Роль Протеин Киназ

Regulation of Wnt/β-catenin signaling by protein kinases Esther M. Verheyen, Cara J. Gottardi Developmental Dynamics Volume 239, Issue 1, pages 34–44, January 2010
The Wnt/β-catenin signaling pathway plays essential roles during development and adult tissue homeostasis. Inappropriate activation of the pathway can result in a variety of malignancies. Protein kinases have emerged as key regulators at multiple steps of the Wnt pathway. In this review, we present a synthesis covering the latest information on how Wnt signaling is regulated by diverse protein kinases. Developmental Dynamics 239:34–44, 2010. © 2009 Wiley-Liss, Inc.	WNT/β-catenin signaling Эволюционно законсервированный Wnt/Wingless (Wg) сигнальный путь участвует в различных биологических процессах, необходимых для эмбрионального развития и гомеостаза взрослых, включая детерминацию, пролиферацию, миграцию и дифференцировку (rev. Clevers,2006; Cadigan,2008). Wnts являются секретируемыми внеклеточными белками, которые запускают широкий круг клеточных реакций в ответ на связывание рецептором и активацию. Большинство организмов содержит множественные Wnt гены, которые инициируют разные межклеточные пути, а именно, канонический Wnt/β-catenin каскад, planar cell polarity путь или Wnt/calcium путь. Остановимся на регуляции компонентов канонического Wnt пути (Table 1; see also The Wnt Homepage). Table 1. Wnt Pathway Components and Regulators Mouse/Human Drosophila C. elegans Wnt Wingless (Wg) Wnt Frizzled (Fz) Frizzled (Fz) Frizzled (Fz) LRP5/6 Arrow LRP5/6 Dishevelled (Dvl) Dishevelled (Dsh) Mig-5 GSK3 Zw3 Gsk-3 CK1 Gilgamesh Kin-19 Axin Axin Pry-1 APC APC Apr-1 β-catenin Armadillo (Arm) Bar-1, Sys-1, Wrm-1, Hmp-2 Tcf/Lef dTcf/Pangolin Pop-1 Nlk Nemo Lit-1 Hipk2 Hipk Члены семейства Wnt законсервированы в царстве животных и необходимы во время роста, формирования паттерна тканей и гомеостаза. Кроме того, несоответствующая активация экспрессии Wnt-зависимых генов у млекопитающих ведет к многочисленным формам рака, особенно наследственных и спорадических форм рака толстой кишки (Kinzler et al.,1991; Nishisho et al.,1991). Каноническая передача сигналов Wnt контролирует клеточные судьбы путем регуляции экспрессии генов (rev.Cadigan and Nusse,1997). Wnts инициируют канонический путь путём связывания Frizzled (Fz) и LRP5/6 корецепторов (Bhanot et al.,1996; Fig. 1). Стимуляция рецепторного комплекса в конечном итоге ведет к формированию ядерного транскрипционного комплекса, который содержит ДНК-связывающий фактор, известный как lymphocyte enhancer factor (Lef)/T-cell factor (Tcf), и дуальный сигнальный/адгезивный белок, β-catenin. В этом комплексе, β-catenin служит в качестве обязательного коактиватора благодаря своей способности рекрутировать энзимы, такие как CBP, который способствует ремоделированию хроматина и транскрипционной инициации/элонгации (rev. Willert and Jones,2006). Сложная серия молекулярных событий необходима, чтобы генерировать этот транскрипционный комплекс. Центральный аспект передачи сигналов Wnt связан с ингибированием механизма конституитивной деградации, который служит для удержания цитозольного "signaling" пула β-catenin на низких уровнях. Как результат цитозольный β-catenin накапливается и вступает в ядро, чтобы взаимодействовать с семейством транскрипционных факторов Tcf/Lef для обеспечения целенаправленной экспрессии генов мишеней (rev. Behrens et al.,1996; Molenaar et al.,1996; Mosimann et al.,2009). В отсутствие передачи сигналов Wnt цитозольный β-catenin быстро деградирует посредством ubiquitin-proteosome системы. Устранение β-catenin из Tcf/DNA комплексов позволяет транскрипционному корепрессору Groucho находить Tcfs и репрессировать транскрипцию Wnt мишеней (Cavallo et al.,1998; Roose et al.,1998). Figure 1. Wnt/β-catenin signaling pathway. A: In the absence of Wnt ligand, cytoplasmic b-catenin is targeted for destruction by the Axin-scaffolded protein complex containing Axin, APC, GSK3, and CK1. Association of DNA-bound Tcf with Gro and other transcriptional corepressors inhibits Wnt target genes. B: Upon ligand binding, the destruction complex is inhibited and cytoplasmic β-catenin accumulates and enters the nucleus where it can activate gene expression through Tcf and CBP binding. Множественные ступени Wnt пути, белковые активности, связывающие свойства и стабильность регулируются посредством разных событий фосфорилирования. Повсеместные киназы, CKI и GSK3, играют множественные и оппозитные роли в контроле передачи сигналов Wnt, указывая тем самым, что способ, с помощью которого эти киназы образуют каркасы в клетке может быть критическим для понимания передачи сигналов Wnt и её регуляции. Возникает понимание того, как некоторые киназы и/или события фосфорилирования служат для модуляции или "тонкой настройки" передачи сигналов Wnt/β-catenin. Понимание такой тонкой настройки может быть критическим для объяснения того, как потеря такой точной регуляции может быть критической для объяснения того, как высоко консервативные пути могут вносить вклад в такое разнообразие тканевых структур и как потеря такой точной регулировки вносит вклад во всё растущий список болезней человека (rev. Chien and Moon,2007). Phosphorylation-Dependent Destruction of β-catenin by an Axin-Scaffold Complex Накопление в цитозоле и ядре β-catenin является одним из самых ранних, универсальным показателем активации Wnt (Noordermeer et al.,1992). Поскольку избыток β-catenin наблюдается в некоторых раковых опухолях, поэтому ранние исследования были сконцентрирована на молекулярных компонентах, которые контролируют накопление в цитозоле β-catenin. Т.к. этот аспект регуляции β-catenin сегодня хорошо известен, мы отметим только ключевые ступени (Wodarz and Nusse,1998; Barker and Clevers,2000; Logan and Nusse,2004; Clevers,2006). N-конец цитозольного β-catenin постоянно фосфорилируется с помощью механизма dual-kinase, координируемый с помощью каркасного белка Axin (Fig. 2). Axin имеет сайты связывания β-catenin, CK1, GSK3, а также для др. факторов, необходимых для Wnt-зависимых сигнальных событий (Luo and Lin,2004). Члены семейства CK1 (including ?, ? и ?) фосфорилируют β-catenin по серину 45. Это первичное фосфорилирование необходимо для последующий фосфорилирований с помощью GSK3 по остаткам 41, 37, и 33 (Yost et al.,1996; Liu et al.,2002). Хотя большинство исследований концентрируется на GSK3?, сегодня хорошо известно, что GSK3? и ? полностью перекрываются (Doble et al.,2007). Поэтому мы будем обозначать членов семейство просто как GSK3, пока не нужна спецификация. β-catenin, который фосфорилирован ко остаткам 37 и 33 в конечном итоге распознается с помощью ?-TrCP E3 ubiquitin-ligase комплекса, убиквитинилируется и быстро деградирует с помощью 26S протеосом (Hart et al.,1999). Продукт гена опухолевого супрессора APC также является партнером по связыванию Axin и, как полагают, устраняет N-терминально фосфорилированный β-catenin из Axin комплекса, для переноса на аппарат деградации (Xing et al.,2003). Мутации в APC, Axin или в N-терминальных сайтах фосфорилирования β-catenin обнаруживаются в множественных типах раковых опухолей человека, где эти мутации поднимают посттранскрипционную стабильность и передачу сигналов β-catenin (Korinek et al.,1997; Morin et al.,1997; Rubinfeld et al.,1997). Т.о., зависимая от фосфорилирования деградация β-catenin давно уже рассматривается как ключевая ступень в выключении передачи сигналов β-catenin. Figure 2. Phosphorylation sites on β-catenin. β-catenin is phosphorylated on its N-terminus by GSK3 (shown in orange) and CKI (shown in orange). These phosphorylations target β-catenin for ubiquitination and subsequent proteasomal degradation. β-catenin is also phosphorylated on the indicated sites by the diverse kinases PKA, AKT, and JNK2. These events are believed to promote β-catenin activity. Как Wnts ингибируют этот конституитивный процесс деградации. Недавние работы были сконцентрированы на молекулярных последствиях событий, которые происходят после связывания лигандов на клеточной поверхности. Хотя некоторые вопросы остаются нерешенными, очевидно, что рецепторный комплекс играет важную роль в сборке платформы, которая в конечном итоге служит для инактивации Axin-scaffold phospho-destruction комплекса. LRP5/6 Phosphorylation Promotes Axin Docking and Pathway Activity Wnt лиганды занимают рецепторный комплекс, состоящий из Frizzled serpentine рецепторного белка и LRP5/6 корецептора. LRPs являются единожды пронизывающими трансмембранными белками, принадлежащими к семейству low density lipoprotein-related (LRP) рецепторов, представленных у позвоночных LRP5 и LRP6 и Arrow у Drosophila (Pinson et al.,2000; Tamai et al.,2000; Wehrli et al.,2000). Поскольку форсированное образование кластеров Fz и LRP достаточно, чтобы активировать передачу сигналов β-catenin независимо от Wnts, то стимулирование лигандами, как полагают, способствует сборке более высокого порядка LRP5/6 корецепторных комплексов, которые в свою очередь управляют передачей сигналов (Tolwinski et al.,2003; Cong et al.,2004b; Holmen et al.,2005; Liu et al.,2005). После Wnt стимуляции, LRP6 фосфорилируется и рекрутирует Axin на плазматическую мембрану, это совпадает с ингибированием комплекса, разрушающего β-catenin (Tamai et al.,2004). Экспрессия LRP6, лишенного цитозольного домена, приводит к доминантно-негативному эффекту на передачу сигналов Wnt (Tamai et al.,2000), тогда как экспрессия конструкции, лишенной внеклеточного домена постоянно активирует активность пути (Tamai et al.,2004). Исходя из этих наблюдений некоторые группы высказали предположение, что внеклеточный домен осуществляет аутоингибирующий эффект, который уменьшается в ответ на стимуляцию с помощью Wnt (Mao et al.,2001; Liu et al.,2003). Tamai et al. (2004) нашли, что богатый пролином PPPSP мотив, присутствует в 5 копиях (represented as A-E; Fig. 3) во внутриклеточно домене LRP6 и функционально необходим для передачи сигналов Wnt (Tamai et al.,2004). Эти мотивы законсервированы от мух до позвоночных в качестве PPP(S/T)P остатков. Мутации