестоящих хондрогенных генов во время развития хрящей трахеи. Итак, передача сигналов Shh является ключевым инициатором и критическим регулятором формирования хрящей трахеи и формирования их паттерна во время развития передней кишки.

DISCUSSION

В этом исследовании мы предположили, что передача сигналов Shh играет важную роль в развитии хрящей трахеи. Мы исследовали, как клеточные и генетические события контролируют развитие хрящей трахеи и как они нарушаются в отсутствии передачи сигналов Shh, приводя к отсутствию образованиях хрящей трахеи. Мы показали. что пространственное и временное ограничение экспрессии Sox9 коррелирует с Shh транскрипционным фактором GUI, что сопровождается соотв. клеточными изменениями, такими как снижение пролиферации и увеличение апоптоза, это объясняет отсутствие хрящей трахеи у Shh эмбрионов. Ингибирование передачи сигналов Shh in vitro с помощью ингибитора Shh cyclopamine ведет к полному подавлению образования хрящей трахей в трахее дикого типа, что воспроизводит in vivo фенотип, тогда как экзогенный пептид Shh восстанавливает хрящевой фенотип в Shh⁺ трахеопищеводной трубке. Более того, экзогенные Bmp4 и Noggin индуцируют хондрогенез в отсутствие Shh без восстановления формированя и паттерна хондрогенеза. Базируясь на своих находках, мы полагаем, что передача сигналов Shh необходима как для образования, так и формирования паттерна хрящей трахей.

Shh Signalling Is Essential for the Formation of Tracheal Cartilage

Отсутствие хрящей трахеи у эмбрионов Shh embryos, неспособность развивать хрящи трахеи в обработанных cyclopamine эксплантах трахей дикого типа и устранение дефектов хрящей трахей в Shh эксплантах трахей экзогенным Shh указывает на необходимую роль Shh в развитии хрящей трахеи. В отсутствие передачи сигналов Shh, затрагиваются все три стадии хондрогенеза и это сопровождается соотв. отсутствием экспрессии Sox9 (Fig. 2D). Sox9, как было показано ранее, необходим для хондрогенеза и без его экспрессии не возникают не мезенхимные конденсаты, ни дифференцированные хондроциты (Akiyama et al.. 2002). Следовательно, наблюдаемый дефектный процесс хондрогенеза в персистирующей трахеопищеводной трубке эмбрионов Shh скорее всего обусловлен отсутствие экспрессии Sox9 во время хондрогенеза, а передача сигналов Shh регулирует образование хрящей трахеи за счёт поддержания экспрессии Sox9. Потеря экспрессии Sox9 подтверждается нашими результатами in situ . Принимая во внимание, что Sox9 непосредственно взаимодействует с и активирует Col2a1 (Bell et al., 1997), отсутствие достаточной экспрессии Sox9 можно также объяснить не обнаружимой экспрессией Col2a1 на ст. E11.5 в Shh^- трахеопищеводной трубке (Fig. 3J). Отсутствие экспрессии Col2a1, которая необходима для формирования хрящевых клеток (Barbien et al., 2003) вносит вклад в дальнейшее отсутствие образованиях хрящей трахеи у Shh эмбрионов.