пятого серинового остатка LRP6 в аланин делает белок неактивным в передаче сигналов β-catenin. Мнение, что эти мотивы представляют собой сайты мишени для протеин киназ, было подтверждено экспериментально, когда было установлено, что PPPSP мотивы фосфорилируются. Будучи фосфорилированными, эти сайты делают возможным присоединение Axin. В самом деле, Axin не присоединяется к тем сайтам LRP6, которые мутантны. Поскольку ранее было показано, что передача сигналов Wnt способствует взаимодействию между Axin и LRP5/6, предложена модель, согласно которой Wnt запускает фосфорилирование LRP6, чтобы индуцировать Axin-связывающий сайт. Tamai et al. (2004) получили phospho-специфические антитела (Ab1490), которые распознают серин в первом PPPSP повторе (serine 1490). Используя эти антитела, было продемонстрировано, что стимуляция клеток с помощью Wnt-кондиционированной среды вызывает быструю выраженную фосфориляцию PPPSP остатков в LRP6. Figure 3. Phosphorylation sites in the cytoplasmic domain of LRP6. A: The cytoplasmic domain of LRP6 is shown, indicating the sites of GSK3 (red) and CK1? (orange) phosphorylation. Five clusters of GSK3 sites followed by CKI? sites are shown as blue boxes labeled A-E. TM, transmembrane domain. B: The amino acid sequence of LRP6 repeat A (adapted from Davidson et al.,2005). Cluster 1 contains the T1479 CKI? target site and Cluster 2 follows the GSK3 site and contains a second CKI? site (T1493). Помимо основной роли как компонента деструкционного комплекса, который направляет β-catenin на деградацию, glycogen synthase kinase 3 (GSK3), как было установлено, участвует в фосфорилировании LRP6 по PPPSP (Zeng et al.,2005). Избыточная экспрессия GSK3 in vivo способствует фосфорилированию LRP6, т.к. GSK3 ингибиторы, такие как LiCl, предупреждают фосфорилирование. LRP6 не фосфорилируется в фибробластов эмбрионов мышей, обладающих делециями как Gsk3?, так и Gsk3? генов (Zeng et al.,2005). Чтобы исследовать очевидное расхождение между хорошо известной ролью GSK3 как ингибитора передачи сигналов Wnt и вновь идентифицированной ролью, стимуляции взаимодействий LRP6-Axin, Zeng et al. (2005) получили связанную с мембраной GSK3?. Как и ожидалось эта форма GSK3? может всё ещё фосфорилировать LRP6 на плазматической мембране. Эта ассоциированная с мембраной GSK3 неспособна участвовать в хорошо известном ингибировании β-catenin на уровне комплекса цитоплазматической деструкции. Эти наблюдения строго свидетельствуют о двух противоположных ролях GSK3 в Wnt пути, исходя из компартментализации GSK3. Т.о., близость GSK3 к плазматической мембране играет позитивную роль в передаче сигналов Wnt. Поскольку GSK3 обычно кооперирует с др. киназами, предполагается участие второй киназы. В 2005, в двух исследованиях было показано, что LRP5/6 фосфорилируются с помощью CK1 (Davidson et al.,2005; Zeng et al.,2005; Fig. 3). Детальный обзор о роли членов семейства CK1 в передаче сигналов Wnt читатель найдет у Price (2006). Два сайта были идентифицированы в качестве сайтов мишеней для CK1? (Fig. 3), один наз. T1479, что расположен выше сайта мишени GSK3 (Davidson et al.,2005), тогда как второй T1493 находится на три аминокислоты ниже для GSK3 сайта мишени PPPSP (Zeng et al.,2005). Группа Niehrs идентифицировала, что член семейства CK1? является первичной киназой, участвующей в обеспечении фосфорилирования и, по-видимому, необходима для T1479 и T1493 сайтов (Davidson et al.,2005). CK1? является необычным членом семейства CK1, поскольку она закреплена на мембране посредством сайтов palmitoylation на её С-конце. Напротив, цитоплазматические члены семейства, такие как CK1? не оказывают эффекта на фосфорилирование LRP6 (Davidson et al.,2005), поскольку они не влияют на активность Dvl (see below; Peters et al.,1999). Экспрессия доминант-негативной CK1? в HEK293T клетках и у эмбрионов Xenopus специфически блокирует фосфорилирование LRP6 и передачу сигналов Wnt. У Drosophila CK1? , наз. Gilgamesh (Gish) может действовать синергично с LRP6/Arrow, тогда как RNAi-вызываемый нокдаун блокирует передачу сигналов Wg (Davidson et al.,2005). Phospho-специфические антитела, направленные против треонина в наиболее C-терминальном CKI? сайте (Tp1479), были использованы для демонстрации, что CK1? непосредственно фосфорилирует LRP6. CK1? фосфорилирование является важным для рекрутирования Axin с помощью LRP6. Эти наблюдения, что CK1 играет ключевую роль в фосфорилировании кластера A, были расширены MacDonald с коллегами, когда они показали, что все 5 GSK3 мотивов (PPPSPxS) сопровождаются CK1 консенсусными сайтами (PPPSPxS). Все 5 dually фосфорилированных мотива предоставляют оптимальные сайты для связывания Axin (MacDonald et al.,2008). Хотя имеется генеральный согласие, что фосфорилирование LRP6 важно для передачи сигналов Wnt, то молекулярные детали всё ещё спорны. В одной модели фосфорилирование с помощью GSK3 является первичным Wnt индуцируемым событием, которое затем предоставляет первую ступень, позволяющая последующее CK1 фосфорилирование (Zeng et al.,2008), тогда как вторая модель предполагает, что фосфорилирование с помощью GSK3 является конституитивным и что передача сигналов Wnt способствует только CK1?-обусловленному фосфорилированию (Bilic et al.,2007). Последняя модель базируется на находках, что передача сигналов Wnt не усиливает фосфорилирование S1490 в GSK3 консенсусном сайте и, более того, что S1490 является постоянно фосфорилированным (Davidson et al.,2005). Напротив, CK1? сайт фосфорилируется специфически в ответ на Wnt стимуляцию и может не нуждаться в priming с помощью GSK3. Фосфорилирование с помощью GSK3 в целом нуждается в primed субстрате, как это видно в отношении фосфорилирования β-catenin по S45 с помощью CKI?. Напротив, Davidson et al. (2005) полагают, что фосфорилирование обоих CK1 сайтов необходимо для интактного PPPSP сайта, указывая тем самым, что GSK3 primes LRP6. Поскольку исследования не разрешили этот вопрос, поэтому остаётся посмотреть, каков точный механизм, последовательность и потребность в фосфорилировании LRP6. LRP6 Signalosome Assembly at the Membrane Помимо способствования фосфорилированию членов семейства LRP, Wnt, по-видимому, стимулирует сборку макромолекулярных комплексов в ответ на присоединение лиганда (Fig. 4). Эти комплексы рекрутируют цитозольные белки на мембрану и могут способствовать фосфорилированию LRP в конечном результате. Используя live imaging клеток позвоночных, использующих экспрессию флюоресцентно нагруженных Axin и LRP6, Bilic et al. (2007) продемонстрировали, что передача сигналов Wnt индуцирует ассоциированные с плазматической мембраной LRP6 агрегаты. В нестимулированных клетках, Axin локализуется в внутриклеточных точках, тогда как LRP6 униформно окрашивает клеточную мембрану. Wnt стимуляция приводит к быстрому формированию LRP6 точек, обозначаемых как "LRP6 signalosomes." Это событие сопровождается рекрутированием Axin на агрегаты. Tp1479 антитела были использованы, чтобы показать, что точки являются обогащенными CK1?-обеспеченными фосфорилированными LRP6 и что эти структуры также содержат Fz8, Dvl2, GSK и Axin (Bilic et al.,2007). Интересно, что T1479 остаток не законсервирован в Drosophila Arrow, так что необходимо посмотреть, является ли этот механизм эволюционно законсервированным. Dvl, как предполагается, обеспечивает аггрегацию и фосфорилирование LRP6, исходя из находок, что нокдаун dsh и dvl в клетках Drosophila и позвоночных ингибирует Wnt-индуцированное фосфорилирование LRP6 по T1479. В этой модели Dvl д. играть главную роль в сборке LRP6 сигналосом в ответ на передачу сигналов Wnt и д. стимулировать фосфорилирование LRP6 и рекрутирование Axin, сопровождаемое стабилизацией β-catenin. В подтверждение этого клеточные линии, в которых три Dvl белка позвоночных были одновременно редуцированы с помощью нокаута (Dvl1?/?;Dvl2?/?) и shRNA-обусловленного knockdown (Dvl3), показали редуцированные уровни Wnt-индуцированного фосфорилирования LRP6 (Zeng et al.,2008). Figure 4. LRP6 signalosome assembly. Wnt ligand binding triggers assembly of LRP6-associated complexes termed signalosomes. Ligand association results in receptor association and recruitment of Dvl. Subsequently, GSK3 and Axin are recruited to the complex, along with membrane associated CKI?, and LRP6 is phosphorylated. Wnt Pathway Activation Triggers Phosphorylation of Dishevelled Proteins Семейство Dishevelled белков (Dvl1-3 у позвоночных и Dsh у мцх и рыбок данио) является законсервированным позитивным регулятором канонической передачи сигналов. Модулярный белок также играет ключевую роль в неканоническом PCP пути (rev. Wallingford and Habas,2005). Dishevelled действует эпистатически ниже Fz/LRP рецепторного комплекса. Доказательства этому получены в наблюдении, что избыточная экспрессия Dsh может активировать передачу сигналов β-catenin у Drosophila мутантов Arrow (Wehrli et al.,2000), а постоянно активный слитый белок Fz2-Arrow не может передавать сигналы на dsh мутантном фоне (Tolwinski et al.,2003). Возможный механизм, с помощью которого Dsh функция становится средством ингибирования Axin (Fagotto et al.,1999; Kishida et al.,1999; Li et al.,1999; Smalley et al.,1999). Транслокация Dvl на мембрану и последующее рекрутирование партнеров по связыванию ведет к разрушению комплекса и стабилизации β-catenin. После Wnt активации белки Dvl ассоциируют с Fz и оказываются фосфорилированными (Yanagawa et al.,1995; Willert et al.,1997; Lee et al.,1999; Rothbacher et al.,2000). Несколько киназ, как предполагается, фосфорилирут Dvl, включая CK1?, Casein kinase 2 и PAR1 (Willert et al.,1997; Sun et al.,2001; Cong et al.,2004a; Ossipova et al.,2005). Фосфорилирование белков Dvl, как полагают, является важной позитивной ступенью пути активации, точный механизм которой остается неизвестным. Lipid Kinases: PtdIns (4,5)P2 and Wnt Receptor Complex Activation В недавнем исследовании установлена потребность в двух хорошо известных lipid kinases для этих ранних ступеней передачи сигналов Wnt. Используя библиотеку siRNA киназ человека, Pan et al. (2008) осуществляли скрининг в отношении