Мы выявили снижение уровня экспрессии Gli на ст. E11.5 and E13.5 Shh в трахеопищеводной фистуле на 50 и 90%, соотв. Этот результат указывает на то, что в отсутствие Shh, экспрессия Gli1 регулируется во времен и. Достоверное снижение уровня экспрессии Gli мРНК на ст. E13.5 коррелирует с изменениями, которые мы наблюдали в экспрессии Sox9, которая также теряется после E13.5. Этот результат согласуется с уже известной функцией Gli, который непосредственно взаимодействует с Sox9, чтобы усиливать его экспрессию (Bien-Willner et al., 2007). Следовательно, поддержание экспрессии Sox9 во время образования хрящей трахеи, скорее всего, необходимо как для непрерывной активации с помощью Gli, так и для зависимой от дозы реакции экспрессии Sox9, чтобы способствовать образованию хрящей трахеи. Экспрессия Gli 1 на E11.5, хотя и снижается на 50%, также открывает возможность дрю потенциальных активаторов Gli, иных нежели самoго Shh, которое ещё предстоит идентифицировать. Фактически, экспрессия Gli у Shh эмбрионов, как сообщалось ранее (Bai et al., 2002) слабее, чем у дикого типа, обнаруживается в Shh кишечнике, включая переднюю кишку на ст. E10.5, а Indian hedgehog (Ihh), как полагают, является потенциальным альтернативным активатором экспрессии Gli в отсутствие передачи сигналов Shh (Bai et al., 2002). Однако, наше иммуноокрашивание экспрессии Ihh показало отсутствие экспрессии Ihh в Shh передней кишке (data not shown), по-видимому, дополнительные потенциальные регуляторы принадлежат др. семейству генов.

Путь передачи сигналов Shh ,как полагали, регулирует клеточный апоптоз и пролиферацию. Обработка клеток пролиферирующего головного мозга и опухоли простаты cyclopamine ингибирует митогенные эффекты передачи сигналов Shh (Dahmane et al., 2001; Sanchez et al., 2004). Более того, передача сигналов Shh, как было установлено, ингибирует апоптоз путем блокирования Ptch-индуцированного апоптоза в развитии спинного мозга эмбрионов кур (Thibert et al., 2003). Сходным образом, наши результаты подтверждают как способствующую пролиферации, так и противодействующую апоптозу роли передачи сигналов Shh, которые в конечном счёте достигают кульминации в продукции необходимых количеств мезенхимных клеток, детерминированных к развитию хрящей трахеи в обычных условиях. В отсутствии передачи сигналов Shh, оба эти процесса нарушаются и к ст. E13.5 количество мезенхимных клеток существенно снижается (data not shown), препятствуя развитию хрящей трахеи. Следовательно, передача сигналов Shh, по-видимому, непосредственно регулирует экспрессию Sox9 посредством Gli и, во-вторых, посредством своих про-пролиферативной и анти-апоптической ролей, это в конечном итоге увеличивает количество Sox9-экспрессирующих клеток.

Shh Signalling Regulates Ventralization and Segmentation of Tracheal Cartilage

Передача сигналов Shh участвует также в формировании паттерна многих органов во время эмбриогенеза, таких как конечности (Lopez-Martinez et al.. 1995), ЦНС (Schell-Apacik et al., 2003) и волосяные фолликулы (Mill et al., 2003). Мы исследовали роль передачи сигналов Shh в сегментации вентральной спецификации хрящей трахеи. Пролиферация вентральной мезенхимы трахеи становится сегментированной у эмбрионов дикого типа до формирования хрящей трахеи (Fig. 2B), указывая тем самым на потенциальную роль клеточной пролиферации в формировании сегментированного паттерна хрящей трахеи. С др. стороны, TUNEL окрашивание сагитальных срезов трахеи дикого типа на ст. E13.5 - E15.5 не обнаруживает известных апоптических клеток в мезенхиме трахеи (data not shown). Это указывает на то, что апоптоз может не играть непосредственной или доминирующей роли в сегментации хрящей трахеи дикого типа. У Shh^- эмбрионов, однако несмотря на значительную редукцию мезенхимная пролиферация в трахеопищеводной трубке всё ещё обнаружима на ст. E14.5, хотя вентрально специфическое и сегментированное формирование паттерна пролиферации теряется и усиливается апоптоз в виде неспецифического паттерна (data not shown). Эти результаты указывают на то, что передача сигналов Shh может регулировать формирование паттерна хрящей трахеи, частично, путём контроля специфического формировании паттерна мезенхимной пролиферации в трахее.