эффектов на накопление Wnt-индуцированного цитозольного β-catenin с помощью энзим-сцепленного immunosor bent подхода и фосфорилирования Lrp6 по S1490 (сайту GSK3 ) с помощью immunoblot анализа в HEK293T клетках и идентифицировали PI4KII? и PIP5K1?. Эти две киназы являются компонентами основного пути продукции PtndIns(4,5)P₂ (PIP2) в клетках (Hsuan et al.,1998; Doughman et al.,2003). Подтверждением роли PIP2 в Wnt каскаде является форсированное высвобождение PIP2 в цитозоль клеток, используя систему доставки липосом, хотя этого недостаточно для фосфорилирования LRP6 по S1490, но оно усиливает это фосфорилирование в присутствии Wnt. Более того, Wnt3a может стимулировать формирование PIP2 в клетках, а липосомами-обеспечиваемая доставка PIP2 может обходить потребность в PI5K1?. Механизм активации PIP2, по-видимому, нуждается в Dvl, который активирует PIP5K активность зависимым от дозы способом и ко-иммунопреципитируется с PIP5K в лизатах клеток. Важно. что это физическое взаимодействие нуждается в присутствии Wnt лиганда. PIP2 участвует в многочисленных процессах, которые используют мембранную динамику (напр., эндоцитоз, экзоцитоз, регуляцию кортикального цитоскелета; Czech,2000). Вообще-то в соответствии со своей генеральной ролью, Wnt3a-индуцированные LRP6 агрегаты, по-видимому, содержат PIP2 и зависят от клеточных уровней PIP2 для их формирования (Pan et al.,2008). Элиминация PIP2 также блокирует рекрутирование Axin на pLRP6. В целом эти данные подтверждают модель, где сигналы Wnt передаются посредством Fz, рекрутируя Dvl, приводя к усилению PIP5K активности. Это вызывает локальные образования PIP2, которые необходимы, но недостаточны для большинства активностей, описанных выше, таких как аггрегация LRP6, фосфорилирование LRP6 по T1479 и S1490, и рекрутирование Axin (Pan et al.,2008). Будущие исследования д. подтвердить эти наблюдения и интегрировать их более полно в известные проксимальные к мембране события в пути Wnt. LRP Directly Inhibits GSK3 Activity and/or Function During Wnt Signaling Давно установлено, что фармакологические ингибиторы активности GSK3, такие как LiCl и BIO достаточны, чтобы способствовать стабилизации β-catenin и активировать транскрипцию β-catenin/Tcf (Klein and Melton,1996; Stambolic et al.,1996; Sato et al.,2004). Однако противодействуют ли и как Wnts активности GSK3 остается неясным. Регуляция GSK3 уникальна по нескольким причинам. В отличие от большинства протеин киназ, участвующих в передаче сигналов, она постоянно активна и инактивируется только в ответ на разнообразные сигналы. Круг GSK3 субстратов широк и GSK3 участвует в многочисленных важных клеточных процессах, таких как метаболизм гликогена, передача сигналов инсулина, пролиферация клеток, функция нейронов и передача сигналов Wnt (rev. Rayasam et al.,2009). В пути инсулина активность GSK3 ингибируется с помощью Akt-обеспечиваемого фосфорилирования по S9 с помощью GSK3? и по S21 с помощью GSK3?. Эти сайты независимы от статуса пути Wnt (Ding et al.,2000; McManus et al.,2005). Остаётся мистикой, как фосфорилирование β-catenin с помощью GSK3 ингибируется в ответ на активацию Wnt пути. Недавние исследования предоставили неоспоримые доказательства, что Wnt-активированный LRP6 может ингибировать функцию GSK3 непосредственно (Cselenyi and Lee,2008; Piao et al.,2008; Wu et al.,2009). Используя методы in vitro, которые восстанавливают фосфорилирование β-catenin по остаткам S33, 37 и 41 (первые два распознаются с помощью E3 ubiquitin ligase, ?-TrCP), эти группы предоставили доказательства, что фосфорилированные LRP6 PPPpSPXpS пептиды непосредственно ингибируют фосфорилирование β-catenin с помощью GSK3 по S33, S37 и T41. На первый взгляд, этот результат не является неожиданностью, поскольку известно, что Axin-каркасный белок также рекрутируется на этот phospho-повтор в LRP (Tamai et al.,2004). Удивительно, однако, что этим phospho-пептидом (PPPpSPXpS)-обусловленное ингибирование фосфорилирования β-catenin может происходить независимо от Axin (Cselenyi and Lee,2008; Wu et al.,2009). Поскольку PPPSPXS пептид сам по себе является GSK3субстратом, эти исследования открыли интересную возможность, что этот регион LRP6 непосредственно конкурирует с N-концом β-catenin за связывание LRP6 (т.e., "substrate competition model" по Wu et al.,2009). Хотя имеются данные, которые несовместимы с этой моделью (see discussion in Wu et al.,2009), и др. находки, что фосфорилированный PPPSPXS пептид, по-видимому, является генеральным ингибитором активности GSK3 (Piao et al.,2008), "substrate competition mechanism" может позволить тонкое локальное ингибирование активности GSK3 в отношении β-catenin's N-конца. Этот механизм так же может позволять активность GSK3 в отношении др. мишеней в комплексе, подобных LRP, или важных клеточных мишеней (напр., glycogen synthase). Др. словами этот механизм может объяснить парадокс GSK's дуальной позитивной и негативной ролей в передаче сигналов Wnt. Др. важным значением этой модели является то, что если происходит Wnt-обусловленное ингибирование фосфорилирования β-catenin N-конца исключительно в рецепторном комплексе, то сигнальная форма β-catenin (discussed in greater detail below) может генерироаться вблизи этого комплекса (Hendriksen et al.,2008). Это Wnt-зависимое рекрутирование сигнальной формы β-catenin на мембрану может иметь значение для понимания, что некоторые более новые, signal-promoting фосфорилирования β-catenin могут быть благоприобретены (Hino et al.,2005; Fang et al.,2007; Wu et al.,2008). N-Terminally Unphosphorylated β-catenin and Signaling Поскольку накопление цитозольного β-catenin часто является прекрасным индикатором сигнальной активности Wnt/β-catenin, то исследования, показывающие, что уровни цитозольного β-catenin белка сами по себе не могут полностью объяснить активацию транскрипции β-catenin/TCF (Guger and Gumbiner,2000). С помощью получения моноклональных антител, которые отобраны, чтобы распознавать пептид, соответствующий β-catenin (аминокислотным остаткам 36-44), специфически, когда T41 и S37 не фосфорилированы (8E7, Upstate Biotechnology/Millipore; van Noort et al.,2002) было чётко продемонстрировано, что передача сигналов Wnt/β-catenin обеспечивается посредством молекулярных форм β-catenin, которые сохраняют не фосфорилированными остатки 37 и 41. Т.о., форма β-catenin, распознаваемая моноклональными антителами 8E7, часто обозначается как сигнальная форма β-catenin или Active β-catenin (ABC). Необходимо отметить, однако, что ABC может также легко определяться на cadherin-контактах (Hendriksen et al.,2008; Maher et al.,2009), это означает, что присутствие ABC в клеточных лизатах само по себе не отражает передачи сигналов. Более того, необходимо прояснить, что сходным образом названные моноклональные антитела, 8E4, были некорректно представлены как антитела, которые также распознают β-catenin "не фосфорилированный" по N-терминальным GSK сайтам, и как недавно было показано, распознают в β-catenin совершенно иной epitope (van Noort et al.,2007). Ясно, что гипофосфорилирование N-terminal GSK сайтов в β-catenin составляет форму, которая прирожденно более активна в передаче сигналов (Guger and Gumbiner,2000; Staal et al.,2002). Противодействует ли фосфорилирование по этим остаткам передаче сигналов β-catenin на уровне накопления в ядре (Staal et al.,2002; van Noort et al.,2002), доступу к Lef/Tcf-связанным промоторам (Sadot et al.,2002) или альтернативным механизмам, предстоит выяснить. Независимо от точного механизма, эти исследования строго указывают на то, что GSK3-обеспечиваемое фосфорилирование β-catenin может не только индуцировать деградацию, как предполагает стандартная модель, но и также непосредственно влиять на транскрипционную активность. В этой связи недавние исследования показали, что статус фосфорилирования N-конца может динамически регулироваться. Напр., антитела, которые выявляют β-catenin, специфически фосфорилированные по S33, S37 и T41, показывают, что эти фосфорилирования коротко-живущие, даже в присутствии протеосомных ингибиторов, указывая, что этот регион может подвергаться быстрому де-фосфорилированию (Sadot et al.,2002). Недавние доказатеьства подтвердили, что это де-фосфорилирование обеспечивается с помощью генеральной serine/threonine phosphatase, PP2A, и что её доступ к GSK3 сайтам в β-catenin каким-то образом ограничивается с помощью APC (Su et al.,2008). Используя бесклеточную систему для изучения фосфорилирования, убиквитилирования и деградации, Su et al. (2008) показали, что APC защищает зависимую от времени потерю β-catenin phospho-epitopes по S33, S37 и T41 от PP2A. Поскольку β-catenin, фосфорилированнный по этим остаткам представляет собой сайт для распознавания ?-TrCP ubiquitin ligase, то участие APCв деструкции β-catenin может заключаться в его способности оберегать мотив распознавания ?TrCP. Интересно, что подобная защита p33-, p37- и p41-β-catenin от PP2A не наблюдается в отношении распространенных вызывающих рак мутантов APC, это согласуется с высокими уровнями N-терминального unphospho-β-catenin при этих раках. Учитывая недавние доказательства, что APC может позитивно влиять на передачу сигналов β-catenin в определенных контекстах (Takacs et al.,2008), было бы интересно понять, может ли это проявляться в результате способности APC динамически регулировать N-терминальное фосфорилирование β-catenin. Kinase Regulation of β-catenin Flux Through the Axin-Scaffold Phospho-Destruction Complex Рекрутирование и утекание β-catenin посредством Axin/APC деструкционного комплекса, по-видимому, регулируется с помощью серии упорядоченных событий фосфорилирования. Понимание такого "flux" базируется на оценке структуры β-catenin. β-catenin принадлежит семейству белков armadillo, которое характеризуется центральным доменом. состоящим из повторяющихся 42 аминокислотных мотивов, наз. "arm repeat." Эти повторы были первоначально идентифицированы в Drosophila β-catenin ортологе, Armadillo (Riggleman et al.,1989). Рентгеновский кристаллографический анализ центрального домена armadillo из β-catenin показал, что его 12 arm repeats формируют суперспираль из спиралей, которые создают длинную, позитивно заряженную борозду(Huber et al.,1997). Интересно, что эти позитивные заряды являются критическими для связывания β-catenin со многими из его негативно заряженных лигандов, таких как cadherin adhesion receptor, Axin и компоненты аппарата деградации APC, или с Tcf ДНК связывающими факторами (Graham et al.,2000; von Kries et al.,2000; Huber and Weis,2001; Xing et al.,2003). Важной темой становится то, что фосфорилирование этих партнёров по связыванию вносит дополнительные негативные заряды, которые улучшают взаимодействия с β-catenin's позитивно заряженной борозодой, в результате усиливается сродство связывания (rev. Daugherty and Gottardi,2007). Эта структурная информация сообщает, что известно о фосфорилировании внутри комплекса Axin-каркас. Определенно, фосфорилирование Axin с помощью CK1 и GSK3 повышает связывание Axin с β-catenin (Jho et al.,1999; Willert et al.,1999; Luo et al.,2007), делая N-терминальную область β-catenin более эффективным субстратом для CK1? и GSK3 (Dajani et al.,2003). Axin также способствует фосфорилированию APC с помощью CK1? и GSK3 (Rubinfeld et al.,1996,2001), повышая сродство APC к β-catenin (Ha et al.,2004). Поскольку phospho-APC не может конкурировать с phospho-Axin за связывание β-catenin, считается, что хорошо скоординированные фосфорилирования внутри Axin-APC комплекса (Axin сначала, затем APC), контролируют направленный ток β-catenin через этот комплекс (Ha et al.,2004). Как только β-catenin оказывается связанным с APC, APC гарантирует доставку N-терминально фосфорилированного β-catenin (pS33 и S37) на ?-TrCP ubiquitin ligase и деструкцию с помощью протеосом (Su et al.,2008). Hipk Can Promote β-catenin Stabilization and Target Gene Expression Homeodomain-interacting protein serine/threonine kinases (Hipks), как недавно было установлено, играют роль в регуляции передачи сигналов Wnt. Изучение Drosophila Hipk, мышиной Hipk2 и Xenopus Hipk1 выявило kinase-зависимые эффекты на экспрессию генов мишеней для Wnt (Lee et al.,2009; Louie et al.,2009). Drosophila Hipk способствует стабилизации Armadillo как in vitro, так и in vivo уменьшение hipk ведет к снижению уровней Arm. Повышенная экспрессия Hipk и Hipk2 способствует накоплению β-catenin и увеличивает экспрессию генов мишеней для Wnt in vitro и in vivo. В исследованиях на Xenopus модуляция Hipk1 может как способствовать, так и противодействовать экспрессии генов мишеней для Wnt контекст-зависимым образом (Louie et al.,2009). Эффект Hipk/Hipk2 на экспрессию Tcf-зависимого гена и стабилизацию Arm зависит от интактного киназного домена. Hipk может ассоциировать с Arm и Tcf и может фосфорилировать Arm по N и C концам, хотя точные места неё не определены (Lee et al.,2009). Хотя функциональное значение этой модификации пока не определено, ясно, что Hipk/Hipk2 действуют, чтобы способствовать стабилизации Arm. Hipk может облегчать взаимодействия между Arm и его транскрипционными кофакторами, т.к. было показано,что Hipk2 фосфорилирование влияет на регуляцию генов путем модификации состава различных транскрипционных комплексов (rev. Calzado et al.,2007). Hipk может также усиливать образование β-catenin/Tcf транскрипционного комплекса путем индукции конформационных изменений и/или снижения сродства возможных ингибиторов β-catenin посредством фосфорилирования β-catenin. Роль Hipks в передаче сигналов Wnt, по-видимому, сложная, т.к. члены семейства, как было установлено, обладают молекулярными взаимодействиями с некоторыми белками, ассоциировнными с β-catenin. Xenopus Hipk1 был идентифицирован с помощью двугибридного скрининга на Dsh-взаимодействующих партнеров, и затем было показано, что он также соединяется с Tcf3 (Louie et al.,2009). Некоторые исследования установили физическую связь между мышиными Hipk2 и Axin (Rui et al.,2004; Li et al.,2007). Можно предполагать, что Hipks могут взаимодействовать с деструкционными комплексами и предупреждать или фосфорилирование с помощью GSK3 или CKI, или что Hipk белки могут действовать, блокируя высвобождение из базирующихся на Axin деструкционных комплексов и последующую протеосомную деградацию. β-catenin Phosphorylations That Enhance Signaling Activity Хотя N-терминальные CK1/GSK3-сайты фосфорилирования в β-catenin определены лучше всего, недавние исследования выявили, что др. фосфорилирования вносят позитивный вклад в активности передачи сигналов β-catenin (Fig. 2). Напр., фосфорилирование S675 с помощью PKA может усиливать транскрипционную активность, β-catenin, способствуя стабильности β-catenin (Hino et al.,2005) и ассоциации с Creb Binding Protein (CBP) (Taurin et al.,2006). Последняя находка согласуется с предыдущими исследованиями по картированию доменов, которые поместили S675 в область транскрипционного активатора β-catenin (Hecht et al.,1999). Влияет ли и как эта область на протекание β-catenin через деструктивный комплекс, предстоит только выяснить. Более того, поскольку канонические Wnts не обнаруживаются в целом как активирующие PKA, то фосфорилирование S675 скорее всего обеспечивается вышестоящими сигналами, которые "cross-talk" с передачей сигналов β-catenin в этом сайте. Фосфорилирование β-catenin по S552 с помощью AKT , как было установлено, также повышает уровни белка β-catenin и ядерную передачу сигналов с помощью стандартных репортерных методов (Tian et al.,2004; Fang et al.,2007), хотя точный механизм остаётся неясным. Наконец, serines 191 и 605 недавно были идентифицированы как Rac-активируемые JNK2 сайты, а мутации этих остатков, по-видимому, снижают накопление в ядре β-catenin в линии стромальных клеток, производных костного мозга мыши, ST2 (Wu et al.,2008). Является ли 'jn механизм универсальным свойством активации пути Wnt или играет более выдающуюся роль в клетках ST2 предстоит определить. Учитывая строгие доказательства того, что ядерно/цитоплазматическое распределение β-catenin в основном детерминируется путём доступности ядерных в противовес цитоплазматическим партнерам по связыванию (Krieghoff et al.,2006), важно понять, могут ли эти сайты регулировать импорт в ядро per se или затрагивают связывание с локализованными в цитоплазме β-catenin лигандами. Phosphorylation of Tcf/Lef by Nlk and Casein Kinases В последнюю декаду было установлено, что Nemo-like kinase (Nlk) семейство протеин киназ играет роль в нескольких Wnt-регулируемых процессах (Ishitani et al.,1999,2003; Meneghini et al.,1999; Rocheleau et al.,1999; Shin et al.,1999; Behrens,2000; Golan et al.,2004; Kanei-Ishii et al.,2004; Thorpe and Moon,2004; Zeng and Verheyen,2004). Nlk ингибирует Wnt-зависимую экспрессию генов на уровне β-catenin/TCF транскрипционного комплекса (Ishitani et al.,1999; Rocheleau et al.,1999; Shin et al.,1999). У позвоночных, Nlk фосфорилирует Tcf4 человека по двум сайтам в его центральном домене, T178 и T189 (и соотв. сайтам T155 и S166 человеческого Lef-1), и ингибирует ДНК-связывающую способность Tcf/β-catenin комплекса (Ishitani et al.,1999,2003; Fig. 5). Эктопическая экспрессия Nlk у Xenopus может блокировать ось дупликации, индуцируемую с помощью β-catenin, но не с помощью экспрессии Tcf мишеней, демонстрируя, что Nlk действует на уровне Tcf/β-catenin (Ishitani et al.,1999; Hyodo-Miura et al.,2002). Доказательства, что передача сигналов Wg у мух индуцирует экспрессию Nemo указывают на то, что Nlk является регулятором негативной обратной связи транскрипции β-catenin/TCF (Zeng and Verheyen,2004). Figure 5. Phosphorylation sites on Lef-1. Lef/Tcf family members can be phosphorylated by Nlk, CKI, and CK2. CK2 phosphorylates human Lef-1 at residues S42 and S61 within the β-catenin binding domain (β-cat BD). Nlk can phosphorylate Lef-1 at residues T155 and S166, as well as in the corresponding T178 and T189 in Tcf4. The HMG DNA-binding domain (DNAB) is at the C-terminus of the protein. Генетический анализ у Caenorhabditis elegans показал, что Nlk гомолог, Lit-1, контролирует полярность и выбор клеточных судеб, два процесса, регулируемые самостоятельными Wnt путями (Kaletta et al.,1997; Ishitani et al.,1999; Meneghini et al.,1999; Rocheleau et al.,1999). Наиболее хорошо изучена роль lit-1 в продвижении ядерного экспорта Tcf Pop-1 червей во время асимметричных клеточных делений. В этом варианте пути Wnt Lit-1 нуждается в Wrm-1, гомологе β-catenin, чтобы активировать Lit-1/Nlk, это в конечном итоге приводит к ингибированию Pop-1 и последующей активации генной экспрессии (Rocheleau et al.,1999; Lo et al.,2004). Такая роль Nlk в преодолении Tcf-обусловленной репрессии также была описана у рыбок данио (Thorpe and Moon,2004). Наконец, необходимо подчеркнуть, что Lef/Tcfsтакже, по-видимому, является субстратом для различных общих киназ. В частности, фосфорилирование Tcf3 с помощью CK1 усиливает, тогда как, с помощью GSK ингибирует связывание Tcf3 с β-catenin (Lee et al.,2001). Более того, фосфорилирование человеческой Lef-1 с помощью CK2 по S42 и S61 усиливает сродство β-catenin к Lef-связаным хроматинизированным матрицам и усиливает транскрипцию генов (Wang and Jones,2006). Парадоксально, др. группа картировала мышиный остаток S40 (соотв. человеческому S42) в качестве сайта мишени для CKI? фосфорилирования, участвующий в разрушении β-catenin-Lef-1 комплекса (Hammerlein et al.,2005). Т.о., локальная модуляция киназ на Lef/Tcf-регулируемых промоторах может влиять на ген-специфическое рекрутирование и активацию транскрипции β-catenin. FUTURE DIRECTIONS Overall the regulatory phosphorylation events described in this review act together at multiple steps in the pathway to ensure a tightly regulated and precise level of Wnt signaling. The developmental and pathological consequences of misregulation of Wnt are well known (reviewed in Clevers,2006). Likely as a consequence, several safeguards have evolved to fine-tune the activities of pathway components, most notably the receptor associated complex and the β-catenin/Tcf nuclear complex. Future studies will surely uncover further refinements of the pathway, as well as uncover tissue- and organism-specific modulators.