Мы продемонстрировали, что передача сигналов Shh контролирует формирование паттерна хрящей трахеи путем регуляции паттерна экспрессии Sox9. Наши in situ результаты показали, что экспрессия Sox9 обнаруживается в вентральной мезенхиме трахеи и становится сегментированной в начале хондрогенеза. Места экспрессии совпадают с сайтами, где будут сформированы хрящи трахеи. У Shh эмбрионов специфическая вентральная экспрессия Sox9 нарушена (Fig. 3D) и обнаруживается в не респираторной области трахеопищеводной трубки (Fig. 5C). Мы не с состоянии оценить, насколько сегментация экспрессии Sox9 также нарушается у Shh эмбрионов, поскольку экспрессия Sox9 уже существенно снижена на ст. E13.5, когда экспрессия Sox9 становится сегментированной. Т.о., наши результаты показывают, что передача сигналов Shh контролирует вентральную спецификацию хрящей трахеи посредством регуляции паттерна экспрессии прехондрогенного гена, Sox9.

Всё ещё неясно, регулирует ли передача сигналов Shh непосредственно или косвенно вентрализацию экспрессии Sox9. Вполне возможно, что передача сигналов Shh регулирует вентрализацию экспрессии Sox9 путем индукции bone morphogenetic protein 4 (Bmp4). Bmp4 и Shh, как известно, регулируют др. др. посредством петли обратной связи. В мезенхиме лёгких мышей Bmp4 чётко активируется с помощью передачи сигналов Shh (Weaver et al., 2003) и экспрессия Bmp4 подавлена у Shh (Litingtung et al., 1998). Bmp4 также играет вентрализующую роль в развитии (Que et al., 2006). Следовательно, передача сигналов Shh скорее всего активирует Bmp4, который затем контролирует вентральное ограничение экспрессии Sox9 в развивающейся трахее. Тот факт, что регион экспрессии Bmp4 в мезенхиме трахеи дикого типа на ст. E11.5 перекрывается с местом экспрессии Sox9 (Supp. Fig. S2A), указывает на возможное взаимодействие между двумя генами. Это подтверждается существенной потерей экспрессии Bmp4 в Shh траехео-пищеводной трубке (Supp. Fig. S2B), где вентральное ограничение экспрессии Sox9 также нарушено. Экспрессия Noggin в дорсальной мезенхиме трахеи дикого типа на ст. E11.5 также значительно снижается, если вообще присутствует, в отсутсвии передачи сигналов Shh (Supp. Fig. S2D). Учитывая дорсализующую роль Noggin (Que et al., 2006), дорсальное ограничение экспрессии Noggin в сочетании с вентрализации экспрессии Bmp4 гарантирует отсутствие экспрессии Bmp4 в мезенхиме дорсальной части трахеи и соответствует вентральному ограничению экспрессии Sox9. Всё это указывает на то, что хотя передача сигналов Shh может непосредственно активировать экспрессию Sox9 посредством своего нижестоящего гена Gli, она может косвенно индуцировать вентрализацию экспрессии Sox9 посредством активации Bmp4. В дополнение к своей вентрализующей роли, Bmp4 также, как было установлено, регулирует экспрессию Sox9 (Shum et al., 2003) и т.о., активация Bmp4 с помощью Shh может служить в качестве косвенного способа гарантии адекватной экспрессии Sox9. И потеря такой экспрессии Bmp4 в отсутствие передачи сигналов Shh скорее всего является фактором, вносящим вклад в неспособность поддержания экспрессии Sox9 в Shh трахеопищеводной трубке.