WNT/β-catenin signaling

Эволюционно законсервированный Wnt/Wingless (Wg) сигнальный путь участвует в различных биологических процессах, необходимых для эмбрионального развития и гомеостаза взрослых, включая детерминацию, пролиферацию, миграцию и дифференцировку (rev. Clevers,2006; Cadigan,2008). Wnts являются секретируемыми внеклеточными белками, которые запускают широкий круг клеточных реакций в ответ на связывание рецептором и активацию. Большинство организмов содержит множественные Wnt гены, которые инициируют разные межклеточные пути, а именно, канонический Wnt/β-catenin каскад, planar cell polarity путь или Wnt/calcium путь. Остановимся на регуляции компонентов канонического Wnt пути (Table 1; see also The Wnt Homepage).

 
Table 1. Wnt Pathway Components and Regulators 


Mouse/Human        Drosophila              C. elegans 


Wnt                            Wingless (Wg)        Wnt
Frizzled (Fz)             Frizzled (Fz)        Frizzled (Fz)
LRP5/6                          Arrow                  LRP5/6
Dishevelled (Dvl)    Dishevelled (Dsh)     Mig-5
GSK3                              Zw3                        Gsk-3
CK1                              Gilgamesh               Kin-19
Axin                                    Axin                   Pry-1
APC                                   APC                      Apr-1
β-catenin     Armadillo (Arm)        Bar-1, Sys-1, Wrm-1, Hmp-2
Tcf/Lef                       dTcf/Pangolin        Pop-1
Nlk                                     Nemo                  Lit-1
Hipk2                                  Hipk

Члены семейства Wnt законсервированы в царстве животных и необходимы во время роста, формирования паттерна тканей и гомеостаза. Кроме того, несоответствующая активация экспрессии Wnt-зависимых генов у млекопитающих ведет к многочисленным формам рака, особенно наследственных и спорадических форм рака толстой кишки (Kinzler et al.,1991; Nishisho et al.,1991).

Каноническая передача сигналов Wnt контролирует клеточные судьбы путем регуляции экспрессии генов (rev.Cadigan and Nusse,1997). Wnts инициируют канонический путь путём связывания Frizzled (Fz) и LRP5/6 корецепторов (Bhanot et al.,1996; Fig. 1). Стимуляция рецепторного комплекса в конечном итоге ведет к формированию ядерного транскрипционного комплекса, который содержит ДНК-связывающий фактор, известный как lymphocyte enhancer factor (Lef)/T-cell factor (Tcf), и дуальный сигнальный/адгезивный белок, β-catenin. В этом комплексе, β-catenin служит в качестве обязательного коактиватора благодаря своей способности рекрутировать энзимы, такие как CBP, который способствует ремоделированию хроматина и транскрипционной инициации/элонгации (rev. Willert and Jones,2006). Сложная серия молекулярных событий необходима, чтобы генерировать этот транскрипционный комплекс. Центральный аспект передачи сигналов Wnt связан с ингибированием механизма конституитивной деградации, который служит для удержания цитозольного "signaling" пула β-catenin на низких уровнях. Как результат цитозольный β-catenin накапливается и вступает в ядро, чтобы взаимодействовать с семейством транскрипционных факторов Tcf/Lef для обеспечения целенаправленной экспрессии генов мишеней (rev. Behrens et al.,1996; Molenaar et al.,1996; Mosimann et al.,2009). В отсутствие передачи сигналов Wnt цитозольный β-catenin быстро деградирует посредством ubiquitin-proteosome системы. Устранение β-catenin из Tcf/DNA комплексов позволяет транскрипционному корепрессору Groucho находить Tcfs и репрессировать транскрипцию Wnt мишеней (Cavallo et al.,1998; Roose et al.,1998).

Figure 1. Wnt/β-catenin signaling pathway. A: In the absence of Wnt ligand, cytoplasmic b-catenin is targeted for destruction by the Axin-scaffolded protein complex containing Axin, APC, GSK3, and CK1. Association of DNA-bound Tcf with Gro and other transcriptional corepressors inhibits Wnt target genes. B: Upon ligand binding, the destruction complex is inhibited and cytoplasmic β-catenin accumulates and enters the nucleus where it can activate gene expression through Tcf and CBP binding.

Множественные ступени Wnt пути, белковые активности, связывающие свойства и стабильность регулируются посредством разных событий фосфорилирования. Повсеместные киназы, CKI и GSK3, играют множественные и оппозитные роли в контроле передачи сигналов Wnt, указывая тем самым, что способ, с помощью которого эти киназы образуют каркасы в клетке может быть критическим для понимания передачи сигналов Wnt и её регуляции. Возникает понимание того, как некоторые киназы и/или события фосфорилирования служат для модуляции или "тонкой настройки" передачи сигналов Wnt/β-catenin. Понимание такой тонкой настройки может быть критическим для объяснения того, как потеря такой точной регуляции может быть критической для объяснения того, как высоко консервативные пути могут вносить вклад в такое разнообразие тканевых структур и как потеря такой точной регулировки вносит вклад во всё растущий список болезней человека (rev. Chien and Moon,2007).

Phosphorylation-Dependent Destruction of β-catenin by an Axin-Scaffold Complex

Накопление в цитозоле и ядре β-catenin является одним из самых ранних, универсальным показателем активации Wnt (Noordermeer et al.,1992). Поскольку избыток β-catenin наблюдается в некоторых раковых опухолях, поэтому ранние исследования были сконцентрирована на молекулярных компонентах, которые контролируют накопление в цитозоле β-catenin. Т.к. этот аспект регуляции β-catenin сегодня хорошо известен, мы отметим только ключевые ступени (Wodarz and Nusse,1998; Barker and Clevers,2000; Logan and Nusse,2004; Clevers,2006).

N-конец цитозольного β-catenin постоянно фосфорилируется с помощью механизма dual-kinase, координируемый с помощью каркасного белка Axin (Fig. 2). Axin имеет сайты связывания β-catenin, CK1, GSK3, а также для др. факторов, необходимых для Wnt-зависимых сигнальных событий (Luo and Lin,2004). Члены семейства CK1 (including ?, ? и ?) фосфорилируют β-catenin по серину 45. Это первичное фосфорилирование необходимо для последующий фосфорилирований с помощью GSK3 по остаткам 41, 37, и 33 (Yost et al.,1996; Liu et al.,2002). Хотя большинство исследований концентрируется на GSK3?, сегодня хорошо известно, что GSK3? и ? полностью перекрываются (Doble et al.,2007). Поэтому мы будем обозначать членов семейство просто как GSK3, пока не нужна спецификация. β-catenin, который фосфорилирован ко остаткам 37 и 33 в конечном итоге распознается с помощью ?-TrCP E3 ubiquitin-ligase комплекса, убиквитинилируется и быстро деградирует с помощью 26S протеосом (Hart et al.,1999). Продукт гена опухолевого супрессора APC также является партнером по связыванию Axin и, как полагают, устраняет N-терминально фосфорилированный β-catenin из Axin комплекса, для переноса на аппарат деградации (Xing et al.,2003). Мутации в APC, Axin или в N-терминальных сайтах фосфорилирования β-catenin обнаруживаются в множественных типах раковых опухолей человека, где эти мутации поднимают посттранскрипционную стабильность и передачу сигналов β-catenin (Korinek et al.,1997; Morin et al.,1997; Rubinfeld et al.,1997). Т.о., зависимая от фосфорилирования деградация β-catenin давно уже рассматривается как ключевая ступень в выключении передачи сигналов β-catenin.

Figure 2. Phosphorylation sites on β-catenin. β-catenin is phosphorylated on its N-terminus by GSK3 (shown in orange) and CKI (shown in orange). These phosphorylations target β-catenin for ubiquitination and subsequent proteasomal degradation. β-catenin is also phosphorylated on the indicated sites by the diverse kinases PKA, AKT, and JNK2. These events are believed to promote β-catenin activity.

Как Wnts ингибируют этот конституитивный процесс деградации. Недавние работы были сконцентрированы на молекулярных последствиях событий, которые происходят после связывания лигандов на клеточной поверхности. Хотя некоторые вопросы остаются нерешенными, очевидно, что рецепторный комплекс играет важную роль в сборке платформы, которая в конечном итоге служит для инактивации Axin-scaffold phospho-destruction комплекса.

LRP5/6 Phosphorylation Promotes Axin Docking and Pathway Activity

Wnt лиганды занимают рецепторный комплекс, состоящий из Frizzled serpentine рецепторного белка и LRP5/6 корецептора. LRPs являются единожды пронизывающими трансмембранными белками, принадлежащими к семейству low density lipoprotein-related (LRP) рецепторов, представленных у позвоночных LRP5 и LRP6 и Arrow у Drosophila (Pinson et al.,2000; Tamai et al.,2000; Wehrli et al.,2000). Поскольку форсированное образование кластеров Fz и LRP достаточно, чтобы активировать передачу сигналов β-catenin независимо от Wnts, то стимулирование лигандами, как полагают, способствует сборке более высокого порядка LRP5/6 корецепторных комплексов, которые в свою очередь управляют передачей сигналов (Tolwinski et al.,2003; Cong et al.,2004b; Holmen et al.,2005; Liu et al.,2005).

После Wnt стимуляции, LRP6 фосфорилируется и рекрутирует Axin на плазматическую мембрану, это совпадает с ингибированием комплекса, разрушающего β-catenin (Tamai et al.,2004). Экспрессия LRP6, лишенного цитозольного домена, приводит к доминантно-негативному эффекту на передачу сигналов Wnt (Tamai et al.,2000), тогда как экспрессия конструкции, лишенной внеклеточного домена постоянно активирует активность пути (Tamai et al.,2004). Исходя из этих наблюдений некоторые группы высказали предположение, что внеклеточный домен осуществляет аутоингибирующий эффект, который уменьшается в ответ на стимуляцию с помощью Wnt (Mao et al.,2001; Liu et al.,2003).

Tamai et al. (2004) нашли, что богатый пролином PPPSP мотив, присутствует в 5 копиях (represented as A-E; Fig. 3) во внутриклеточно домене LRP6 и функционально необходим для передачи сигналов Wnt (Tamai et al.,2004). Эти мотивы законсервированы от мух до позвоночных в качестве PPP(S/T)P остатков. Мутации пятого серинового остатка LRP6 в аланин делает белок неактивным в передаче сигналов β-catenin. Мнение, что эти мотивы представляют собой сайты мишени для протеин киназ, было подтверждено экспериментально, когда было установлено, что PPPSP мотивы фосфорилируются. Будучи фосфорилированными, эти сайты делают возможным присоединение Axin. В самом деле, Axin не присоединяется к тем сайтам LRP6, которые мутантны. Поскольку ранее было показано, что передача сигналов Wnt способствует взаимодействию между Axin и LRP5/6, предложена модель, согласно которой Wnt запускает фосфорилирование LRP6, чтобы индуцировать Axin-связывающий сайт. Tamai et al. (2004) получили phospho-специфические антитела (Ab1490), которые распознают серин в первом PPPSP повторе (serine 1490). Используя эти антитела, было продемонстрировано, что стимуляция клеток с помощью Wnt-кондиционированной среды вызывает быструю выраженную фосфориляцию PPPSP остатков в LRP6.

Figure 3. Phosphorylation sites in the cytoplasmic domain of LRP6. A: The cytoplasmic domain of LRP6 is shown, indicating the sites of GSK3 (red) and CK1? (orange) phosphorylation. Five clusters of GSK3 sites followed by CKI? sites are shown as blue boxes labeled A-E. TM, transmembrane domain. B: The amino acid sequence of LRP6 repeat A (adapted from Davidson et al.,2005). Cluster 1 contains the T1479 CKI? target site and Cluster 2 follows the GSK3 site and contains a second CKI? site (T1493).

Помимо основной роли как компонента деструкционного комплекса, который направляет β-catenin на деградацию, glycogen synthase kinase 3 (GSK3), как было установлено, участвует в фосфорилировании LRP6 по PPPSP (Zeng et al.,2005). Избыточная экспрессия GSK3 in vivo способствует фосфорилированию LRP6, т.к. GSK3 ингибиторы, такие как LiCl, предупреждают фосфорилирование. LRP6 не фосфорилируется в фибробластов эмбрионов мышей, обладающих делециями как Gsk3?, так и Gsk3? генов (Zeng et al.,2005).

Чтобы исследовать очевидное расхождение между хорошо известной ролью GSK3 как ингибитора передачи сигналов Wnt и вновь идентифицированной ролью, стимуляции взаимодействий LRP6-Axin, Zeng et al. (2005) получили связанную с мембраной GSK3?. Как и ожидалось эта форма GSK3? может всё ещё фосфорилировать LRP6 на плазматической мембране. Эта ассоциированная с мембраной GSK3 неспособна участвовать в хорошо известном ингибировании β-catenin на уровне комплекса цитоплазматической деструкции. Эти наблюдения строго свидетельствуют о двух противоположных ролях GSK3 в Wnt пути, исходя из компартментализации GSK3. Т.о., близость GSK3 к плазматической мембране играет позитивную роль в передаче сигналов Wnt.

Поскольку GSK3 обычно кооперирует с др. киназами, предполагается участие второй киназы. В 2005, в двух исследованиях было показано, что LRP5/6 фосфорилируются с помощью CK1 (Davidson et al.,2005; Zeng et al.,2005; Fig. 3). Детальный обзор о роли членов семейства CK1 в передаче сигналов Wnt читатель найдет у Price (2006). Два сайта были идентифицированы в качестве сайтов мишеней для CK1? (Fig. 3), один наз. T1479, что расположен выше сайта мишени GSK3 (Davidson et al.,2005), тогда как второй T1493 находится на три аминокислоты ниже для GSK3 сайта мишени PPPSP (Zeng et al.,2005). Группа Niehrs идентифицировала, что член семейства CK1? является первичной киназой, участвующей в обеспечении фосфорилирования и, по-видимому, необходима для T1479 и T1493 сайтов (Davidson et al.,2005). CK1? является необычным членом семейства CK1, поскольку она закреплена на мембране посредством сайтов palmitoylation на её С-конце. Напротив, цитоплазматические члены семейства, такие как CK1? не оказывают эффекта на фосфорилирование LRP6 (Davidson et al.,2005), поскольку они не влияют на активность Dvl (see below; Peters et al.,1999). Экспрессия доминант-негативной CK1? в HEK293T клетках и у эмбрионов Xenopus специфически блокирует фосфорилирование LRP6 и передачу сигналов Wnt. У Drosophila CK1? , наз. Gilgamesh (Gish) может действовать синергично с LRP6/Arrow, тогда как RNAi-вызываемый нокдаун блокирует передачу сигналов Wg (Davidson et al.,2005). Phospho-специфические антитела, направленные против треонина в наиболее C-терминальном CKI? сайте (Tp1479), были использованы для демонстрации, что CK1? непосредственно фосфорилирует LRP6. CK1? фосфорилирование является важным для рекрутирования Axin с помощью LRP6. Эти наблюдения, что CK1 играет ключевую роль в фосфорилировании кластера A, были расширены MacDonald с коллегами, когда они показали, что все 5 GSK3 мотивов (PPPSPxS) сопровождаются CK1 консенсусными сайтами (PPPSPxS). Все 5 dually фосфорилированных мотива предоставляют оптимальные сайты для связывания Axin (MacDonald et al.,2008).

Хотя имеется генеральный согласие, что фосфорилирование LRP6 важно для передачи сигналов Wnt, то молекулярные детали всё ещё спорны. В одной модели фосфорилирование с помощью GSK3 является первичным Wnt индуцируемым событием, которое затем предоставляет первую ступень, позволяющая последующее CK1 фосфорилирование (Zeng et al.,2008), тогда как вторая модель предполагает, что фосфорилирование с помощью GSK3 является конституитивным и что передача сигналов Wnt способствует только CK1?-обусловленному фосфорилированию (Bilic et al.,2007). Последняя модель базируется на находках, что передача сигналов Wnt не усиливает фосфорилирование S1490 в GSK3 консенсусном сайте и, более того, что S1490 является постоянно фосфорилированным (Davidson et al.,2005). Напротив, CK1? сайт фосфорилируется специфически в ответ на Wnt стимуляцию и может не нуждаться в priming с помощью GSK3. Фосфорилирование с помощью GSK3 в целом нуждается в primed субстрате, как это видно в отношении фосфорилирования β-catenin по S45 с помощью CKI?. Напротив, Davidson et al. (2005) полагают, что фосфорилирование обоих CK1 сайтов необходимо для интактного PPPSP сайта, указывая тем самым, что GSK3 primes LRP6. Поскольку исследования не разрешили этот вопрос, поэтому остаётся посмотреть, каков точный механизм, последовательность и потребность в фосфорилировании LRP6.

LRP6 Signalosome Assembly at the Membrane

Помимо способствования фосфорилированию членов семейства LRP, Wnt, по-видимому, стимулирует сборку макромолекулярных комплексов в ответ на присоединение лиганда (Fig. 4). Эти комплексы рекрутируют цитозольные белки на мембрану и могут способствовать фосфорилированию LRP в конечном результате. Используя live imaging клеток позвоночных, использующих экспрессию флюоресцентно нагруженных Axin и LRP6, Bilic et al. (2007) продемонстрировали, что передача сигналов Wnt индуцирует ассоциированные с плазматической мембраной LRP6 агрегаты. В нестимулированных клетках, Axin локализуется в внутриклеточных точках, тогда как LRP6 униформно окрашивает клеточную мембрану. Wnt стимуляция приводит к быстрому формированию LRP6 точек, обозначаемых как "LRP6 signalosomes." Это событие сопровождается рекрутированием Axin на агрегаты. Tp1479 антитела были использованы, чтобы показать, что точки являются обогащенными CK1?-обеспеченными фосфорилированными LRP6 и что эти структуры также содержат Fz8, Dvl2, GSK и Axin (Bilic et al.,2007). Интересно, что T1479 остаток не законсервирован в Drosophila Arrow, так что необходимо посмотреть, является ли этот механизм эволюционно законсервированным. Dvl, как предполагается, обеспечивает аггрегацию и фосфорилирование LRP6, исходя из находок, что нокдаун dsh и dvl в клетках Drosophila и позвоночных ингибирует Wnt-индуцированное фосфорилирование LRP6 по T1479. В этой модели Dvl д. играть главную роль в сборке LRP6 сигналосом в ответ на передачу сигналов Wnt и д. стимулировать фосфорилирование LRP6 и рекрутирование Axin, сопровождаемое стабилизацией β-catenin. В подтверждение этого клеточные линии, в которых три Dvl белка позвоночных были одновременно редуцированы с помощью нокаута (Dvl1?/?;Dvl2?/?) и shRNA-обусловленного knockdown (Dvl3), показали редуцированные уровни Wnt-индуцированного фосфорилирования LRP6 (Zeng et al.,2008).

Figure 4. LRP6 signalosome assembly. Wnt ligand binding triggers assembly of LRP6-associated complexes termed signalosomes. Ligand association results in receptor association and recruitment of Dvl. Subsequently, GSK3 and Axin are recruited to the complex, along with membrane associated CKI?, and LRP6 is phosphorylated.

Wnt Pathway Activation Triggers Phosphorylation of Dishevelled Proteins

Семейство Dishevelled белков (Dvl1-3 у позвоночных и Dsh у мцх и рыбок данио) является законсервированным позитивным регулятором канонической передачи сигналов. Модулярный белок также играет ключевую роль в неканоническом PCP пути (rev. Wallingford and Habas,2005). Dishevelled действует эпистатически ниже Fz/LRP рецепторного комплекса. Доказательства этому получены в наблюдении, что избыточная экспрессия Dsh может активировать передачу сигналов β-catenin у Drosophila мутантов Arrow (Wehrli et al.,2000), а постоянно активный слитый белок Fz2-Arrow не может передавать сигналы на dsh мутантном фоне (Tolwinski et al.,2003). Возможный механизм, с помощью которого Dsh функция становится средством ингибирования Axin (Fagotto et al.,1999; Kishida et al.,1999; Li et al.,1999; Smalley et al.,1999). Транслокация Dvl на мембрану и последующее рекрутирование партнеров по связыванию ведет к разрушению комплекса и стабилизации β-catenin.

После Wnt активации белки Dvl ассоциируют с Fz и оказываются фосфорилированными (Yanagawa et al.,1995; Willert et al.,1997; Lee et al.,1999; Rothbacher et al.,2000). Несколько киназ, как предполагается, фосфорилирут Dvl, включая CK1?, Casein kinase 2 и PAR1 (Willert et al.,1997; Sun et al.,2001; Cong et al.,2004a; Ossipova et al.,2005). Фосфорилирование белков Dvl, как полагают, является важной позитивной ступенью пути активации, точный механизм которой остается неизвестным.