Bmp4 and Noggin in Tracheal Cartilage Development

Bmp4 и его скоординировання экспрессия с Noggin необходимы для собственно развития хрящей (Nifuji and Noda, 1999; Tsumaki et al., 2002). Bmp4 активирует Sox9, который затем включает Noggin. Noggin затем ингибирует Bmp4, ограничивая в конечном итоге размер и положение развивающихся хрящей (Capdevila and Johnson, 1998; Pathi et al., 1999; Zehentner et al., 2002). Чтобы проверить относительный вклад Noggin и Bmp4 в отсутствие Shh в развитие хрящей трахеи, мы попытались восстановить фенотип хрящей трахеи добавлением Shh⁺ эксплантов трахеи с экзогенными Bmp4 или Noggin пептидами. В данном исследовании ы изучали роль этих двух генов в развитии хрящей трахеи. Неожиданно оба экзогенных фактора Bmp4 и Noggin восстанавливали образование хрящей трахеи в Shh эксплантах трахеи, но не в респираторных областях. Воздействие на экспланты трахеи дикого типа Bmp4 индуцировало образование обширных и почти кольцевых хрящей трахеи по сравнению с контролем. Это согласуется с ранее установленной функцией Bmp4, которая усиливает хондрогенез и способствует генерации хряща (Duprez et al., 1996; Pizette and Niswander, 2000). Неожиданно, экзогенный Noggin также индуцировал формирования хрящей при этом образование хрящей было пространственно неограниченным и кольцевым. Noggin, как было установлено, выполняет анти-хондрогенную роль. Напр., добавление Noggin к эксплантам конечностей также ингибировало уровень хондрогенеза (Nifuji et al., 2004). Несмотря на такую анти-хондрогенную функцию Noggin, происходит увеличение уровня Bmp4 в ответ на индукцию эктопической экспрессии Noggin, как было установлено, на конечностях эмбрионов кур (Pathi et al., 1999). Было предположено, что Bmp4 подвергается воздействию ауторегуляторной негативной петли обратной связи, которая затем возможно элиминируется с помощью эктопической экспрессии Noggin, тем самым частично восстанавливается ингибирующий эффект Noggin на Bmp4 (Pathi et al., 1999). Точно также вполне возможно, что экзогенный Noggin в Shh^-/- эксплантах трахеи элиминирует ауторегуляторную негативную петлю обратной связи Bmp4, и тем самым частично восстанавливает экспрессию Bmp4 и восстанавливает формирование хрящей трахеи. Такие механизмы могут быть также ответственны за избыточное образование хряща, наблюдаемое в культуре дикого типа, обработанной Noggin. Чтобы оценить эту возможность мы окрашивали срезы культивируемых трахей дикого типа Bmp4. Bmp4 иммуноокрашивание четко демонстрировало экспрессии Bmp4 в хрящах при всех трех условиях (контрольные, Bmp4- и Noggin-обработанные культуры) в одинаковой степени (Fig. 7J,K,L). Этот результат подкрепляет модулирующую роль экзогенного Noggin, вмешивающегося в ауторегуляторную петлю обратной связи Bmp4, это компенсируется ингибированием экспрессии Bmp4 с помощью Noggin. Однако точное генетическое взаимодействие Noggin с Shh, Bmp4 и Sox9 в хондрогенезе, который ведет к формированию хрящей трахеи, ещё предстоит определить.

In conclusion, we show that Shh signalling is necessary and critical in the formation and patterning of tracheal cartilage by maintaining the Sox9 expression level and by regulating the expression sites of Sox9. The regulation of Sox9 expression is done both directly through Gli and indirectly possibly through interaction with another chondrogenic gene such as Bmp4. Proper patterning and formation of tracheal cartilage are critical for the formation of a functional airway system, which otherwise would result in serious clinical complications. We believe that our findings shed light on tracheal cartilage repair and regeneration studies by demonstrating that Shh signalling is a key gene that is responsible for the ventralization and segmentation of tracheal cartilage and its formation.

Regulation of Sox9 by Sonic Hedgehog (Shh) is Essential for Patterning and Formation of Tracheal CartilageJinhyung Park, Jennifer J.R. Zhang, Anne Moro, Michelle Kushida, Michael Wegner, and Peter C.W. Kim Developmental Dynamics 239:514-526, 2010. 2009 Wiley-Liss, Inc.

Regulation of Sox9 by Sonic Hedgehog (Shh) is Essential for Patterning and Formation of Tracheal Cartilage
Jinhyung Park, Jennifer J.R. Zhang, Anne Moro, Michelle Kushida, Michael Wegner, and Peter C.W. Kim
Developmental Dynamics 239:514-526, 2010. 2009 Wiley-Liss, Inc.