Lipid Kinases: PtdIns (4,5)P2 and Wnt Receptor Complex Activation

В недавнем исследовании установлена потребность в двух хорошо известных lipid kinases для этих ранних ступеней передачи сигналов Wnt. Используя библиотеку siRNA киназ человека, Pan et al. (2008) осуществляли скрининг в отношении эффектов на накопление Wnt-индуцированного цитозольного β-catenin с помощью энзим-сцепленного immunosor bent подхода и фосфорилирования Lrp6 по S1490 (сайту GSK3 ) с помощью immunoblot анализа в HEK293T клетках и идентифицировали PI4KII? и PIP5K1?. Эти две киназы являются компонентами основного пути продукции PtndIns(4,5)P₂ (PIP2) в клетках (Hsuan et al.,1998; Doughman et al.,2003). Подтверждением роли PIP2 в Wnt каскаде является форсированное высвобождение PIP2 в цитозоль клеток, используя систему доставки липосом, хотя этого недостаточно для фосфорилирования LRP6 по S1490, но оно усиливает это фосфорилирование в присутствии Wnt. Более того, Wnt3a может стимулировать формирование PIP2 в клетках, а липосомами-обеспечиваемая доставка PIP2 может обходить потребность в PI5K1?. Механизм активации PIP2, по-видимому, нуждается в Dvl, который активирует PIP5K активность зависимым от дозы способом и ко-иммунопреципитируется с PIP5K в лизатах клеток. Важно. что это физическое взаимодействие нуждается в присутствии Wnt лиганда.

PIP2 участвует в многочисленных процессах, которые используют мембранную динамику (напр., эндоцитоз, экзоцитоз, регуляцию кортикального цитоскелета; Czech,2000). Вообще-то в соответствии со своей генеральной ролью, Wnt3a-индуцированные LRP6 агрегаты, по-видимому, содержат PIP2 и зависят от клеточных уровней PIP2 для их формирования (Pan et al.,2008). Элиминация PIP2 также блокирует рекрутирование Axin на pLRP6. В целом эти данные подтверждают модель, где сигналы Wnt передаются посредством Fz, рекрутируя Dvl, приводя к усилению PIP5K активности. Это вызывает локальные образования PIP2, которые необходимы, но недостаточны для большинства активностей, описанных выше, таких как аггрегация LRP6, фосфорилирование LRP6 по T1479 и S1490, и рекрутирование Axin (Pan et al.,2008). Будущие исследования д. подтвердить эти наблюдения и интегрировать их более полно в известные проксимальные к мембране события в пути Wnt.

LRP Directly Inhibits GSK3 Activity and/or Function During Wnt Signaling

Давно установлено, что фармакологические ингибиторы активности GSK3, такие как LiCl и BIO достаточны, чтобы способствовать стабилизации β-catenin и активировать транскрипцию β-catenin/Tcf (Klein and Melton,1996; Stambolic et al.,1996; Sato et al.,2004). Однако противодействуют ли и как Wnts активности GSK3 остается неясным. Регуляция GSK3 уникальна по нескольким причинам. В отличие от большинства протеин киназ, участвующих в передаче сигналов, она постоянно активна и инактивируется только в ответ на разнообразные сигналы. Круг GSK3 субстратов широк и GSK3 участвует в многочисленных важных клеточных процессах, таких как метаболизм гликогена, передача сигналов инсулина, пролиферация клеток, функция нейронов и передача сигналов Wnt (rev. Rayasam et al.,2009). В пути инсулина активность GSK3 ингибируется с помощью Akt-обеспечиваемого фосфорилирования по S9 с помощью GSK3? и по S21 с помощью GSK3?. Эти сайты независимы от статуса пути Wnt (Ding et al.,2000; McManus et al.,2005). Остаётся мистикой, как фосфорилирование β-catenin с помощью GSK3 ингибируется в ответ на активацию Wnt пути. Недавние исследования предоставили неоспоримые доказательства, что Wnt-активированный LRP6 может ингибировать функцию GSK3 непосредственно (Cselenyi and Lee,2008; Piao et al.,2008; Wu et al.,2009).

Используя методы in vitro, которые восстанавливают фосфорилирование β-catenin по остаткам S33, 37 и 41 (первые два распознаются с помощью E3 ubiquitin ligase, ?-TrCP), эти группы предоставили доказательства, что фосфорилированные LRP6 PPPpSPXpS пептиды непосредственно ингибируют фосфорилирование β-catenin с помощью GSK3 по S33, S37 и T41. На первый взгляд, этот результат не является неожиданностью, поскольку известно, что Axin-каркасный белок также рекрутируется на этот phospho-повтор в LRP (Tamai et al.,2004). Удивительно, однако, что этим phospho-пептидом (PPPpSPXpS)-обусловленное ингибирование фосфорилирования β-catenin может происходить независимо от Axin (Cselenyi and Lee,2008; Wu et al.,2009). Поскольку PPPSPXS пептид сам по себе является GSK3субстратом, эти исследования открыли интересную возможность, что этот регион LRP6 непосредственно конкурирует с N-концом β-catenin за связывание LRP6 (т.e., "substrate competition model" по Wu et al.,2009). Хотя имеются данные, которые несовместимы с этой моделью (see discussion in Wu et al.,2009), и др. находки, что фосфорилированный PPPSPXS пептид, по-видимому, является генеральным ингибитором активности GSK3 (Piao et al.,2008), "substrate competition mechanism" может позволить тонкое локальное ингибирование активности GSK3 в отношении β-catenin's N-конца. Этот механизм так же может позволять активность GSK3 в отношении др. мишеней в комплексе, подобных LRP, или важных клеточных мишеней (напр., glycogen synthase). Др. словами этот механизм может объяснить парадокс GSK's дуальной позитивной и негативной ролей в передаче сигналов Wnt.

Др. важным значением этой модели является то, что если происходит Wnt-обусловленное ингибирование фосфорилирования β-catenin N-конца исключительно в рецепторном комплексе, то сигнальная форма β-catenin (discussed in greater detail below) может генерироаться вблизи этого комплекса (Hendriksen et al.,2008). Это Wnt-зависимое рекрутирование сигнальной формы β-catenin на мембрану может иметь значение для понимания, что некоторые более новые, signal-promoting фосфорилирования β-catenin могут быть благоприобретены (Hino et al.,2005; Fang et al.,2007; Wu et al.,2008).

N-Terminally Unphosphorylated β-catenin and Signaling

Поскольку накопление цитозольного β-catenin часто является прекрасным индикатором сигнальной активности Wnt/β-catenin, то исследования, показывающие, что уровни цитозольного β-catenin белка сами по себе не могут полностью объяснить активацию транскрипции β-catenin/TCF (Guger and Gumbiner,2000). С помощью получения моноклональных антител, которые отобраны, чтобы распознавать пептид, соответствующий β-catenin (аминокислотным остаткам 36-44), специфически, когда T41 и S37 не фосфорилированы (8E7, Upstate Biotechnology/Millipore; van Noort et al.,2002) было чётко продемонстрировано, что передача сигналов Wnt/β-catenin обеспечивается посредством молекулярных форм β-catenin, которые сохраняют не фосфорилированными остатки 37 и 41. Т.о., форма β-catenin, распознаваемая моноклональными антителами 8E7, часто обозначается как сигнальная форма β-catenin или Active β-catenin (ABC). Необходимо отметить, однако, что ABC может также легко определяться на cadherin-контактах (Hendriksen et al.,2008; Maher et al.,2009), это означает, что присутствие ABC в клеточных лизатах само по себе не отражает передачи сигналов. Более того, необходимо прояснить, что сходным образом названные моноклональные антитела, 8E4, были некорректно представлены как антитела, которые также распознают β-catenin "не фосфорилированный" по N-терминальным GSK сайтам, и как недавно было показано, распознают в β-catenin совершенно иной epitope (van Noort et al.,2007). Ясно, что гипофосфорилирование N-terminal GSK сайтов в β-catenin составляет форму, которая прирожденно более активна в передаче сигналов (Guger and Gumbiner,2000; Staal et al.,2002). Противодействует ли фосфорилирование по этим остаткам передаче сигналов β-catenin на уровне накопления в ядре (Staal et al.,2002; van Noort et al.,2002), доступу к Lef/Tcf-связанным промоторам (Sadot et al.,2002) или альтернативным механизмам, предстоит выяснить. Независимо от точного механизма, эти исследования строго указывают на то, что GSK3-обеспечиваемое фосфорилирование β-catenin может не только индуцировать деградацию, как предполагает стандартная модель, но и также непосредственно влиять на транскрипционную активность.

В этой связи недавние исследования показали, что статус фосфорилирования N-конца может динамически регулироваться. Напр., антитела, которые выявляют β-catenin, специфически фосфорилированные по S33, S37 и T41, показывают, что эти фосфорилирования коротко-живущие, даже в присутствии протеосомных ингибиторов, указывая, что этот регион может подвергаться быстрому де-фосфорилированию (Sadot et al.,2002). Недавние доказатеьства подтвердили, что это де-фосфорилирование обеспечивается с помощью генеральной serine/threonine phosphatase, PP2A, и что её доступ к GSK3 сайтам в β-catenin каким-то образом ограничивается с помощью APC (Su et al.,2008). Используя бесклеточную систему для изучения фосфорилирования, убиквитилирования и деградации, Su et al. (2008) показали, что APC защищает зависимую от времени потерю β-catenin phospho-epitopes по S33, S37 и T41 от PP2A. Поскольку β-catenin, фосфорилированнный по этим остаткам представляет собой сайт для распознавания ?-TrCP ubiquitin ligase, то участие APCв деструкции β-catenin может заключаться в его способности оберегать мотив распознавания ?TrCP. Интересно, что подобная защита p33-, p37- и p41-β-catenin от PP2A не наблюдается в отношении распространенных вызывающих рак мутантов APC, это согласуется с высокими уровнями N-терминального unphospho-β-catenin при этих раках. Учитывая недавние доказательства, что APC может позитивно влиять на передачу сигналов β-catenin в определенных контекстах (Takacs et al.,2008), было бы интересно понять, может ли это проявляться в результате способности APC динамически регулировать N-терминальное фосфорилирование β-catenin.

Kinase Regulation of β-catenin Flux Through the Axin-Scaffold Phospho-Destruction Complex

Рекрутирование и утекание β-catenin посредством Axin/APC деструкционного комплекса, по-видимому, регулируется с помощью серии упорядоченных событий фосфорилирования. Понимание такого "flux" базируется на оценке структуры β-catenin. β-catenin принадлежит семейству белков armadillo, которое характеризуется центральным доменом. состоящим из повторяющихся 42 аминокислотных мотивов, наз. "arm repeat." Эти повторы были первоначально идентифицированы в Drosophila β-catenin ортологе, Armadillo (Riggleman et al.,1989). Рентгеновский кристаллографический анализ центрального домена armadillo из β-catenin показал, что его 12 arm repeats формируют суперспираль из спиралей, которые создают длинную, позитивно заряженную борозду(Huber et al.,1997). Интересно, что эти позитивные заряды являются критическими для связывания β-catenin со многими из его негативно заряженных лигандов, таких как cadherin adhesion receptor, Axin и компоненты аппарата деградации APC, или с Tcf ДНК связывающими факторами (Graham et al.,2000; von Kries et al.,2000; Huber and Weis,2001; Xing et al.,2003). Важной темой становится то, что фосфорилирование этих партнёров по связыванию вносит дополнительные негативные заряды, которые улучшают взаимодействия с β-catenin's позитивно заряженной борозодой, в результате усиливается сродство связывания (rev. Daugherty and Gottardi,2007).

Эта структурная информация сообщает, что известно о фосфорилировании внутри комплекса Axin-каркас. Определенно, фосфорилирование Axin с помощью CK1 и GSK3 повышает связывание Axin с β-catenin (Jho et al.,1999; Willert et al.,1999; Luo et al.,2007), делая N-терминальную область β-catenin более эффективным субстратом для CK1? и GSK3 (Dajani et al.,2003). Axin также способствует фосфорилированию APC с помощью CK1? и GSK3 (Rubinfeld et al.,1996,2001), повышая сродство APC к β-catenin (Ha et al.,2004). Поскольку phospho-APC не может конкурировать с phospho-Axin за связывание β-catenin, считается, что хорошо скоординированные фосфорилирования внутри Axin-APC комплекса (Axin сначала, затем APC), контролируют направленный ток β-catenin через этот комплекс (Ha et al.,2004). Как только β-catenin оказывается связанным с APC, APC гарантирует доставку N-терминально фосфорилированного β-catenin (pS33 и S37) на ?-TrCP ubiquitin ligase и деструкцию с помощью протеосом (Su et al.,2008).

Hipk Can Promote β-catenin Stabilization and Target Gene Expression

Homeodomain-interacting protein serine/threonine kinases (Hipks), как недавно было установлено, играют роль в регуляции передачи сигналов Wnt. Изучение Drosophila Hipk, мышиной Hipk2 и Xenopus Hipk1 выявило kinase-зависимые эффекты на экспрессию генов мишеней для Wnt (Lee et al.,2009; Louie et al.,2009). Drosophila Hipk способствует стабилизации Armadillo как in vitro, так и in vivo уменьшение hipk ведет к снижению уровней Arm. Повышенная экспрессия Hipk и Hipk2 способствует накоплению β-catenin и увеличивает экспрессию генов мишеней для Wnt in vitro и in vivo. В исследованиях на Xenopus модуляция Hipk1 может как способствовать, так и противодействовать экспрессии генов мишеней для Wnt контекст-зависимым образом (Louie et al.,2009). Эффект Hipk/Hipk2 на экспрессию Tcf-зависимого гена и стабилизацию Arm зависит от интактного киназного домена. Hipk может ассоциировать с Arm и Tcf и может фосфорилировать Arm по N и C концам, хотя точные места неё не определены (Lee et al.,2009). Хотя функциональное значение этой модификации пока не определено, ясно, что Hipk/Hipk2 действуют, чтобы способствовать стабилизации Arm. Hipk может облегчать взаимодействия между Arm и его транскрипционными кофакторами, т.к. было показано,что Hipk2 фосфорилирование влияет на регуляцию генов путем модификации состава различных транскрипционных комплексов (rev. Calzado et al.,2007). Hipk может также усиливать образование β-catenin/Tcf транскрипционного комплекса путем индукции конформационных изменений и/или снижения сродства возможных ингибиторов β-catenin посредством фосфорилирования β-catenin.

Роль Hipks в передаче сигналов Wnt, по-видимому, сложная, т.к. члены семейства, как было установлено, обладают молекулярными взаимодействиями с некоторыми белками, ассоциировнными с β-catenin. Xenopus Hipk1 был идентифицирован с помощью двугибридного скрининга на Dsh-взаимодействующих партнеров, и затем было показано, что он также соединяется с Tcf3 (Louie et al.,2009). Некоторые исследования установили физическую связь между мышиными Hipk2 и Axin (Rui et al.,2004; Li et al.,2007). Можно предполагать, что Hipks могут взаимодействовать с деструкционными комплексами и предупреждать или фосфорилирование с помощью GSK3 или CKI, или что Hipk белки могут действовать, блокируя высвобождение из базирующихся на Axin деструкционных комплексов и последующую протеосомную деградацию.

β-catenin Phosphorylations That Enhance Signaling Activity

Хотя N-терминальные CK1/GSK3-сайты фосфорилирования в β-catenin определены лучше всего, недавние исследования выявили, что др. фосфорилирования вносят позитивный вклад в активности передачи сигналов β-catenin (Fig. 2). Напр., фосфорилирование S675 с помощью PKA может усиливать транскрипционную активность, β-catenin, способствуя стабильности β-catenin (Hino et al.,2005) и ассоциации с Creb Binding Protein (CBP) (Taurin et al.,2006). Последняя находка согласуется с предыдущими исследованиями по картированию доменов, которые поместили S675 в область транскрипционного активатора β-catenin (Hecht et al.,1999). Влияет ли и как эта область на протекание β-catenin через деструктивный комплекс, предстоит только выяснить. Более того, поскольку канонические Wnts не обнаруживаются в целом как активирующие PKA, то фосфорилирование S675 скорее всего обеспечивается вышестоящими сигналами, которые "cross-talk" с передачей сигналов β-catenin в этом сайте.

Фосфорилирование β-catenin по S552 с помощью AKT , как было установлено, также повышает уровни белка β-catenin и ядерную передачу сигналов с помощью стандартных репортерных методов (Tian et al.,2004; Fang et al.,2007), хотя точный механизм остаётся неясным. Наконец, serines 191 и 605 недавно были идентифицированы как Rac-активируемые JNK2 сайты, а мутации этих остатков, по-видимому, снижают накопление в ядре β-catenin в линии стромальных клеток, производных костного мозга мыши, ST2 (Wu et al.,2008). Является ли 'jn механизм универсальным свойством активации пути Wnt или играет более выдающуюся роль в клетках ST2 предстоит определить. Учитывая строгие доказательства того, что ядерно/цитоплазматическое распределение β-catenin в основном детерминируется путём доступности ядерных в противовес цитоплазматическим партнерам по связыванию (Krieghoff et al.,2006), важно понять, могут ли эти сайты регулировать импорт в ядро per se или затрагивают связывание с локализованными в цитоплазме β-catenin лигандами.

Phosphorylation of Tcf/Lef by Nlk and Casein Kinases

В последнюю декаду было установлено, что Nemo-like kinase (Nlk) семейство протеин киназ играет роль в нескольких Wnt-регулируемых процессах (Ishitani et al.,1999,2003; Meneghini et al.,1999; Rocheleau et al.,1999; Shin et al.,1999; Behrens,2000; Golan et al.,2004; Kanei-Ishii et al.,2004; Thorpe and Moon,2004; Zeng and Verheyen,2004). Nlk ингибирует Wnt-зависимую экспрессию генов на уровне β-catenin/TCF транскрипционного комплекса (Ishitani et al.,1999; Rocheleau et al.,1999; Shin et al.,1999). У позвоночных, Nlk фосфорилирует Tcf4 человека по двум сайтам в его центральном домене, T178 и T189 (и соотв. сайтам T155 и S166 человеческого Lef-1), и ингибирует ДНК-связывающую способность Tcf/β-catenin комплекса (Ishitani et al.,1999,2003; Fig. 5). Эктопическая экспрессия Nlk у Xenopus может блокировать ось дупликации, индуцируемую с помощью β-catenin, но не с помощью экспрессии Tcf мишеней, демонстрируя, что Nlk действует на уровне Tcf/β-catenin (Ishitani et al.,1999; Hyodo-Miura et al.,2002). Доказательства, что передача сигналов Wg у мух индуцирует экспрессию Nemo указывают на то, что Nlk является регулятором негативной обратной связи транскрипции β-catenin/TCF (Zeng and Verheyen,2004).

Figure 5. Phosphorylation sites on Lef-1. Lef/Tcf family members can be phosphorylated by Nlk, CKI, and CK2. CK2 phosphorylates human Lef-1 at residues S42 and S61 within the β-catenin binding domain (β-cat BD). Nlk can phosphorylate Lef-1 at residues T155 and S166, as well as in the corresponding T178 and T189 in Tcf4. The HMG DNA-binding domain (DNAB) is at the C-terminus of the protein.

Генетический анализ у Caenorhabditis elegans показал, что Nlk гомолог, Lit-1, контролирует полярность и выбор клеточных судеб, два процесса, регулируемые самостоятельными Wnt путями (Kaletta et al.,1997; Ishitani et al.,1999; Meneghini et al.,1999; Rocheleau et al.,1999). Наиболее хорошо изучена роль lit-1 в продвижении ядерного экспорта Tcf Pop-1 червей во время асимметричных клеточных делений. В этом варианте пути Wnt Lit-1 нуждается в Wrm-1, гомологе β-catenin, чтобы активировать Lit-1/Nlk, это в конечном итоге приводит к ингибированию Pop-1 и последующей активации генной экспрессии (Rocheleau et al.,1999; Lo et al.,2004). Такая роль Nlk в преодолении Tcf-обусловленной репрессии также была описана у рыбок данио (Thorpe and Moon,2004).

Наконец, необходимо подчеркнуть, что Lef/Tcfsтакже, по-видимому, является субстратом для различных общих киназ. В частности, фосфорилирование Tcf3 с помощью CK1 усиливает, тогда как, с помощью GSK ингибирует связывание Tcf3 с β-catenin (Lee et al.,2001). Более того, фосфорилирование человеческой Lef-1 с помощью CK2 по S42 и S61 усиливает сродство β-catenin к Lef-связаным хроматинизированным матрицам и усиливает транскрипцию генов (Wang and Jones,2006). Парадоксально, др. группа картировала мышиный остаток S40 (соотв. человеческому S42) в качестве сайта мишени для CKI? фосфорилирования, участвующий в разрушении β-catenin-Lef-1 комплекса (Hammerlein et al.,2005). Т.о., локальная модуляция киназ на Lef/Tcf-регулируемых промоторах может влиять на ген-специфическое рекрутирование и активацию транскрипции β-catenin.

FUTURE DIRECTIONS

Overall the regulatory phosphorylation events described in this review act together at multiple steps in the pathway to ensure a tightly regulated and precise level of Wnt signaling. The developmental and pathological consequences of misregulation of Wnt are well known (reviewed in Clevers,2006). Likely as a consequence, several safeguards have evolved to fine-tune the activities of pathway components, most notably the receptor associated complex and the β-catenin/Tcf nuclear complex. Future studies will surely uncover further refinements of the pathway, as well as uncover tissue- and organism-specific modulators.

Regulation of Wnt/β-catenin signaling by protein kinases Esther M. Verheyen, Cara J. Gottardi Developmental Dynamics Volume 239, Issue 1, pages 34–44, January 2010

Regulation of Wnt/β-catenin signaling by protein kinases
Esther M. Verheyen, Cara J. Gottardi
Developmental Dynamics Volume 239, Issue 1, pages 34–44, January 2010